一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药材料技术领域，特别涉及一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铁是人体内含量最高的必需微量元素，广泛分布于机体各个组织器官，参与各项生理反应，是构成代谢和生物过程的重要组成部分，合成输送氧气的血红蛋白和肌红蛋白，在线粒体和各种酶功能中发挥重要作用。当膳食铁摄入受限，体内贮存铁不足或耗尽时，即发生铁缺乏症。铁缺乏症可依严重程度分为三个阶段：铁减少(id)、缺铁性红细胞生成(ide)及缺铁性贫血(ida)。
3.铁营养强化剂发展了三代，第一代是无机酸盐类，如硫酸亚铁、焦磷酸铁等；第二代为有机盐类，如琥珀酸亚铁、富马酸亚铁等；第三代新型补铁剂包括氨基酸铁、血红素铁、多糖铁、多肽铁复合物、富铁酵母和纳米材料补铁剂等。氨基酸螯合铁是氨基酸分子中的羧基通过孤对电子和铁离子形成配位键，生成稳定的环状结构，分子内电荷趋于中性，在人体消化系统的ph环境中溶解性良好。而多糖铁(ⅲ)螯合物的抗氧化活性表现出比多糖更强的羟基自由基和超氧自由基清除活性，随着多糖类物质的研究逐步深入、营养保健功能被全面揭示，以fe
3+
作为铁元素供体，多糖为配体的复合制剂成为新型口服补铁剂。国内外报道多糖铁(ⅲ)配合物，如右旋糖酐铁，具有普通补铁剂无法比拟的优点，其配合物不仅稳定性强、含铁量高，而且具有更高的生物利用度，可促进铁吸收。与此同时，多糖铁(ⅲ)配合物还能发挥多糖的保健作用，是极具潜力的补铁口服制剂。因此，开发制备简单和便宜有效的多糖铁是市售补铁剂一个研发方向。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂及其制备方法和应用，本发明提供的琥珀酰基普鲁兰糖螯合铁制剂的制备方法简单、具备价格优势、产品安全有效且适宜推广应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖；
8.s2、将柠檬酸钠和s1中所得的琥珀酰基普鲁兰糖配制成琥珀酰基普鲁兰糖水溶液，搅拌加热的同时滴入铁离子溶液和碱性调节剂溶液，反应达到饱和后停止滴加，继续水浴加热，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；
9.s3、将s2所得的反应液离心后取上清液，将上清液浓缩后醇沉、静置、抽滤，所得沉淀加水溶解、透析、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品；
10.s4、将琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品溶解、透析除盐、冻干，得琥珀酰基普鲁兰
多糖螯合铁纯品。
11.优选地，所述s1中的普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐的重量比为(18～22)：(2～4)：(10～14)。
12.优选地，所述s1中的琥珀酰基普鲁兰糖的分子量为100kda～200kda，琥珀酰基的取代度为71％～78％。
13.优选地，所述s2中的柠檬酸钠和琥珀酰基普鲁兰糖的重量比为(1～2)：(1～2)；所述琥珀酰基普鲁兰糖水溶液的中琥珀酰基普鲁兰糖的浓度为0.01g/ml～0.02g/ml。
14.优选地，所述s2中铁离子溶液的浓度为1.5mol/l～2.5mol/l，碱性调节剂溶液的浓度为1.5mol/l～2.5mol/l；所述铁离子溶液和碱性调节剂溶液的加入量和加入速度以反应体系的ph值维持在7～9，且反应体系中形成沉淀并立即溶解为准；所述s2中的反应达到饱和为溶液中的红棕色沉淀不再溶解时即达到饱和。
15.优选地，所述s2中的搅拌加热为边搅拌边加热至60℃～80℃。
16.优选地，所述透析均为去离子水透析24h～60h；所述冻干均为先在-58℃～-62℃预冻22h～26h，再在真空度0.1pa、-58℃～-62℃冷冻干燥22h～26h。
17.优选地，所述s3中的离心为3500r/min～4500r/min离心4min～6min；所述s3中的醇沉为添加浓缩后所得溶液体积3倍体积的无水乙醇醇沉；所述s3中的静置为室温下静置22h～26h。
18.本发明还提供一种上述方案中所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法制备所得的琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂。
19.本发明还提供一种上述方案中所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂在补铁药物方面的应用。
20.有益技术效果：本发明提供了一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂及其制备方法和应用，本发明利用琥珀酰化普鲁兰多糖链游离羟基和羧基与铁离子进行络合反应，再透析、冻干后得到多糖螯合铁制剂，本发明得到的多糖螯合铁制剂经红外证明了st-pu螯合铁制剂的成功合成，且极易复溶，具有改善ida小鼠贫血的功效。同时，本发明制备方法的主要原料来源广泛，成本低廉，合成条件温和、生产路线简洁、工艺流程简单、可操作性强、生产质量更易于控制，与现有类似产品相比，具有价格优势和临床使用价值。
附图说明
21.图1为琥珀酰基普鲁兰多糖(st-pu)和琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁(st-pu-fe
3+
)以及实施例1制备的样品的红外图谱；其中线条a代表普鲁兰多糖，线条b代表琥珀酰基普鲁兰多糖，线条c代表实施例1制备的样品；
22.图2为实施例1制备的产品以及对照品的紫外图谱；其中，线条a代表实施例1制备的样品；线条b代表琥珀酰基普鲁兰多糖(st-pu)；
23.图3小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠血常规变化图；其中，图3a为小鼠hgb的变化图，图3b为小鼠rbc的变化图，图3c为小鼠hct的变化图；
24.图4小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠血清铁的变化图；
25.图5小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠血清总铁结合力的变化图；
26.图6小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠转铁蛋白的变化图；
27.图7小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中铁含量的变化图；
28.图8小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数的变化图；
29.图9小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠肝脏过氧化氢酶的变化图；
30.图10小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠肝脏甲烷二羧酸醛酶的变化图；
31.图11小鼠缺铁性贫血改善实验-小鼠肝脏超氧化物歧化酶的变化图。
具体实施方式
32.本发明提供了一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
33.s1、将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖；
34.s2、将柠檬酸钠和s1中所得的琥珀酰基普鲁兰糖配制成琥珀酰基普鲁兰糖水溶液，搅拌加热的同时滴入铁离子溶液和碱性调节剂溶液，反应达到饱和后停止滴加，继续水浴加热，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；
35.s3、将s2所得的反应液离心后取上清液，将上清液浓缩后醇沉、静置、抽滤，所得沉淀加水溶解、透析、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品；
36.s4、将琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品溶解、透析除盐、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁纯品。
37.本发明将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖。
38.在本发明中，所述普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐的重量比优选为(18～22)：(2～4)：(10～14)，更优选为20：3：12；所述二甲基亚砜的加入量优选为每克普鲁兰糖加入1.4ml～1.6ml二甲基亚砜；所述边加热边搅拌反应优选为45℃～55℃磁力搅拌。所述琥珀酰基普鲁兰糖的分子量优选为100kda～200kda，琥珀酰基的取代度为71％～78％。普鲁兰糖(pullulan，pu)是由出芽短梗霉发酵产生的胞外直链状多糖，由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位通过α-1,6糖苷键聚合而成。普鲁兰糖具备良好的水溶性和生物安全性，在食品级医药行业有广泛的发展前景。普鲁兰糖亦能通过化学衍生为琥珀酰基普鲁兰糖(st-pu)，st-pu是一种带阴离子的大分子聚合物，通过化学修饰改善多糖性能，st-pu可作为有缓释作用的药物载体，可有效地与金属离子络合，其具备优良水溶性、生物相容性和生物降解性等功能。本发明通过合理控制上述原料的种类、加入比例和反应条件，得到分子量及琥珀酰基的取代度合适的琥珀酰基普鲁兰糖，而普鲁兰糖单元中琥珀酰基基团数目，对后续螯合铁反应的进行有重要影响。
39.本发明将柠檬酸钠和上述所得的琥珀酰基普鲁兰糖配制成琥珀酰基普鲁兰糖水溶液，搅拌加热的同时滴入铁离子溶液和碱性调节剂溶液，反应达到饱和后停止滴加，继续水浴加热，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液。
40.在本发明中，所述柠檬酸钠和琥珀酰基普鲁兰糖的重量比优选为(1～2)：(1～2)，更优选为1：2；所述琥珀酰基普鲁兰糖水溶液的中琥珀酰基普鲁兰糖的浓度优选为0.01g/ml～0.02g/ml。本发明的柠檬酸钠为螯合反应的催化剂，经研究发现，随着柠檬酸钠和琥珀酰基普鲁兰糖重量比的增大，最终琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的生成量先增高后下降，而本发明柠檬酸钠和琥珀酰基普鲁兰糖的重量比，既可以保证琥珀酰基普鲁兰糖与铁离子溶
液螯合反应的顺利进行，又可以保证琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的生成量。
41.在本发明中，所述铁离子溶液优选为氯化铁溶液、硫酸铁溶液或硝酸铁溶液，更优选为氯化铁溶液；所述铁离子溶液的浓度优选为
42.1.5mol/l～2.5mol/l，更优选为2.0mol/l；所述碱性调节剂溶液优选为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，更优选为氢氧化钠溶液；所述碱性调节剂的浓度优选为1.5mol/l～2.5mol/l，更优选为2.0mol/l；所述铁离子溶液和碱性调节剂溶液的加入量和加入速度优选以反应体系的ph值维持在7～9，且反应体系中形成沉淀并立即溶解为准；所述反应达到饱和为溶液中的红棕色沉淀不再溶解时即达到饱和。本发明通过控制铁离子溶液和碱性调节剂溶液的加入量和加入速度实现对反应体系ph值的调控，保证反应体系中的铁离子充分与琥珀酰基普鲁兰糖螯合在一起。
43.在本发明中，所述搅拌加热优选为边搅拌边加热至60℃～80℃；所述继续水浴加热加热优选为60℃～80℃水浴加热1h～3h。
44.本发明将上述所得的反应液离心后取上清液，将上清液浓缩后醇沉、静置、抽滤，所得沉淀加水溶解、透析、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品。
45.在本发明中，所述浓缩优选为使用旋转蒸发仪浓缩至原上清液体积的1/4～1/3；所述醇沉优选为添加浓缩后所得溶液体积3倍体积的无水乙醇醇沉；所述静置优选为室温下静置22h～26h；所述抽滤优选为将静置后的溶液通过抽滤泵在真空度0.1mpa下抽滤；所述沉淀加水溶解优选为将抽滤所得的沉淀按每0.1g沉淀加1ml～2ml去离子水的比例溶解；所述透析优选为去离子水透析24h～60h；所述冻干优选为先在-58℃～-62℃预冻22h～26h，再在真空度0.1pa、-58℃～-62℃冷冻干燥22h～26h；所述离心优选为3500r/min～4500r/min离心4min～6min。
46.本发明最后将琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品溶解、透析除盐、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁纯品。
47.在本发明中，所述溶解优选为用去离子水将琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品溶解浓度为0.01g/ml～0.02g/ml的溶液；所述透析优选为去离子水透析48h～60h；所述冻干优选为先在-58℃～-62℃预冻22h～26h，再在真空度0.1pa、-58℃～-62℃冷冻干燥22h～26h。本发明通过冻干的工艺，使所得的多糖螯合铁制剂极易复溶。
48.本发明还提供一种上述方案中所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法制备所得的琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂。
49.本发明所得琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂经红外证明了st-pu螯合铁制剂的成功合成，且极易复溶，具有改善ida小鼠贫血的功效。同时，本发明制备方法的主要原料来源广泛，成本低廉，合成条件温和、生产路线简洁、工艺流程简单、可操作性强、生产质量更易于控制，与现有类似产品相比，具有价格优势和临床使用价值。
50.本发明还提供一种上述方案中所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂在补铁药物方面的应用。
51.本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂在医学上可接受的剂型即可。对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用相应剂型的制备方法即可。本发明对所述药物中琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的含量没有特殊限定，采用药物中常规活性物质的含量即可。
52.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
53.实施例1
54.(1)将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐按质量比为20：3：12的比例溶于二甲基亚砜中，二甲基亚砜的用量为每克普鲁兰糖加入1.4ml二甲基亚砜，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖；
55.采用滴定分析法检测琥珀酰基普鲁兰糖中琥珀酰基的取代度(下同)：
56.准确称取琥珀酰基普鲁兰糖0.15g于50ml烧杯中，分别量取1ml乙醇、10ml去离子水和0.2mol/l的nh4cl缓冲溶液4ml加入烧杯中，搅拌溶解，调节ph至6.0～7.0，精密加入0.05mol/l的cuso4标准溶液10.0ml，摇匀，放置15min，转移至50ml容量瓶中，定容，摇匀，布氏漏斗过滤。精密量取续滤液10ml，调节ph至7.5～8.0。以pan为指示剂。用edta标准溶液滴定至溶液呈绿色，即为滴定终点。将滴定的结果用空白试验校正。根据公式计算样品的取代度：
[0057][0058][0059]
式中，b：琥珀酸钠基含量，其中123是琥珀酸钠基的相对分子质量；w：称样量，g；cedta：edta标准溶液浓度，mol/l；v0：作空白时消耗edta的体积，ml；v1：作试样时消耗edta的体积，ml。
[0060]
经检测，所得琥珀酰基普鲁兰糖中琥珀酰基的取代度为71％。
[0061]
(2)称取上述琥珀酰基普鲁兰糖(st-pu)2g，柠檬酸钠1g，置于三颈烧瓶中，加100ml蒸馏水溶解，于70℃水浴加热并不断搅拌，将浓度为2mol/l的fecl3溶液缓慢滴加入溶液中，同时滴加浓度为2mol/l的naoh溶液，控制二者滴加的速度和滴加量，调节反应液ph至8，反应中滴入的fecl3溶液开始形成沉淀并立即溶解，当溶液中红棕色沉淀不再溶解时，反应达到饱和，继续水浴加热2h，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；
[0062]
(3)将上述反应液4000r/min离心5min去除沉淀，取上清液旋转蒸发仪浓缩至原上清液体积的1/4，加入3倍体积的无水乙醇醇沉，静置24h，抽滤，所得沉淀按每0.1g沉淀加1ml去离子水的比例溶解，去离子水透析24h，将得到的透析液进行冷冻干燥：将所得到的透析液于-60℃预冻24h，所得到的预冻产物于-60℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥24h，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁(st-pu-fe
3+
)粗品；
[0063]
(4)在st-pu-fe
3+
粗品中加入去离子水，配制成浓度为0.01g/ml的溶液，将溶液加入透析袋内，用去离子水透析48h，将所得到的透析液于-60℃预冻24h，所得到的预冻产物于-60℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥24h，得颗粒状st-pu-fe
3+
纯品。
[0064]
实施例2
[0065]
(1)将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐按质量比为22：4：14的比例溶于二甲基亚砜中，二甲基亚砜的用量为每克普鲁兰糖加入1.6ml二甲基亚砜，边加热边搅拌反
应，得琥珀酰基普鲁兰糖；通过滴定分析法检测所得琥珀酰基普鲁兰糖中琥珀酰基的取代度为78％；
[0066]
(2)称取上述琥珀酰基普鲁兰糖(st-pu)2g，柠檬酸钠2g，置于三颈烧瓶中，加100ml蒸馏水溶解，于60℃水浴加热并不断搅拌，将浓度为2.5mol/l的fecl3溶液缓慢滴加入溶液中，同时滴加浓度为2.5mol/l的naoh溶液，控制二者滴加的速度和滴加量，调节反应液ph至7，反应中滴入的fecl3溶液开始形成沉淀并立即溶解，当溶液中红棕色沉淀不再溶解时，反应达到饱和，继续水浴加热1h，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；
[0067]
(3)将上述反应液4500r/min离心4min去除沉淀，取上清液旋转蒸发仪浓缩至原上清液体积的1/3，加入3倍体积的无水乙醇醇沉，静置26h，抽滤，所得沉淀按每0.1g沉淀加2ml去离子水的比例溶解，去离子水透析24h，将得到的透析液进行冷冻干燥：将所得到的透析液于-58℃预冻26h，所得到的预冻产物于-62℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥22h，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁(st-pu-fe
3+
)粗品；
[0068]
(4)在st-pu-fe
3+
粗品中加入去离子水，配制成浓度为0.02g/ml的溶液，将溶液加入透析袋内，用去离子水透析48h，将所得到的透析液于-60℃预冻24h，所得到的预冻产物于-60℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥24h，得颗粒状st-pu-fe
3+
纯品。
[0069]
实施例3
[0070]
(1)将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐按质量比为18：2：10的比例溶于二甲基亚砜中，二甲基亚砜的用量为每克普鲁兰糖加入1.5ml二甲基亚砜，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖；通过滴定分析法检测所得琥珀酰基普鲁兰糖中琥珀酰基的取代度为75％；
[0071]
(2)称取上述琥珀酰基普鲁兰糖(st-pu)1g，柠檬酸钠2g，置于三颈烧瓶中，加100ml蒸馏水溶解，于80℃水浴加热并不断搅拌，将浓度为1.5mol/l的fecl3溶液缓慢滴加入溶液中，同时滴加浓度为1.5mol/l的naoh溶液，控制二者滴加的速度和滴加量，调节反应液ph至9，反应中滴入的fecl3溶液开始形成沉淀并立即溶解，当溶液中红棕色沉淀不再溶解时，反应达到饱和，继续水浴加热3h，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；
[0072]
(3)将上述反应液3500r/min离心6min去除沉淀，取上清液旋转蒸发仪浓缩至原上清液体积的1/4，加入3倍体积的无水乙醇醇沉，静置22h，抽滤，所得沉淀按每0.1g沉淀加1.5ml去离子水的比例溶解，去离子水透析48h，将得到的透析液进行冷冻干燥：将所得到的透析液于-60℃预冻24h，所得到的预冻产物于-60℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥24h，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁(st-pu-fe
3+
)粗品；
[0073]
(4)在st-pu-fe
3+
粗品中加入去离子水，配制成浓度为0.015g/ml的溶液，将溶液加入透析袋内，用去离子水透析60h，将所得到的透析液于-62℃预冻22h，所得到的预冻产物于-62℃，0.1pa的真空度条件下冷冻干燥26h，得颗粒状st-pu-fe
3+
纯品。
[0074]
试验例1光谱检测
[0075]
(1)红外检测：先以基普鲁兰多糖(pu)为对照，推测是否合成琥珀酰基普鲁兰多糖(st-pu)，再以琥珀酰基普鲁兰多糖(st-pu)为对照，推测是否合成琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁(st-pu-fe
3+
)。采用kbr压片法，40～4000cm-1
波数扫描。检测结果如图1所示，由图1可以看出，实施例1制备的样品在琥珀酰化的普鲁兰糖在3418cm-1
处的-oh伸缩振动减弱，并在1734cm-1
处出现新的酯基峰，st-pu与fecl3发生配位反应生成的st-pu-fe
3+
的红外光谱具有
多糖的特征吸收峰，相比st-pu，-oh特征吸收峰由3418cm-1
移动至3386cm-1
，在1636cm-1
出现新的st-pu-fe
3+
配合吸收峰。此外，st-pu-fe
3+
配合物红外谱图与铁离子的无机盐供体fecl3的红外谱图有明显不同，说明成功合成st-pu-fe
3+
配合物。
[0076]
(2)取实施例1～3制备的样品，以琥珀酰基普鲁兰多糖(st-pu)为对照，进行紫外检测：
[0077]
取一定量的st-pu与st-pu-fe(ⅲ)配合物分别溶于蒸馏水中，在紫外分光光度计上进行紫外光谱200nm～600nm波长扫描，分析st-pu及st-pu-fe(ⅲ)配合物间的紫外扫描曲线的差异。
[0078]
检测结果如图2所示。由图2可以看出，st-pu在280nm处出现强吸收峰，这是st-pu中-cooh p-π共轭产生的电子发生了n-π*跃迁所致。当st-pu与fe(iii)形成配合物，st-pu在280nm处的吸收峰消失，说明在配合物中羧甲基的p-π共轭发生变化，导致st-pu-fe(iii)配合物在200-500nm间呈现平缓下降的曲线。以上uv光谱显示，fe(iii)与st-pu间发生配位，st-pu-fe(ⅲ)中fe(iii)与st-pu之间存在电子的迁移，使得st-pu-fe(ⅲ)紫外吸收发生了质的变化。
[0079]
试验例2st-pu-fe(ⅲ)对小鼠缺铁性贫血改善实验
[0080]
健康无特定病原体(specific pathogen free，spf)级三周龄雄性icr小鼠，体重18g～22g，按体重分层，将小鼠随机分为正常对照组和贫血模型组。正常对照组以正常饮食喂养，铁含量每公斤饮食200毫克铁，贫血模型组将基础饮食中的铁含量降低到每公斤饮食7毫克铁，以低铁饲料喂养联合放血法，引起小鼠贫血。造模成功后，对照组以生理盐水灌胃作为对照，贫血模型组随机分为模型对照组、硫酸亚铁组、市售右旋糖酐铁组和st-pu-fe(ⅲ)(此为实施例1所得的样品，下同)剂量组，灌胃28d验证治疗效果，具体给药剂量如表1所示，实验期间各组分笼饲养，饲喂标准饲料，自由饮水。
[0081]
表1小鼠给药剂量
[0082][0083]
分组灌胃28d后，血常规测定结果如图3所示，各补铁组hgb含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，rbc含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，hct含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，其中st-pu-fe(ⅲ)组hgb含量为133.21g/l，rbc含量升高至8.5510
12
/l，hct含量升高至0.42l/l，血红蛋白(hgb)、红细胞数(rbc)和血细胞比容(hct)含量均有所改善，水平均显著升高，贫血症状均明显恢复，且相比ida模型组均展现良好的疗效。
[0084]
血清生化指标结果如图4～6所示，由图4～6可以看出，ida模型组小鼠血清铁(si)浓度为34.62μmol/l，小鼠总铁结合力(tibc)水平为136.20μmol/l，小鼠转铁蛋白(trf)含量为23.66mg/dl，正常对照组si浓度为50.00μmol/l，tibc水平为82.31μmol/l，trf含量为18.61mg/dl，ida模型组小鼠与正常对照组相比，si含量明显降低，tibc水平和trf含量显著升高。给药4周后，各补铁组小鼠三种指标参数相比ida组小鼠均有改善，si浓度均显著升高，tibc水平和trf含量显著降低。相同剂量下，各补铁组si含量大小为st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，tibc含量大小为st-pu-fe(ⅲ)组＜市售右旋糖酐铁组＜硫酸亚铁组＜模型对照组，trf含量大小为st-pu-fe(ⅲ)组＜市售右旋糖酐铁组＜硫酸亚铁组＜模型对照组。其中，st-pu-fe(ⅲ)组si浓度为50.51μmol/l，tibc水平为85.73μmol/l，trf含量为18.80mg/dl，结果表明，st-pu-fe(ⅲ)组较市售右旋糖酐铁组和硫酸亚铁组si浓度更高，tibc水平和trf含量更低。
[0085]
组织铁含量测定结果如图7所示，由图7可以看出，各补铁组心脏铁含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，肝脏铁含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，脾脏铁含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，肾脏铁含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组。结果显示，st-pu-fe(ⅲ)组小鼠心脏铁含量升高为6.70μmol/gprot，铁含量高于正常对照组，增幅为2.29％，肝脏铁含量升高为15.34μmol/gprot，铁含量高于正常对照组，增幅为13.88％，脾脏铁含量升高为9.05μmol/gprot，铁含量高于正常对照组，增幅为20.99％，肾脏铁含量升高为5.63μmol/gprot，铁含量高于正常对照组，增幅为17.54％。
[0086]
补铁四周后，各组小鼠器官指数如图8所示，由图8可以看出，ida组小鼠的肝脏系数显著提高，ida较高的心脏指数、脾脏指数和肾脏指数明显下降。各补铁组肝脏指数大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，心脏指数、脾脏指数和肾脏指数大小均为：st-pu-fe(ⅲ)组＜市售右旋糖酐铁组＜硫酸亚铁组＜模型对照组，结果显示，st-pu-fe(ⅲ)组小鼠肝脏指数升高为4.14，心脏指数为0.54，脾脏指数为0.31，肾脏指数为1.37，明显缓解ida组小鼠的心脏、脾脏和肾脏的肥厚，相比其他补铁治疗组改善效果最好，且最接近正常对照组小鼠。
[0087]
小鼠肝脏氧化应激的反应结果如图9～11所示，由图9～11可以看出，ida组小鼠的cat含量为31.36nmol/mgprot，正常对照组小鼠的cat含量为194.65nmol/mgprot，ida组小鼠的sod含量14.79nmol/mgprot，正常对照组小鼠的sod含量为27.24nmol/mgprot，ida组小鼠的mda含量为15.39nmol/mgprot，正常对照组小鼠的mda含量为9.28nmol/mgprot，ida组小鼠与正常组小鼠相比，过氧化氢酶(cat)值和超氧化物歧化酶(sod)值降低，甲烷二羧酸醛酶(mda)值升高。经过补铁剂治疗后，各补铁组cat含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，sod含量大小为：st-pu-fe(ⅲ)组＞市售右旋糖酐铁组＞硫酸亚铁组＞模型对照组，mda含量大小为st-pu-fe(ⅲ)组＜市售右旋糖酐铁组＜硫酸亚铁组＜模型对照组。结果显示，相比ida组，各补铁组小鼠的cat值和sod值升高，mda值降低，其中，st-pu-fe(ⅲ)组小鼠的cat值为162.55nmol/mgprot，sod值为26.79nmol/mgprot，mda值为8.16nmol/mgprot。st-pu-fe(ⅲ)组小鼠cat值和sod值增加最多且最接近正常对照组，mda值降低最明显，且低于正常对照组。可以看出，st-pu-fe(ⅲ)在促进sod和
cat活性和抑制mda产生方面最优。
[0088]
综上所述，本发明成功得到了多糖螯合铁制剂，该多糖螯合铁制剂极易复溶，具有改善ida小鼠贫血的功效。同时，本发明制备方法的主要原料来源广泛，成本低廉，合成条件温和、生产路线简洁、工艺流程简单、可操作性强、生产质量更易于控制，与现有类似产品相比，具有价格优势和临床使用价值。
[0089]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，边加热边搅拌反应，得琥珀酰基普鲁兰糖；s2、将柠檬酸钠和s1中所得的琥珀酰基普鲁兰糖配制成琥珀酰基普鲁兰糖水溶液，搅拌加热的同时滴入铁离子溶液和碱性调节剂溶液，反应达到饱和后停止滴加，继续水浴加热，得到含有琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁的反应液；s3、将s2所得的反应液离心后取上清液，将上清液浓缩后醇沉、静置、抽滤，所得沉淀加水溶解、透析、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品；s4、将琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁粗品溶解、透析除盐、冻干，得琥珀酰基普鲁兰多糖螯合铁纯品。2.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s1中的普鲁兰多糖、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐的重量比为（18~22）：（2~4）：（10~14）。3.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s1中的琥珀酰基普鲁兰糖的分子量为100kda~200kda，琥珀酰基的取代度为71%~78%。4.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s2中的柠檬酸钠和琥珀酰基普鲁兰糖的重量比为（1~2）：（1~2）；所述琥珀酰基普鲁兰糖水溶液的中琥珀酰基普鲁兰糖的浓度为0.01g/ml~0.02g/ml。5.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s2中铁离子溶液的浓度为1.5mol/l~2.5mol/l，碱性调节剂溶液的浓度为1.5mol/l~2.5mol/l；所述铁离子溶液和碱性调节剂溶液的加入量和加入速度以反应体系的ph值维持在7~9，且反应体系中形成沉淀并立即溶解为准；所述s2中的反应达到饱和为溶液中的红棕色沉淀不再溶解时即达到饱和。6.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s2中的搅拌加热为边搅拌边加热至60℃~80℃。7.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述透析均为去离子水透析24h~60h；所述冻干均为先在-58℃~-62℃预冻22h~26h，再在真空度0.1pa、-58℃~-62℃冷冻干燥22h~26h。8.根据权利要求1所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法，其特征在于，所述s3中的离心为3500r/min~4500r/min离心4min~6min；所述s3中的醇沉为添加浓缩后所得溶液体积3倍体积的无水乙醇醇沉；所述s3中的静置为室温下静置22h~26h。9.一种权利要求1~8任一所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂的制备方法制备所得的琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂。10.一种权利要求9所述琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂在补铁药物方面的应用。

技术总结
本发明提供了一种琥珀酰化普鲁兰多糖螯合铁制剂及其制备方法和应用，属于医药材料技术领域。本发明利用琥珀酰化普鲁兰多糖链游离羟基和羧基与铁离子进行络合反应，再透析、冻干后得到多糖螯合铁制剂，本发明得到的多糖螯合铁制剂经红外证明了ST-PU螯合铁制剂的成功合成，且极易复溶，具有改善IDA小鼠贫血的功效。同时，本发明制备方法的主要原料来源广泛，成本低廉，合成条件温和、生产路线简洁、工艺流程简单、可操作性强、生产质量更易于控制，与现有类似产品相比，具有价格优势和临床使用价值。值。值。


技术研发人员：杨文智 刘新硕 李海鹰
受保护的技术使用者：河北大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/18