一种生物素修饰稀土掺杂无机材料及其制备方法与流程

1.本发明属于功能材料领域，尤其涉及一种生物素修饰稀土掺杂无机材料及其制备方法。


背景技术：

2.稀土掺杂无机纳米发光材料因其优异的光学性能，在绿色照明、平板显示、纳米光电子器件及生物标记等技术领域引起了人们的广泛关注。尤其是在生物标记技术领域，相比于目前常用的荧光染料和半导体量子点，无机稀土纳米发光材料具有发光效率高、毒性低、线宽窄、荧光寿命长和发射波长可调谐等综合优势，是目前普遍被看好的新一代荧光生物标记材料。
3.生物素，即人们所熟知的维生素h，常与亲和素或链毒亲和素结合，偶联抗原抗体等生物活性物质进行检测。将稀土掺杂无机纳米颗粒与生物素-亲和素统结合起来有利于进行灵敏、高效的生物标记检测甚至生物成像，因而越来越受到国内外学者的关注。
4.目前，将生物素或者亲和素连接到纳米颗粒表面通常采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺为交联剂，在“水相”环境中，将生物素表面的羧基与无机纳米颗粒表面的氨基或羧基反应，但生物素、亲和素和纳米颗粒的水溶性不佳，生物素表面的羧基与无机纳米颗粒表面的氨基或羧基反应程度不高。
5.为解决生物素表面的羧基与无机纳米颗粒表面的氨基或羧基反应程度不高的问题，cn102604637a公开了生物素修饰稀土掺杂无机荧光纳米颗粒的制备方法，该发明采用了有机反应中酰胺合成常用的“固相合成法”，使用苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂以及n,n-二异丙基乙胺为活化剂，在无水n,n-二甲基甲酰胺的“油相”溶剂中，将生物素的羧基进行活化，然后与纳米颗粒的氨基反应形成酰胺键，成功实现对多种无机纳米颗粒的生物素修饰。但该发明所采用的活化剂对生物素的羧基活化效果不佳。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本发明提供一种生物素修饰稀土掺杂无机材料及其制备方法，本发明采用的活化剂对生物素的羧基具有良好的活化效果，使生物素和稀土掺杂无机纳米颗粒反应程度高，产率提高，节约了原料及成本。
7.本发明的目的在于提供一种生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤s1.生物素的活化：将苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯和生物素溶解，加入活化剂活化；
9.步骤s2.生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备：在经活化的生物素中加入氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料反应，纯化，干燥，得生物素修饰稀土掺杂无机材料；
10.步骤s1中，所述活化剂的结构如下：
[0011][0012]
本发明通过在稀土元素中掺杂二氧化硅包覆纳米银，二氧化硅包覆纳米银与稀土元素共振增强稀土元素发光。
[0013]
发明人在实验过程中，意外的发现：本发明采用的活化剂对生物素的羧基具有良好的活化效果，使生物素和稀土掺杂无机纳米颗粒反应程度高。所可能的原因是：一方面，所采用的活化剂含有苯环、氟、三氟甲基等吸电子基团，对生物素的羧基的活化效果好，另一方面，所采用的活化剂与二氧化硅表面的羟基存在氢键作用，在生物素与活化剂反应后，增大了引入活化剂的生物素与含有二氧化硅的稀土掺杂无机纳米颗粒的接触几率，促进了生物素与稀土掺杂无机纳米颗粒的结合。
[0014]
优选地，所述稀土元素选自gd、eu、pr、dy、er、yb中的至少一种。
[0015]
优选地，步骤s1中，所述活化的时间为8-16小时。
[0016]
优选地，所述氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料的制备包括如下步骤：将醋酸钆和醋酸铕、溶剂混合，在惰性气氛下，加热升温，冷却到室温，滴加溶有二氧化硅包覆纳米银的氟化铵溶液和氢氧化钠溶液，升温反应，冷却到室温，沉淀并洗涤，加入端氨基硅烷和乙醇，升温回流，室温下搅拌，得氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料。
[0017]
优选地，所述端氨基硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
[0018]
优选地，所述醋酸钆、醋酸铕、二氧化硅包覆纳米银、氟化铵、氢氧化钠和端氨基硅烷的质量比为5-6:1:0.2-0.5:2-3:1-1.2:1-1.5。
[0019]
优选地，所述溶剂选自油酸和十八烯混合溶剂。
[0020]
优选地，所述加热升温至140-160℃。
[0021]
优选地，所述活化剂的制备方法包括如下步骤：
[0022]
将醇和弱碱溶解，加入经socl2活化的4-氰基-2-氟苯酸，加热搅拌，纯化，得活化剂；所述醇的结构如下所示：
[0023][0024]
优选地，所述弱碱选自吡啶、三乙醇胺、n,n-二异丙基乙胺、三乙烯二胺中的一种。
[0025]
优选地，所述4-氰基-2-氟苯酸与socl2的质量比为1:1.2～2。
[0026]
优选地，所述醇与4-氰基-2-氟苯酸的质量比为2:1。
[0027]
优选地，步骤s1中，所述生物素、苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯与活化剂的质量比为1:1-1.5:1.5-2。
[0028]
优选地，所述生物素与氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料的质量比为1:1.5-2.5。
[0029]
优选地，步骤s2中，所述纯化为用dmf和水洗涤。
[0030]
本发明另一目的在于提供一种生物素修饰稀土掺杂无机材料，所述生物素修饰稀土掺杂无机材料由上述制备方法制得。
[0031]
本发明再一目的在于提供一种生物素修饰稀土掺杂无机材料的应用，将亲水超支化聚缩水甘油、溶于第一缓冲液的生物素修饰稀土掺杂无机材料加到溶于第二缓冲液的亲和素中，培养一段时间，进行荧光测试。
[0032]
本发明通过在生物素修饰稀土掺杂无机材料和亲和素中加入亲水超支化聚缩水甘油，阻断了生物素修饰稀土掺杂无机材料和亲和素由于疏水基团相互靠拢而产生的非特异性吸附，且亲水超支化聚缩水甘油可提供较大的空间位阻，进一步阻断非特异性吸附的发生，促进了生物素修饰稀土掺杂无机材料和亲和素之间的特异性结合。
[0033]
优选地，所述第一缓冲液选自0.01m磷酸盐缓冲液。
[0034]
优选地，所述第二缓冲液选自0.1m碳酸盐缓冲液。
附图说明
[0035]
图1.实施例4、对比例3-4的荧光光谱图。
具体实施方式
[0036]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0037]
二氧化硅包裹纳米银复合颗粒、亲水超支化聚缩水甘油均购买自西安瑞禧生物科技有限公司。
[0038]
实施例1：氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料的制备。
[0039]
将0.06mg醋酸钆和0.01mg醋酸铕、1.2ml油酸和2.7ml十八烯混合，在惰性气氛下，加热升温至150℃，待醋酸钆和醋酸铕完全溶解，冷却到室温，滴加溶有0.005mg二氧化硅包覆纳米银的0.03mg氟化铵和0.012mg氢氧化钠的6ml甲醇溶液，升温至55℃反应，待甲醇排净，冷却到室温，沉淀并洗涤，加入0.015mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇，升温回流，室温下搅拌，得氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料。
[0040]
实施例2：活化剂的制备。
[0041]
将20mg醇和1ml吡啶溶解于20ml四氢呋喃，加入经1.5mg socl2活化的10mg 4-氰基-2-氟苯酸，65℃加热搅拌反应，减压蒸馏，得活化剂；所述醇的结构如下所示：
[0042][0043]
所制得的活化剂结构如下：
[0044][0045]1h-nmr(400mhz,ccl3d),δ(ppm):10.23(s,1h,nh),8.19(m,1h,arh),7.83(m,1h,arh),7.72(m,1h,arh),7.28(m,1h,arh),7.15(m,1h,arh),6.84(s,1h,arh),6.75(s,1h,ch),6.54(s,1h,arh),6.06(m,1h,ch),4.50(s,3h,ch3),6.99(d,3h,ch3)。
[0046]
实施例3：生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备。
[0047]
步骤s1.生物素的活化：分别称取10mg苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯和10mg生物素溶解于1ml n,n-二甲基甲酰胺，加入20mg实施例2制得的活化剂活化12小时；
[0048]
步骤s2.生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备：在经活化的生物素中加入20mg实施例1制得的氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料反应，dmf和水洗涤3次，干燥，得生物素修饰稀土掺杂无机材料，产率为93.2％。
[0049]
实施例4：荧光检测：
[0050]
将1mg亲和素溶于0.1m碳酸盐缓冲液中，稀释成不同浓度并加入96微孔板中，培养一段时间使亲和素通过物理吸附标记到微孔板上，用0.1m碳酸盐缓冲液清洗，除去游离的亲和素，将0.01mg亲水超支化聚缩水甘油、溶于0.01m磷酸盐缓冲液的相同体积和相同浓度的实施例3制得的生物素修饰稀土掺杂无机材料分别加入到不同浓度亲和素标记的微孔中，培养一段时间后用磷酸盐缓冲液清洗数次，在980m激发下，在荧光读板机上进行荧光光谱检测，记录582nm波长下的荧光强度。
[0051]
对比例1：生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备。
[0052]
将实施例3中的实施例2制得的活化剂替换成n,n-二异丙基乙胺，其余步骤不变，产率为75.6％。
[0053]
对比例2：生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备。
[0054]
步骤s1.氨基化稀土掺杂无机纳米银材料：将0.06mg醋酸钆和0.01mg醋酸铕、1.2ml油酸和2.7ml十八烯混合，在惰性气氛下，加热升温至150℃，待醋酸钆和醋酸铕完全溶解，冷却到室温，滴加溶有0.03mg氟化铵和0.012mg氢氧化钠的6ml甲醇溶液，升温至55℃反应，待甲醇排净，冷却到室温，沉淀并洗涤，加入0.015mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇，升温回流，室温下搅拌，得氨基化稀土掺杂无机纳米银材料。
[0055]
步骤s2.生物素的活化：分别称取10mg苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯和10mg生物素溶解于1ml n,n-二甲基甲酰胺，加入20mg实施例2制得的活化剂活化12小时；
[0056]
步骤s3.生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备：在经活化的生物素中加入20mg步骤s1制得的氨基化稀土掺杂无机纳米银材料反应，dmf和水洗涤3次，干燥，得生物素修饰稀土掺杂无机材料，产率为84.7％。
[0057]
对比例3：荧光检测。
[0058]
将1mg亲和素溶于0.1m碳酸盐缓冲液中，稀释成不同浓度并加入96微孔板中，培养
一段时间使亲和素通过物理吸附标记到微孔板上，用0.1m碳酸盐缓冲液清洗，除去游离的亲和素，将0.01mg亲水超支化聚缩水甘油、溶于0.01m磷酸盐缓冲液的相同体积和相同浓度的对比例2制得的生物素修饰稀土掺杂无机材料分别加入到不同浓度亲和素标记的微孔中，培养一段时间后用磷酸盐缓冲液清洗数次，在980m激发下，在荧光读板机上进行荧光光谱检测，记录582nm波长下的荧光强度。
[0059]
对比例4：荧光检测。
[0060]
将1mg亲和素溶于0.1m碳酸盐缓冲液中，稀释成不同浓度并加入96微孔板中，培养一段时间使亲和素通过物理吸附标记到微孔板上，用0.1m碳酸盐缓冲液清洗，除去游离的亲和素，将溶于0.01m磷酸盐缓冲液的相同体积和相同浓度的实施例3制得的生物素修饰稀土掺杂无机材料分别加入到不同浓度亲和素标记的微孔中，培养一段时间后用磷酸盐缓冲液清洗数次，在980m激发下，在荧光读板机上进行荧光光谱检测，记录582nm波长下的荧光强度。
[0061]
从图1可以看出，随着微孔板标记的亲和素的浓度越高，所连接到表面修饰有生物素的稀土掺杂无机纳米材料越多，检测到稀土离子荧光强度越强，说明亲和素与荧光强度之间存在较好的线性关系，利用稀土掺杂无机纳米材料的荧光可以检测到亲和素浓度。实施例3制得的生物素修饰稀土掺杂无机材料的荧光强度较强；对比例3所采用的对比例2制得的生物素修饰稀土掺杂无机材料中不含有二氧化硅包覆纳米银，所测得的荧光强度较低；对比例4不添加亲水超支化聚缩水甘油，亲和素与生物素修饰稀土掺杂无机材料的非特异性吸附增多，荧光强度下降。
[0062]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本技术说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

技术特征：
1.一种生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1.生物素的活化：将苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯和生物素溶解，加入活化剂活化；步骤s2.生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备：在经活化的生物素中加入氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料反应，纯化，干燥，得生物素修饰稀土掺杂无机材料；步骤s1中，所述活化剂的结构如下：2.如权利要求1所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，所述氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料的制备包括如下步骤：将醋酸钆和醋酸铕、溶剂混合，在惰性气氛下，加热升温，冷却到室温，滴加溶有二氧化硅包覆纳米银的氟化铵溶液和氢氧化钠溶液，升温反应，冷却到室温，沉淀并洗涤，加入端氨基硅烷和乙醇，升温回流，室温下搅拌，得氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料。3.如权利要求2所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，所述端氨基硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。4.如权利要求2所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，所述醋酸钆、醋酸铕、二氧化硅包覆纳米银、氟化铵、氢氧化钠和端氨基硅烷的质量比为5-6:1:0.2-0.5:2-3:1-1.2:1-1.5。5.如权利要求1所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，所述活化剂的制备方法包括如下步骤：将醇和弱碱溶解，加入经socl2活化的4-氰基-2-氟苯酸，加热搅拌，纯化，得活化剂；所述醇的结构如下所示：6.如权利要求1所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述生物素、苯并三氮唑-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯与活化剂的质量比为1:1-1.5:1.5-2。7.如权利要求1所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，所述生物素与氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料的质量比为1:1.5-2.5。8.如权利要求1所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述纯化为用dmf和水洗涤。9.一种生物素修饰稀土掺杂无机材料，其特征在于，所述生物素修饰稀土掺杂无机材
料由权利要求1-8任一项制备方法制得。10.一种如权利要求9所述的生物素修饰稀土掺杂无机材料的应用，其特征在于，将亲水超支化聚缩水甘油、溶于第一缓冲液的生物素修饰稀土掺杂无机材料加到溶于第二缓冲液的亲和素中，培养一段时间，进行荧光测试。

技术总结
本发明公开了一种生物素修饰稀土掺杂无机材料及其制备方法，包括如下步骤：步骤S1.生物素的活化：将苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯和生物素溶解，加入活化剂，活化一段时间；步骤S2.生物素修饰稀土掺杂无机材料的制备：在经活化的生物素中加入氨基化稀土掺杂二氧化硅包覆纳米银材料反应，纯化，干燥，得生物素修饰稀土掺杂无机材料；步骤S1中，所述活化剂的结构如下：本发明采用的活化剂对生物素的羧基具有良好的活化效果，使生物素和稀土掺杂无机纳米颗粒反应程度高，产率提高，节约了原料及成本。节约了原料及成本。节约了原料及成本。


技术研发人员：何皓 杜忠波 关鸣
受保护的技术使用者：深圳市光与生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/19