一种莲房果胶及其制备方法和应用

1.本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种莲房果胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.莲房为睡莲科植物莲nelumbo nucifera gaertn的干燥花托，呈倒圆锥状或者漏斗状，表面呈灰棕色至紫棕色，质疏松，破碎面海绵样。在我国，主要在湖南、福建、江苏等地有栽培。莲房主要有化瘀止血的功效，主治用于崩漏，尿血，痔疮出血，产后瘀阻，恶露不尽等。我国古代的中医药著作早已把莲房作为药用保健品，始载于《本草纲目拾遗》，归肝经，苦、涩、温。目前针对莲房还集中在生物碱、花青素、黄酮等小分子物质上，对莲房果胶的分离、纯化、结构表征及活性研究都很少见。不同的制备方法所得到的多糖不同。多糖由多种单糖组成，其结构、含量以及糖单元的连接方式都会造成多糖的空间结构存在差异。
3.果胶是一种常见的多糖结构，常见的结构主要有高半乳糖聚糖(hg)、鼠李糖乳糖聚糖i(rg-i)和取代的半乳糖，是一种具有多种应用的生物聚合物。因为果胶多糖具有多种生理活性和相对较低的毒性，其在医疗保健、食品和化妆品行业具有巨大的潜力。工业上提取果胶的原料主要是苹果渣和柑橘皮，含有至少65％的聚半乳糖醛酸。现代药理学研究表明，果胶多糖表现出良好的自由基清除，抗氧化和免疫调节等功效。纵观目前果胶多糖的研究现状，发现果胶多糖来源较少，单个多糖成分与结构解析较少、相关化合物的提取和含量测定研究不足、活性与结构关系不明确等问题需要解决。因此，为了进一步开发果胶多糖的利用价值，需要采用其他植物提取、分离、纯化果胶多糖，对其单一组分结构、药理作用及其关系进行深入系统研究，以开发其工业价值。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种莲房果胶及其制备方法和应用。
5.本发明的技术方案是：
6.一种莲房果胶，所述莲房果胶的分子量为65kda-80kda、所述莲房果胶中的单糖组成为半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，所述莲房果胶的主链以
→
4)-α-galpa-(1
→
为连接，末端为半乳糖醛酸；所述莲房果胶的结构式为：
[0007][0008]
进一步的，所述半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为100：2～8。
[0009]
进一步的，所述n选自300～400之间。
[0010]
本发明的另一技术方案是：
[0011]
一种莲房果胶的制备方法，该方法包括：
[0012]
(1)粗制：取干燥的莲房，粉碎，获得莲房粉末，所述莲房粉末经乙醇回流两次脱脂后，经热水回流提取得到莲房水提液，再加入乙醇沉淀，大孔树脂脱色，得到莲房粗多糖；
[0013]
(2)精制：将所述莲房粗多糖上样到弱阴离子交换树脂，分别用2倍柱体积水和0.1m的盐溶液洗去除杂质，再用0.2m的盐溶液洗脱，洗脱液经减压浓缩及冷冻干燥，得到精制的莲房果胶。
[0014]
进一步的，在步骤(1)中，所述大孔树脂的类型为ab-8、xad、d301中的任意一种。
[0015]
进一步的，在步骤(2)中，所述弱阴离子交换树脂的基质为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。
[0016]
本发明的第三种技术方案是：
[0017]
一种莲房果胶在制备治疗由氧化损伤引起的疾病的药物中的应用。
[0018]
一种莲房果胶在制备免疫调节药物中的应用。
[0019]
一种莲房果胶在制备食品和化妆品助剂中的应用。
[0020]
本发明提供了一种莲房果胶及其制备方法和应用，有益效果为：通过在莲房中提取并纯化得到高纯的多糖，并经过结构鉴定得出其结构单元和基本组成。通过自由基清除实验和免疫调节模型发现本发明所得的莲房果胶具有良好的抗氧化及免疫调节活性。本发明的方法不仅操作简单，耗时短并且成本低廉。采用该方法制备的莲房果胶纯度高，结构清晰，具有多种潜在的应用价值，为开发莲房果胶的药用价值奠定了基础。
附图说明
[0021]
图1为本发明所述的一种莲房果胶的红外光谱图；
[0022]
图2为本发明所述的一种莲房果胶的一维核磁共振波谱图(1h-nmr，
13
c-nmr)；
[0023]
图3为本发明所述的一种莲房果胶的二维核磁共振波谱图(1h-1
h cosy图，1h-13
c hsqc图，1h-13
c hmbc图，1h-1
h noesy图)；
[0024]
图4为本发明所述的一种莲房果胶的扫描电镜图；
[0025]
图5为本发明所述的一种莲房果胶对自由基清除实验的结果图；
[0026]
图6为本发明所述的一种莲房果胶对raw 264.7细胞活力的影响图；
[0027]
图7为本发明所述的一种莲房果胶对no释放水平的影响图。
具体实施方式
[0028]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
[0029]
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0030]
实施例1
[0031]
本实施案例按如下步骤展示一种莲房果胶的制备方法：
[0032]
步骤1：提取
[0033]
将市售莲房粉碎，收取细粉。取500g细粉，加入75％乙醇5l，90℃回流提取2h，过滤取滤渣，重复两次。取滤渣按照1：10的料液比加入5l去离子水，100℃沸水提取2小时，重复提取3次，离心并合并3次提取所得的滤液，后过滤。
[0034]
步骤2：初步纯化
[0035]
采用膜截留分子量规格为3kda的超滤膜，进行超滤截留浓缩至1l左右。将4l无水乙醇加入浓缩液中醇沉，边加边搅拌，4℃冰箱过夜沉淀，离心(3500rpm 15min)，取沉淀，即得莲房粗多糖。复溶后将莲房粗多糖溶液上样至大孔弱碱性阴离子交换树脂d301进行脱色，收集流穿的组分，减压浓缩。用3.5kda透析袋连续透析三天后冷冻干燥，得到莲房粗多糖。
[0036]
步骤3：精制
[0037]
采用苏州汇通色谱分离纯化有限公司层析柱，填充琼脂糖deae填料，进行纯化。粗多糖样本制成50mg/ml的样本溶液，膜过滤后进样，中压制备液相流速8ml/min，收集0.2m盐洗脱液，即为莲房果胶。用3.5kda透析袋透析，离心、冷冻干燥样本，冻干后样本称重，阴凉干燥处保存。
[0038]
上述方法所制备的一种莲房果胶，其多糖结构特征为单糖组成摩尔比为半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸＝95.4:4.6，分子量为73.6kda，莲房果胶的主链以
→
4)-α-galpa-(1
→
为连接，末端为半乳糖醛酸，是一种hg型果胶。莲房果胶的结构式为：
[0039][0040]
经测定，一种莲房果胶的总糖含量为93.26％，单糖组成主要为半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。
[0041]
1、对实施例1中所得的产品进行红外分析，得到其主要功能基团和部分连接构型特征。结果请参阅图1，图1为本发明所述的一种莲房果胶的红外光谱图。如图1所示，莲房果胶为主要含有α型糖苷键的聚糖；甲基化分析能够提供多糖分子中糖残基类型和比例，结果请参阅表1：
[0042][0043]
表1
[0044]
如表1所示，在本发明所述的莲房果胶中，gala的连接方式主要以1,4-gala为主，且在c3上甲基化，在c6上乙酰化。
[0045][0046]
表2
[0047]
二维核磁共振分析可以确定不同糖残基及其连接方式，其具体碳氢归属请参阅图2、图3和表2，表2为一种莲房果胶核磁共振氢谱和碳谱的化学位移归属表，图2为本发明所述的一种莲房果胶的一维核磁共振波谱图(1h-nmr，
13
c-nmr)；图3为本发明所述的一种莲房果胶的二维核磁共振波谱图(1h-1
h cosy图，1h-13
c hsqc图，1h-13
c hmbc图，1h-1
h noesy图)，结合甲基化结果，最终推断出糖链结构。
[0048]
对该果胶多糖进行扫描电镜分析，结果请参阅图4，图4为本发明所述的一种莲房果胶的扫描电镜图。如图4所示，本发明所述的莲房果胶呈大薄片状。
[0049]
2、对实施例1中所得的产品分别进行体外抗氧化活性的研究。
[0050]
测定abts、dpph、羟基自由基清除能力
[0051]
结果请参阅图5，图5为本发明所述的一种莲房果胶对自由基清除实验的结果图。如图5所示，该莲房果胶具有很好的自由基清除能力，且呈浓度依赖性。
[0052]
3、对实施例1中所得的产品分别进行免疫调节活性的研究
[0053]
(1)对raw 264.7细胞活力的分析
[0054]
在raw264.7中添加不同浓度的本发明所述的一种莲房果胶，后利用cck-8试剂盒，在450nm下测定吸光度并计算细胞存活率。结果请参阅图6，图6为本发明所述的一种莲房果胶对raw 264.7细胞活力的影响图。如图6所示，当多糖的浓度从400ng/ml增加到20μg/ml时,其对raw 264.7具有一定得增殖作用。
[0055]
(2)no释放含量测定
[0056]
利用no试剂盒对其促进raw264.7释放no含量进行测定。结果请参阅图7，图7为本发明所述的一种莲房果胶对no释放水平的影响图。如图7所示，当其质量浓度从400ng/ml增加到50μg/ml时，具有一定的免疫调节活性。
[0057]
实施例2
[0058]
本实施案例展示了本发明所述的一种莲房果胶与其他果胶的区别。不同的投料比、萃取温度及萃取时间可以得到不同分子量、不同类型的果胶。结果请参阅表3：
[0059][0060]
表3
[0061]
如表3所示，提取条件对果胶的制备具有重要的影响，本发明所述的一种莲房果胶的制备方法是采用1：10的料液比热水回流2h，得到的是一种中等分子量的果胶，其结构类型为hg型，区别于其他果胶。
[0062]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述的一种莲房果胶及其制备方法和应用，所得到的一种莲房果胶不仅具有明确的结构、良好的活性，可为开发莲房果胶的
药用价值奠定基础，而且具有良好的抗氧化活性以及免疫调节活性，具备制备多种疾病治疗药物应用价值。
[0063]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种莲房果胶，其特征在于：所述莲房果胶的分子量为65kda-80kda、所述莲房果胶中的单糖组成为半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，所述莲房果胶的主链以
→
4)-α-galpa-(1
→
为连接，末端为半乳糖醛酸；所述莲房果胶的结构式为：2.根据权利要求1所述的一种莲房果胶，其特征在于：所述半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为100：2～8。3.根据权利要求1所述的一种莲房果胶，其特征在于：所述n选自300～400之间。4.一种莲房果胶的制备方法，其特征在于，该方法包括：(1)粗制：取干燥的莲房，粉碎，获得莲房粉末，所述莲房粉末经乙醇回流两次脱脂后，经热水回流提取得到莲房水提液，再加入乙醇沉淀，大孔树脂脱色，得到莲房粗多糖；(2)精制：将所述莲房粗多糖上样到弱阴离子交换树脂，分别用2倍柱体积水和0.1m的盐溶液洗去除杂质，再用0.2m的盐溶液洗脱，洗脱液经减压浓缩及冷冻干燥，得到精制的莲房果胶。5.根据权利要求4所述的一种莲房果胶的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述大孔树脂的类型为ab-8、xad、d301中的任意一种。6.根据权利要求4所述的一种莲房果胶的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述弱阴离子交换树脂的基质为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。7.一种莲房果胶在制备治疗由氧化损伤引起的疾病的药物中的应用。8.一种莲房果胶在制备免疫调节药物中的应用。9.一种莲房果胶在制备食品和化妆品助剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种莲房果胶，其多糖结构特征为单糖组成，具体为半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，分子量为65-80kDa，其连接方式为


技术研发人员：李笃信 王嘉慧 袁树伟 孙江岑 张智毅 张真庆
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/19