一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法

1.本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种两步法制备壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的方法。


背景技术：

2.水凝胶是一类具有三维网状结构的高分子材料，可以吸收大量的水和生物液体。水凝胶由于其与细胞外基质相似的结构，被认为是一种理想的软组织支架材料，可以用于软骨再生，伤口敷料，皮肤支架、药物输送等领域。壳聚糖、透明质酸等天然聚多糖具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性，被认为是传递小分子、生物活性成分和治疗细胞的理想材料。天然多糖类水凝胶有广泛的应用前景，尤其以壳聚糖、透明质酸、纤维素、魔芋葡甘聚糖、海藻酸钠为主的聚多糖水凝胶在生物工程和制药领域应用广泛。与传统水凝胶相比，可注射水凝胶可以使用微小针头通过微创技术直接注射到目标病灶区域，与植入手术相比大幅度减少了操作难度，避免了进一步的组织损伤和功能丧失的问题。水凝胶的自愈性能表现在，水凝胶在受到外力作用损坏后，可以在外力移除后的几秒钟到几小时内部分或完全的恢复到原来的状态。这种自愈性能有助于延长材料使用寿命，恢复和保存其原始特性。
3.目前可注射自愈合水凝胶还存在着一些不足，例如，制备过程使用戊二醛等有毒交联剂，这类交联剂有一定的细胞毒性，限制了其在生物医用材料上的应用；大多数可注射自愈合水凝胶都需要对原料结构进行修饰来引入动态键或温敏结构，这通常是一个漫长而复杂的过程且还会影响水凝胶的生物相容性，目前对可注射水凝胶的研究多为温敏性水凝胶，该类水凝胶的保存受温度影响较大，温度较高就会变为凝胶，需要低温保存，运输和贮存的需求和费用较高。


技术实现要素：

4.本发明应对上述提到的可注射、自愈合水凝胶使用有毒交联剂影响生物相容性和原材料修饰过程复杂和贮存困难等问题，提供一种壳聚糖基可注射、自愈合水凝胶的制备方法，通过壳聚糖和透明质酸钠之间形成聚电解质复合物来制备水凝胶，通过氢键和静电相互作用来实现自愈合性，制备方法简单，且水凝胶制备过程中没有使用有毒交联剂，不需对原料进行改性，制备的冻干凝胶粉可在常温长时间贮存且运输方便，通过二次凝胶的方法简化了手术前的准备过程，操作简单，可用于填充不规则缺损，软骨修复，皮肤修复等。
5.本发明的技术方案为：
6.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到醋酸水溶液中制备壳聚糖醋酸溶液，使用蠕动泵将透明质酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，边滴加边搅拌，混合溶液中有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该溶液进行抽滤和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
8.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在冰箱中预冷冻，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
9.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末加入到交联溶剂中制备得到溶胶，静置6～30min后溶胶会变为水凝胶，得到二次水凝胶产品。
10.进一步地，步骤(1)透明质酸钠溶液和壳聚糖醋酸水溶液的浓度为1mg/ml～5mg/ml，醋酸水溶液的质量分数为0.5％～3％，透明质酸钠溶液和壳聚糖醋酸水溶液混合时，壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1～2.5:1。
11.进一步地，步骤(1)替换为：将透明质酸钠加入水中制备透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中加入硫酸氢钠形成含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到醋酸水溶液中制备壳聚糖醋酸溶液，将含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后抽滤和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；其中所用醋酸水溶液的质量分数为0.5％～3％扩大范围含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液和壳聚糖醋酸溶液的浓度为1mg/ml～5mg/ml，壳聚糖醋酸溶液和含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠和硫酸氢钠的负离子之和(羧基和硫酸氢根)的摩尔比为1:1～2.5:1。
12.进一步地，步骤(1)采用蠕动泵将透明质酸钠溶液或含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速率为1～10r/min。
13.进一步地，步骤(2)中预冷冻温度为-40～-60℃，时间6～16h；冷冻干燥时间为12～36h。
14.进一步地，步骤(3)中交联溶剂为氯化钙溶液或氯化钙和甘氨酸的混合溶液，氯化钙溶液的浓度为0.05m～0.5m；氯化钙和甘氨酸的混合溶液的浓度为0.05m～0.5m，其中氯化钙与甘氨酸的物质的量比为1:1～1:3，冻干凝胶粉末占交联溶剂的质量分数为5wt％～10wt％。
15.本发明的有益效果：
16.(1)本发明初始水凝胶仅靠正负离子间的相互作用形成，不需要交联剂，主要原料为壳聚糖和透明质酸钠或硫酸氢钠和透明质酸钠的混合物，不需要对壳聚糖和透明质酸钠进行改性，得到的水凝胶的生物相容性好且初始水凝胶有一定的粘性和抗菌性。
17.(2)本发明制备的冻干凝胶粉末，可以常温长时间贮存，运输方便、降低了运输成本，常温长时间贮存对再次形成的水凝胶性能影响不大。
18.(3)本发明通过两次凝胶的方法实现了水凝胶的可注射性和自愈合性，制备二次凝胶的操作简单，凝胶化时间适中，可以简化手术前的准备过程，便于手术操作。
19.(3)本发明制备工艺简单、绿色环保、安全高效，有广泛的应用前景，可用于软骨修复，皮肤缺口修复，伤口敷料，填充不规则缺损等。
附图说明
20.图1为实施例3初始水凝胶冻干图；
21.图2为实施例3的注射性能图；
22.图3为实施例3的二次水凝胶图；
23.图4为实施例3的自愈合性能图((a)二次水凝胶图，(b)二次水凝胶切块图，(c)0min自愈合图，(d)16h自愈合图，(位置是垂直方向))
24.图5为实施例3的壳聚糖、透明质酸酸钠、初始水凝胶和二次水凝胶的ft-ir谱图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，但是本发明的保护范围并不限于下述实施例。
26.实施例1
27.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
29.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
30.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.05m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置30分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
31.实施例2
32.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
33.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
34.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
35.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.1m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置17分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
36.实施例3
37.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
38.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
39.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真
空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
40.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.13m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置8分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
41.实施例4
42.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
43.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
44.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
45.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.15m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置7分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
46.实施例5
47.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
48.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
49.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
50.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.13m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为10wt％，静置6分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
51.实施例6
52.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
53.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为1％的醋酸水溶液中制备得到浓度为2.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为2.5：1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为6.2:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
54.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻16h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥36h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
55.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.15m氯化钙和甘氨酸的混合溶液中得
到溶胶，其中氯化钙与甘氨酸的物质的量比为1:1，冻干凝胶粉末占氯化钙和甘氨酸的混合溶液的质量分数为10wt％，静置7分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
56.实施例7
57.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
58.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，此时壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1，壳聚糖的正离子(氨基)与透明质酸钠溶液的负离子(羧基)的摩尔比为2.5:1，边滴加边搅拌混合溶液，有白色颗粒状聚电解质复合物形成，滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
59.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻16h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
60.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.13m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为5wt％，静置24分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
61.实施例8
62.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中在加入硫酸氢钠得到含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖醋酸溶液中的正离子(氨基)与含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中的负离子(透明质酸钠的羧基和硫酸氢钠的硫酸氢根)之和的摩尔比为1:1，边滴加边搅拌混合溶液有白色颗粒状聚电解质复合物形成，溶液滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
64.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
65.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.13m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置11分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
66.实施例9
67.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
68.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为1mg/ml的透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中在加入硫酸氢钠得到含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖醋酸溶液中的正离子(氨基)与含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中的负离子(透明质酸钠的羧基和硫酸氢钠的硫酸氢根)之和的摩尔比为1.6:1，边滴加边搅拌混合溶液有白色颗粒状聚电解质复合物形成，溶液滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、和超
纯水冲洗，得到初始水凝胶；
69.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
70.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.13m氯化钙溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置12分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
71.实施例10
72.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
73.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为2mg/ml的透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中在加入硫酸氢钠得到含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为0.5％的醋酸水溶液中制备得到浓度为2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖醋酸溶液中的正离子(氨基)与含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中的负离子(透明质酸钠的羧基和硫酸氢钠的硫酸氢根)之和的摩尔比为2:1，边滴加边搅拌混合溶液有白色颗粒状聚电解质复合物形成，溶液滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
74.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
75.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.5m氯化钙溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙溶液的质量分数为8wt％，静置6分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
76.实施例11
77.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
78.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为2.5mg/ml的透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中在加入硫酸氢钠得到含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到质量分数为1.6％的醋酸水溶液中制备得到浓度为2.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以1r/min的速率将等体积的含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖醋酸溶液中的正离子(氨基)与含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中的负离子(透明质酸钠的羧基和硫酸氢钠的硫酸氢根)之和的摩尔比为1:1，边滴加边搅拌混合溶液有白色颗粒状聚电解质复合物形成，溶液滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
79.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-40℃冰箱中预冷冻12h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥12h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
80.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.05m氯化钙和甘氨酸混合溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙和甘氨酸混合溶液的质量分数为5wt％，其中氯化钙与甘氨酸的物质的量比为1:2，静置25分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
81.实施例12
82.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
83.(1)初始水凝胶的制备：将透明质酸钠加入水中制备得到浓度为5mg/ml的透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中在加入硫酸氢钠得到含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳
聚糖加入到质量分数为3％的醋酸水溶液中制备得到浓度为5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蠕动泵以5r/min的速率将等体积的含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖醋酸溶液中的正离子(氨基)与含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液中的负离子(透明质酸钠的羧基和硫酸氢钠的硫酸氢根)之和的摩尔比为1:1，边滴加边搅拌混合溶液有聚电解质复合物形成，溶液滴加结束后对该复合溶液进行抽滤、和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；
84.(2)冻干凝胶粉末的制备：将初始水凝胶放在-60℃冰箱中预冷冻12h，然后放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥12h，得到冻干水凝胶，将冻干水凝胶研磨得到冻干凝胶粉末；
85.(3)二次凝胶的制备：将冻干凝胶粉末溶于0.5m氯化钙和甘氨酸混合溶液中得到溶胶，冻干凝胶粉末占氯化钙和甘氨酸混合溶液的质量分数为5wt％，其中氯化钙与甘氨酸的物质的量比为1:3，静置18分钟后溶胶会变为水凝胶，得到二次凝胶。
86.从实施列1、实施例2、实施例3和实施例4看出，当冻干凝胶粉末的含量相同时，提高氯化钙溶液的浓度可以提高二次凝胶化速率，氯化钙浓度从0.05m增加到0.13m时凝胶化时间减少幅度很大，从30min减到了8min，氯化钙浓度从0.13m增加到0.15m时，凝胶化时间只减少了1min，氯化钙溶液浓度过高一方面，会对细胞数量和细胞完整性产生负面影响，从而影响细胞的增殖和分化能力，另一方面还会增加细胞外渗透压从而导致细胞收缩，从这上述方面考虑，在凝胶化时间相差不大的情况下，要尽量减少氯化钙的浓度。
87.实施例7、实施例3、实施例5的氯化钙溶液的浓度均为0.13m，冻干凝胶粉末的含量分别为5％、8％和10％，凝胶化时间分别为24min，8min和6min，随着凝胶粉末含量的提高，凝胶化时间大幅度提高，但随着凝胶粉末含量的提高，溶胶状态时的黏度也随之提高，黏度的提高会影响注射性能和形成的水凝胶的结构均匀性。
88.实施例3、实施例9、实施例8中添加了不同的硫酸氢钠，60％变形量时的抗压强度分别为0.0178mpa、0.0276mpa、0.0298mpa，随着硫酸氢钠添加量的增加，阴离子含量逐渐增加，正负离子摩尔比降低，抗压强度逐渐提高，造成该结果的原因可能是硫酸氢根可以和壳聚糖的氨基反应，形成新的交联位点，提高水凝胶的机械强度。
89.图1是实施例3初始水凝胶冷冻干燥后的形貌图，可以看出是小颗粒聚集在一起，聚集原因是初始水凝胶自身有一定的黏性，且经过抽滤使其粘连在一起。
90.图2为实施例3的注射性能图，由图可以看出，在二次凝胶化过程中，水凝胶有良好的注射性能，可用针管进行溶胶的注射形成较为复杂的形状，注射后可以快速形成水凝胶，图中字体的笔画粗细有差别，是由于手动注射，注射速率不能完全保持一致导致了字体笔画粗细不均匀。
91.图3为实施例3制备的二次水凝胶的形貌图，二次水凝胶内部没有明显颗粒，形成了均匀的凝胶，在填充入模具过程中有很好的流动性。
92.图4为实施例3的自愈合性能图，为了便于对照，实施例3在氯化钙溶剂中加入0.05g甲基橙粉末，其他步骤条件不变，得到橙色的水凝胶，将按照实施例3方法制备得到的水凝胶和橙色水凝胶两块颜色不同的水凝胶分别切成两半，在从两块水凝胶中各取一半，将两个半块水凝胶拼在一起，拿镊子夹起后可以看到水凝胶没有从拼接处分开，如图4(a)二次水凝胶图、(b)二次水凝胶切块图、(c)0min自愈合图、(d)16h自愈合图所示，放置16h后可以看到白色那半水凝胶变为橙色，拼接处的缝隙变得模糊。
93.图5为实施例3壳聚糖cs、透明质酸钠sh和步骤(2)的冻干凝胶粉末cs/sh和产物二次水凝胶cs/sh-cacl2的ft-ir谱图，由图可见，cs特征峰3415cm-1
处为n-h和o-h伸缩振动峰，1617cm-1
处为酰胺ⅰ带c＝o伸缩振动和酰胺ⅱ带n-h弯曲振动重叠峰，1383cm-1
处是-ch3的对称振动峰，1156cm-1
和1085cm-1
处为c-o-c的伸缩振动峰；在sh的ft-ir谱图中，观察到3423cm-1
处吸收带为-oh的伸缩振动峰，1636cm-1
处是羧基c＝o伸缩振动峰，1153cm-1
和1077cm-1
处是c-o-c的伸缩振动峰；而在cs/sh的ft-ir谱图中，原本对应cs和sh中的c＝o的吸收峰(1617cm-1
和1636cm-1
)发生蓝移(1644cm-1
)，代表着基团更加稳定，这可以解释为sh的羧基与cs的氨基发生静电相互作用，形成稳定的聚电解质复合物，在cs/sh-cacl2的ft-ir谱图中，cs/sh中1644cm-1
处的峰红移到1640cm-1
处，可能是研磨破坏了部分cs与sh的结合，二次凝胶又形了新的氢键。

技术特征：
1.一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将透明质酸钠加入水中制备透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到醋酸水溶液中制备壳聚糖醋酸溶液，将透明质酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后抽滤和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；(2)将初始水凝胶进行预冷冻，再冷冻干燥，得到冻干水凝胶，研磨得到冻干凝胶粉末；(3)将冻干凝胶粉末加入到交联溶剂中制备得到溶胶，静置6～30min到二次水凝胶产品。2.根据权利要求1所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)透明质酸钠溶液和壳聚糖醋酸水溶液的浓度为1mg/ml～5mg/ml，醋酸溶液的质量分数为0.5％～3％，壳聚糖与透明质酸钠的质量比为1:1～2.5:1。3.根据权利要求1所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)替换为：将透明质酸钠加入水中制备透明质酸钠溶液，透明质酸钠溶液中还加入硫酸氢钠形成含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液，将壳聚糖加入到醋酸水溶液中制备壳聚糖醋酸溶液，将含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后抽滤和超纯水冲洗，得到初始水凝胶；其中透明质酸钠溶液和壳聚糖醋酸溶液的浓度为1mg/ml～5mg/ml，醋酸水溶液的质量分数为0.5％～3％，壳聚糖醋酸溶液中的氨基与透明质酸钠和硫酸氢钠的羧基和硫酸氢根之和的摩尔比为1:1～2.5:1。4.根据权利要求2或3所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)采用蠕动泵将透明质酸钠溶液或含有硫酸氢钠的透明质酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速率为1～10r/min。5.根据权利要求1所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)预冷冻温度为-40～-60℃，时间6～16h；冷冻干燥时间为12～36h。6.根据权利要求1所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中交联溶剂为氯化钙溶液或氯化钙和甘氨酸的混合溶液，氯化钙溶液的浓度为0.05～0.5mol/l；氯化钙和甘氨酸的混合溶液的浓度为0.05～0.5mol/l，其中氯化钙与甘氨酸的物质的量比为1:1～1:3。7.根据权利要求1所述壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)冻干凝胶粉末占交联溶剂的质量分数为5％～10％。

技术总结
本发明公开一种壳聚糖基可注射自愈合水凝胶的制备方法，将透明质酸钠溶液或透明质酸钠和硫酸氢钠的混合溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后抽滤和冲洗，得到初始水凝胶；将初始水凝胶进行预冷冻，再冷冻干燥，得到冻干水凝胶，研磨得到冻干凝胶粉末；将冻干凝胶粉末加入到溶剂中制备得到溶胶，静置后得到二次水凝胶产品，冻干凝胶粉末在二次凝胶化过程有很好的可注射性，且得到的二次水凝胶具有自愈合性，本发明解决了一般水凝胶贮存困难的问题，制备的凝胶粉末在室温下可长时间稳定贮存，二次凝胶化过程操作简便，水凝胶具有高生物相容性和安全性，具有广泛的临床应用前景。临床应用前景。


技术研发人员：冷崇燕 肖佳敏 王建亮 许义喆 王震东 张国人
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/19