弯曲乳杆菌LC02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用的制作方法

弯曲乳杆菌lc02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及弯曲乳杆菌lc02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.过敏是过敏原进入机体后，刺激机体产生抗体，当过敏原再次进入机体，与机体内的抗体结合，从而诱发机体发生过敏的一种现象。常见的过敏性疾病有过敏性鼻炎，患者表现为打喷嚏，流鼻涕，鼻部瘙痒。还有过敏性哮喘，接触过敏原后出现哮喘，甚至呼吸困难。还有比较常见的过敏就是皮肤上发生风团、红斑、丘疹、甚至糜烂、渗出，严重的会导致过敏性休克。
3.为了减缓过敏反应的发生，除了建议患者避免过敏原外，临床上对于治疗过敏疾病的药物大多采用抗组织胺(antihistamine)或是副肾皮质素(又称类固醇)，用以减缓病患对于过敏原所产生的过敏反应。虽然不论使用抗组织胺或是副肾皮质素虽皆可对于过敏性疾病达到显著的疗效，但长期使用下或是患者未遵循医嘱下而任意使用，都会对于人体产生不良影响的副作用。益生菌对过敏性疾病如特应性皮炎、过敏性鼻炎、食物过敏等的预防和治疗作用也得到了大量的研究。但由于益生菌的功能具有菌株特异性，只有特定菌株才具有抑制过敏的功能。
4.因此，提供弯曲乳杆菌lc02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了弯曲乳杆菌lc02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
6.肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶(tryptase)是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激活和脱颗粒的标志。tryptase通常只少量地分泌到体液中，当过敏引起肥大细胞脱颗粒时大量进入体液。类胰蛋白酶的急性过敏反应阳性反应和阴性反应的预测准确率分别为92.6％和54.3％，而且tryptase的半衰期为2小时，因此，tryptase的表达水平常作为类过敏反应的检测标志物之一。
7.斑马鱼的肥大细胞，其结构与功能与哺乳类动物相似，参与机体的免疫反应和过敏反应。n-苯甲酰-dl-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(bapna)是tryptase特异性底物，可以检测斑马鱼体内的tryptase表达水平。检测某物质诱导斑马鱼体内24小时内的tryptase表达水平，可以定量分析此物质的致敏性和抗过敏功效。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一株弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)lc02，其保藏编号为cgmccno.22986，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月30日，分类命名为弯曲乳杆菌lactobacillus curvatus。
10.进一步，所述的弯曲乳杆菌lc02在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
11.进一步，所述的弯曲乳杆菌lc02在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用。
12.进一步，所述弯曲乳杆菌lc02为菌悬液。
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了弯曲乳杆菌lc02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，弯曲乳杆菌lc02是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，弯曲乳杆菌lc02在体内能够显著抑制compoud48/80刺激斑马鱼分泌tryptase，能够抑制体内肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒，具备应用于体内治疗或预防过敏反应的潜能，此为利用弯曲乳杆菌lc02开发预治疗或预防过敏反应的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为本发明弯曲乳杆菌lc02在mrs琼脂平板上的菌落形态；
16.图2附图为本发明弯曲乳杆菌lc02对compoud 48/80刺激斑马鱼分泌tryptase的表达水平的影响；
17.图3附图为本发明弯曲乳杆菌lc02对compoud 48/80刺激斑马鱼分泌tryptase的抑制率。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.色甘酸钠和n-苯甲酰-dl-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(bapna)购自北京华威锐科化工有限公司，compoud 48/80购自美国sigma公司。
20.实施例1弯曲乳杆菌lc02分离、鉴定及保藏
21.(1)分离：
22.1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管中，用1ml无菌枪头充分吹打混匀，备用。
23.2)在6个无菌1.5ml离心管中各加入900μl的无菌生理盐水。
24.3)采用梯度稀释的方法，将样品稀释到10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
。
25.4)从装有10-4
样品稀释液的离心管中吸取100μl的样品稀释液分别接种于mrs固体培养基、bs固体培养基上，将100μl的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
26.5)重复上个步骤，完成10-5
、10-6
、10-7
稀释梯度的稀释涂布。
27.6)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
28.7)用接种环挑取平板上的单菌落划线至mrs固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
29.8)将平板上的纯菌落接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
30.(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组dna，通过pcr技术利用16s rdna通用引物27f和1492r扩增16s rdna全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
31.其中，通用引物27f和1492r的引物序列如下：
32.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；seq id no.1；
33.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’；seq id no.2。
34.实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16s rdna鉴定，其中菌株lc02被鉴定为弯曲乳杆菌，其16s rdna序列如seq id no.3所示。
35.cttagacggctggctccgaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggttttaagagattagctaaacctcgcggtctcgcgactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactttgtccccgaagggaaagctctatctctagagtggtcaaaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcactacctgatcagttactatcaaatacgttcttctccaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgattaccctctcaggtcggctatgcatcacggtcttggtgagcctttacctcaccaactaactaatgcaccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaaaccatctttcaaccttgcaccatgcggtgctaggttttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccactttagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcactcaaatgttatcaatcagaagcaagcttcttcaatctaacgagagtgcgtcgactgcatgtatag；seq id no.3。
36.菌株lc02单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白
色、呈圆形、边缘整齐，表面光滑(图1)。菌株lc02已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月30日，分类命名为弯曲乳杆菌lactobacillus curvatus，保藏编号为cgmccno.22986。
37.实施例2弯曲乳杆菌lc02菌悬液(菌体)的制备
38.将弯曲乳杆菌lc02活化培养后接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经pbs两次洗涤后，将菌体用pbs重新悬浮，调整细胞浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml得到菌悬液(菌体)。
39.实施例3弯曲乳杆菌lc02对compoud 48/80刺激斑马鱼分泌tryptase的影响
40.挑选发育至5dpf(days post fertilization)的健康野生型ab系斑马鱼置于96孔细胞培养板中，10条/孔。实验设置正常组、模型组、干预组(阳性对照组、1
×
104cfu/ml弯曲乳杆菌lc02、1
×
105cfu/ml弯曲乳杆菌lc02、1
×
106cfu/ml弯曲乳杆菌lc02)、溶剂调零组，每组设置6个复孔。正常组加入pbs，模型组加入pbs，阳性对照组加入色甘酸钠溶液(100μg/ml)，1
×
104cfu/ml弯曲乳杆菌lc02干预组加入1
×
104cfu/ml弯曲乳杆菌lc02，1
×
105cfu/ml弯曲乳杆菌lc02干预组加入1
×
105cfu/ml弯曲乳杆菌lc02，1
×
106cfu/ml弯曲乳杆菌lc02干预组加入1
×
106cfu/ml弯曲乳杆菌lc02，溶剂调零组(未加斑马鱼)加入pbs，每孔100μl，置于生化培养箱28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后，正常组加入150μl pbs，模型组、阳性对照组、弯曲乳杆菌lc02干预组(1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml)、溶剂调零组分别加入compoud 48/80(8μg/ml)，每孔150μl，28℃孵育2h后，每孔取150μl溶液分别置于2ml离心管中，同时每个离心管中加入150μl bapna溶液(20mg/ml)，37℃孵育48h后，每个离心管取200μl溶液置于96孔细胞培养板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度(od值)。tryptase表达水平和抑制率公式如下：
[0041][0042][0043]
采用spss 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x
±
sd数据表示，用t-检验分析，与正常组相比：
####
p《0.001；用单因素方差分析，与模型组相比：*p《0.05，**p《0.01，****p《0.001。
[0044]
tryptase表达水平和抑制率结果见图2和图3，结果显示，与正常组(100.00
±
10.81％)相比，模型组的tryptase表达水平(342.14
±
23.43％)明显增加，说明本次compoud 48/80诱导过敏模型建立成功。
[0045]
阳性对照组(色甘酸钠)tryptase表达水平为134.12
±
18.69％，tryptase抑制率为85.91
±
7.72％，与模型组(tryptase表达水平：342.14
±
23.43％)相比差异性显著(p《0.001)。因此，色甘酸钠具有抗过敏作用，与临床结果一致，说明本次抗过敏试验有效。弯曲乳杆菌lc02浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml时，斑马鱼体内的tryptase表达水平分别为256.76
±
32.24％、235.22
±
39.24％、152.83
±
19.86％，同时tryptase抑制率分别为35.26
±
13.32％、44.16
±
16.20％、78.18
±
8.20％，与模型组(tryptase表达水
平：342.14
±
23.43％)相比差异性显著(p《0.01)，表现出良好的抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的益生功效。因此，上述结果表明弯曲乳杆菌lc02具有预防和/或缓解过敏反应的功效。
[0046]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一株弯曲乳杆菌(lactobacilluscurvatus)lc02，其特征在于，其保藏编号为cgmccno.22986。2.权利要求1所述的弯曲乳杆菌lc02在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。3.根据权利要求2所述的弯曲乳杆菌lc02在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，其特征在于，所述弯曲乳杆菌lc02为菌悬液。4.权利要求1所述的弯曲乳杆菌lc02在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的弯曲乳杆菌lc02在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用，其特征在于，所述弯曲乳杆菌lc02为菌悬液。

技术总结
本发明公开了弯曲乳杆菌LC02及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，属于微生物技术领域。弯曲乳杆菌LC02的保藏编号为CGMCCNo.22986。弯曲乳杆菌LC02在体内能显著抑制Compoud48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase，能够抑制体内肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒，具备应用于体内治疗或预防过敏反应的潜能。本发明公开的弯曲乳杆菌LC02在治疗或预防过敏反应方面有巨大的潜在应用前景。方面有巨大的潜在应用前景。方面有巨大的潜在应用前景。


技术研发人员：陈涛 郑康帝 陈丹 马燕 张召
受保护的技术使用者：广东一元兰欣生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/7/19