一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统的制作方法

1.本技术涉及医学生物检测领域，特别涉及一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统。


背景技术：

2.强心苷类药物是一类有强心作用的甾体苷类化合物，如地高辛、去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷、毒毛花苷k等，为na+-k+-atp酶抑制剂，临床上主要用于心力衰竭及某些心律失常。强心苷类药物因化学结构的取代基不同及药动学的差异，有强弱、快慢、久暂的区别。
3.临床上治疗充血性心力衰竭常用的强心苷类药物有地高辛和洋地黄毒苷，其中地高辛仅在非常窄的血清浓度范围内有效，由于60％～90％的地高辛通过尿液排出，因此当肾功能受损时，多次给药可能达到中毒浓度。在患有充血性心力衰竭的病人中，地高辛的高中毒浓度通常与低治疗剂量浓度难以区分，从而使治疗复杂化，因此高效监测地高辛血药浓度十分必要。洋地黄毒苷口服吸收率高，作用慢而持久，在人体内，容易累积，治疗量和中毒量之间相差很小。洋地黄毒苷的毒性是临床中常见且严重的问题。病人代谢洋地黄毒苷的方式也千差万别，因此需要针对每位病人确定不同的剂量。为保持治疗效果，同时避免中毒，必须定期监测血清中的洋地黄毒苷浓度。
4.目前，强心苷类药物检测方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法等。但是，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行快速检测、成本高等缺点，因此，以上方法均难以普及和应用。


技术实现要素：

5.针对现有技术的上述缺陷，本技术实施方式主要解决的技术问题是提供一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统，能够快速、准确、直接的测定血清中强心苷类药物浓度，有效地避免剂量不足造成的治疗效果不佳或用药过量造成的中毒的现象。
6.第一方面，本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂：所述第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20；所述第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。
7.在一些实施例中，所述第一缓冲溶液ph为6.0～8.0，所述第一缓冲溶液为tris缓冲液。
8.在一些实施例中，所述第二缓冲溶液ph为5.5～7.5，所述第二缓冲溶液为mes缓冲液。
9.在一些实施例中，所述第一缓冲溶液浓度为400mmol/l的tris缓冲液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.8％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。
10.在一些实施例中，所述第二缓冲溶液浓度为400mmol/l的mes缓冲液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。
11.在一些实施例中，所述超顺磁性磁微粒为亲水性磁微粒，所述磁微粒的粒径为1.5μm～3μm。
12.在一些实施例中，所述磁微粒的浓度为200μg/ml～600μg/ml。
13.在一些实施例中，所述吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物的浓度为4ng/ml～10ng/ml。
14.在一些实施例中，所述强心苷类药物包括：地高辛、去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷和毒毛花苷k。
15.第二方面，本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的系统，所述系统包括全自动化学发光免疫分析仪、清洗液、预激发液、激发液以及如第一方面所述的试剂盒。
16.区别于相关技术的情况，本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统，该试剂盒包括：第一试剂和第二试剂：所述第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20；所述第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。本技术提供的试剂盒，能够实现快速、准确、直接测定血清中强心苷类药物浓度，可在临床上为病人提供有价值的信息，从而有助于调整用药计量，使治疗达到最佳效果，有效地避免剂量不足造成的治疗效果不佳或用药过量造成的中毒现象。
附图说明
17.一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
18.图1是本技术实施例提供的一种试剂盒与对照试剂盒的散点图；
19.图2是本技术实施例提供的一种试剂盒与对照试剂盒的bland-altam图。
具体实施方式
20.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
21.需要说明的是，如果不冲突，本技术实施例中的各个特征可以相互组合，均在本申
请的保护范围之内。
22.除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本技术。此外，本文所采用的“第一”、“第二”等字样并不对数据和执行次序进行限定，仅是对功能和作用基本相同的相同项或相似项进行区分。
23.本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂：
24.所述第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。
25.所述第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。
26.超顺磁性是指由铁磁或亚铁磁纳米(20nm至50nm)单畴颗粒组成的集合体，这些单畴颗粒都具有自己的磁化强度，它们的磁化方向是混乱的，因而整体的磁化强度为零。在外磁场的作用下，每个单畴颗粒的磁化强度都转向磁场，如同顺磁物质，但它的磁化率要比顺磁的大，约大1000倍。当外加磁去掉后，超顺磁体的磁化强度也随之变为零，没有磁滞。物质的这种性质称为超顺磁性。
27.可以理解的是，所述试剂盒中超顺磁性的磁微粒，在外加磁场作用下，磁微粒会快速聚拢吸附，样本中的强心苷类药物可结合到超顺磁性磁微粒共价偶联的单克隆抗强心苷类药物的抗体上，形成复合物，撤去外加磁场时，磁微粒会重新分散，未结合的物质被分离，且不会有磁滞。
28.在使用本技术的试剂盒进行检测样本中的强心苷类药物时，通过待测样本中的强心苷类药物与吖啶酯标记强心苷类药物或其衍生物竞争，结合到超顺磁性磁微粒共价偶联的单克隆抗强心苷类药物的抗体上，形成复合物，通过磁分离、清洗除去未结合的物质，再加入预激发液和激发液后，吖啶酯被激发发光，发光强度与样本中强心苷类药物的含量成反比，从而定量分析待测样本中强心苷类药物的含量。
29.强心苷类药物是一类有强心作用的甾体苷类化合物，如地高辛、去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷、毒毛花苷k，其分子由一个醇基或醇样基团(配基、苷元或甙元)结合于数量不等的糖分子而构成，为na+-k+-atp酶抑制剂，临床上主要用于心力衰竭及某些心律失常。
30.本技术提供的试剂盒，基于化学发光法，能够实现快速、准确、直接测定血清中强心苷类药物浓度，可在临床上为病人提供有价值的信息，从而有助于调整用药计量，使治疗达到最佳效果，有效地避免剂量不足造成的治疗效果不佳或用药过量造成的中毒现象。
31.在一些实施例中，所述第一缓冲溶液ph为6.0～8.0，所述第一缓冲溶液为tris缓冲液。
32.在一些实施例中，所述第二缓冲溶液ph为5.5～7.5，所述第二缓冲溶液为mes缓冲液。
33.在一些实施例中，所述第一缓冲溶液浓度为400mmol/l的tris缓冲液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.8％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。在实际应用中，第一缓冲液中的tris缓冲液的浓度、牛血清白蛋白的体积百分比浓度、叠氮钠的体积百分比浓度、吐温-20的体积百分比浓度可以取本技术提供范围内的任意中间值，在此不需拘泥于本实施例中的限定。
34.在一些实施例中，所述第二缓冲溶液浓度为400mmol/l的mes缓冲液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。在实际应用中，第二缓冲液中的mes缓冲液的浓度、牛血清白蛋白的体积百分比浓度、叠氮钠的体积百分比浓度、吐温-20的体积百分比浓度可以取本技术提供范围内的任意中间值，在此不需拘泥于本实施例中的限定。
35.在一些实施例中，所述超顺磁性磁微粒为亲水性磁微粒，所述磁微粒的粒径为1.5μm～3μm。
36.磁性微粒是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料。因其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。因此，可将抗原、抗体、酶、核酸、寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面。
37.本技术中，待测样本中的强心苷类药物与吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，竞争结合到超顺磁微粒共价偶联的单克隆抗强心苷类药物抗体上，形成复合物，通过磁分离、清洗除去未结合的物质，用于后续测定待测样本中强心苷类药物的含量。
38.在一些实施例中，所述磁微粒的浓度为200μg/ml～600μg/ml。
39.在一些实施例中，所述吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物的浓度为4ng/ml～10ng/ml。其中，吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质。
40.在一些实施例中，所述强心苷类药物包括：地高辛、去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷和毒毛花苷k。
41.本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的系统，所述系统包括全自动化学发光免疫分析仪、清洗液、预激发液、激发液以及上述所述的试剂盒。
42.化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种标记免疫测定技术。化学发光法检测易于实现自动化，检测结果重现性好，灵敏度较高，为目前应用最广泛的检测方法。本技术在常用的强心苷类药物检测方法的基础上，提供一种基于化学发光法用于检测强心苷类药物的系统。
43.通过使用所述试剂盒和配套的全自动化学发光免疫分析仪，检测待测样本血清中强心苷类药物浓度，检测灵敏度高，结果重现性好，并且操作简单，能够进一步节约检测成本和检测时间。
44.本技术实施例还提供了一种检测强心苷类药物的方法，所述方法使用如上述第一方面任一项所述的试剂盒，所述方法包括：
45.步骤s1：启动全自动化学发光免疫分析仪，等待使用；
46.步骤s2：将10μl待测样本加入反应杯中，加入50μl第一试剂和50μl第二试剂，混匀后在37℃下孵育10分钟；
47.步骤s3：磁分离，用300μl清洗液重复4次，清洗除去步骤s2中未结合的物质；
48.步骤s4：加入100μl预激发液和100μl激发液后，将待测样本放入全自动化学发光
免疫分析仪中检测发光信号；
49.步骤s5：通过标定曲线，计算出待测样本中强心苷类药物的含量。
50.下面，结合具体实施例，对试剂盒检测血清中强心苷类药物浓度使用全自动化学发光免疫分析仪进行性能评价。
51.实施例1：一种检测洋地黄毒苷的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。其中，第一试剂包括：含400μg/ml粒径1.5μm共价偶联小鼠单克隆抗洋地黄毒苷抗体的磁微粒，ph＝7.2，浓度为50mmol/l的tris缓冲液，该tris缓冲液包括：体积百分比浓度为0.8％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。
52.第二试剂包括：含6ng/ml吖啶酯标记洋地黄毒苷，ph＝6.0，浓度为50mmol/l的mes缓冲液，该mes缓冲液包括：体积百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。
53.对本技术实施例1的一种检测洋地黄毒苷检的试剂盒进行分析及性能评估。采用洋地黄毒苷工作校准品，配合全自动化学发光免疫分析仪，对洋地黄毒苷的检测试剂盒进行校准。
54.(1)空白限的确定和检出限的确定
55.根据clsi文档ep17-a2中空白限和检出限的评估方法，对试剂盒空白限和检出限进行评估。选择5个空白样本和5个低浓度水平样本，每个样本进行4次重复测量，连续3天。
56.表1空白样本检测结果
[0057][0058][0059]
表2低浓度水平样本检测结果
[0060][0061]
计算空白限：空白样本结果呈非正态分布，适用非参数分析法计算空白限，将数据由小到大排列，依据排列好的数据估计第95百分位数所在位置为[60
×
(95/100)+0.5]的值，如果这个值为非整数则进行线性插入。经计算得出空白限lob＝1.93ng/ml。
[0062]
计算检出限：检出本结果呈非正态分布，适用非参数分析法计算检出限，计算公式lod＝lob+d
s-β
，d
s-β
是低浓度水平样本测定中位数和第5百分位数值的间距。经计算得出检出限lod＝2.87ng/ml。
[0063]
(2)精密度的确定
[0064]
根据clsi文档ep05-a3中精密度的评估方法，对试剂盒精密度进行评估。实验设计遵循经典的20
×2×
2设计：使用一个测量系统，测试20天，每天测试2批，每批测试2次。
[0065]
表3精密度评估计算结果
[0066][0067]
表3列出了精密度评估计算结果。实验结果显示本技术的试剂盒具有≤7％ cv的实验室内精密度。
[0068]
与国外洋地黄毒苷试剂盒进行临床比对。将本技术实施例1的一种洋地黄毒苷检
测试剂盒作为考核试剂，与西门子医学诊断公司生产的洋地黄毒苷测定试剂盒(直接化学发光法)作为对照试剂，同时对184例血清样本进行检测，比对结果如下：
[0069]
(1)回归分析和散点图
[0070]
以对照试剂为自变量x，考核试剂为应变量y，计算简单线性回归方程，并计算回归系数b和截距a的标准误和置信区间，并进行检验，建立假设：
[0071]
回归模型f检验和回归系数b的t检验(检验意义相同)：
[0072]
h0：两种试剂无直线关系，h1：两种试剂直线关系成立，α＝0.05。
[0073]
截距a的t检验：
[0074]
h0：截距与0值无显著性差异，h1：截距与0值有显著性差异，α＝0.05。
[0075]
计算结果如下：
[0076]
表4数据直线回归分析结果
[0077][0078]
请参照图1，图1是本技术实施例提供的一种试剂盒与对照试剂盒的散点图，其中，以对照试剂为自变量(x)，考核试剂为因变量(y)，从表4和图1中可以看出，回归方程为y＝1.0032x+0.0047，斜率b＝1.0032(95％置信区间0.9929～1.0136)，p《0.05，拒绝h0，接受h1，即两种试剂直线关系成立，检测结果不存在比例差异。截距a＝0.0047(95％置信区间-0.4625～0.4719)，p》＝0.05，拒绝h1，接受h0，即截距与0值无显著性差异，检测结果不存在系统差异。
[0079]
(2)bland-altam分析和bland-altam图
[0080]
以对照试剂和考核试剂配对检测均值为横度坐标，检测差值为纵坐标，进行分析和作图，结果如下：
[0081]
表5bland-altam分析基本数据
[0082]
编号计算值差值均值-0.138差值标准差1.356
95％界值-2.795～2.519界外点数(比率)8(4.35％)
[0083]
请参照图2，图2是本技术实施例提供的一种试剂盒与对照试剂盒的bland-altam图，以对照试剂和考核试剂配对检测均值为横度坐标，检测差值为纵坐标，经bland-altman图分析可知，95.65％的点落在均值
±
1.96sd范围内，说明采用考核试剂检测血清样本的检测结果与对照试剂的检测结果具有一致性。
[0084]
本技术实施例提供的一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统，该试剂盒包括：第一试剂和第二试剂：所述第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20；所述第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。本技术提供的试剂盒，能够实现快速、准确、直接测定血清中强心苷类药物浓度，可在临床上为病人提供有价值的信息，从而有助于调整用药计量，使治疗达到最佳效果，有效地避免剂量不足造成的治疗效果不佳或用药过量造成的中毒现象。
[0085]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；在本技术的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本技术的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种检测强心苷类药物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂：所述第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20；所述第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmol/l～100mmol/l的第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲溶液ph为6.0～8.0，所述第一缓冲溶液为tris缓冲液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲溶液ph为5.5～7.5，所述第二缓冲溶液为mes缓冲液。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲溶液浓度为400mmol/l的tris缓冲液，所述第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.8％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲溶液浓度为400mmol/l的mes缓冲液，所述第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.1％的吐温-20。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述超顺磁性磁微粒为亲水性磁微粒，所述磁微粒的粒径为1.5μm～3μm。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的浓度为200μg/ml～600μg/ml。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物的浓度为4ng/ml～10ng/ml。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述强心苷类药物包括：地高辛、去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷和毒毛花苷k。10.一种检测强心苷类药物的系统，其特征在于，所述系统包括全自动化学发光免疫分析仪、清洗液、预激发液、激发液以及如权利要求1至9任一项所述的试剂盒。

技术总结
本申请涉及一种检测强心苷类药物的试剂盒和检测系统。该试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，第一试剂包括：超顺磁性共价偶联的强心苷类单克隆抗体的磁微粒，浓度为20mmoL/L～100mmoL/L的第一缓冲溶液，第一缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20；第二试剂包括：吖啶酯标记的强心苷类药物或其衍生物，浓度为20mmoL/L～100mmoL/L的第二缓冲溶液，第二缓冲溶液包括：体积百分比浓度为0.2％～1％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.05％～0.1％的叠氮钠和体积百分比浓度为0.05％～0.1％的吐温-20。该试剂盒能够实现快速、准确、直接测定血清中强心苷类药物浓度，有效地避免剂量不足造成的治疗效果不佳或用药过量造成的中毒现象。过量造成的中毒现象。


技术研发人员：王小龙 王建东 陆建斌 赵科瑞 徐辉 郑文静
受保护的技术使用者：深圳市希莱恒医用电子有限公司
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/7/19