一种大肠杆菌O157:H7可视化快速检测体系及其试剂盒

green作为荧光指示剂的初始反应体系，再以钙黄绿素指示剂替换荧光指示剂建立可视化反应体系，使得能够快速、准确地鉴定出大肠杆菌o157:h7。
8.在具体的实施方案中，所述方法包括如下步骤：
9.步骤1，确定靶基因，设计lamp引物；
10.步骤2，初始lamp体系的确定；
11.步骤3，lamp方法的程序优化(如引物比例优化、dntps浓度优化、mg
2+
浓度优化、bst 3.0dna聚合酶添加量优化、反应温度优化)，确定荧光定量lamp扩增体系；
12.步骤4，荧光定量lamp技术灵敏度的测定；
13.步骤5，可视化探索(如，可视化指示剂配制、可视化lamp反应时间优化)，确定可视化lamp扩增体系。
14.在具体的实施方案中，lamp引物的序列为：
15.f3：5
’–
ggttatatttatgactttcacactg
–3’
，如seq id no：1所示；
16.b3：5
’–
agcgaaccattttaattgagg
–3’
，如seq id no：2所示；
17.fip：5
’–
tgttagcgcaattgacatcaatttactatccttcattttttagtaagcg
–3’
，如seq id no：3所示；
18.bip：5
’–
atgcacattcagttattaccgatgcgcatggactaaatggaagag
–3’
，如seq id no：4所示；
19.lf：5
’–
aacacattcctttgatctatt
–3’
，如seq id no：5所示；
20.lb：5
’–
gggattattctgcaaaactac
–3’
，如seq id no：6所示。
21.在具体的实施方案中，本发明最终确定的lamp扩增体系组成为：采用25μl扩增体系，包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，2μl dna 模板，荧光定量lamp检测时加入20
×
sybr green 1μl，加水补足25μl；可视化lamp检测时加入钙黄绿素-氯化锰指示剂1μl，加水补足25μl。
22.在具体的实施方案中，本发明最终确定的lamp检测体系扩增程序：荧光定量lamp反应程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号；可视化lamp反应程序为：65℃反应40分钟。
23.在具体的实施方案中，(1)当使用荧光定量lamp反应结束后，检测结果有扩增曲线，times值不超过30，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性；(2)当可视化lamp反应结束后，反应管内颜色由橙黄色变为绿色，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性。
24.针对荧光定量lamp检测，以菌液为模板时，检测灵敏度为8.8
×
100cfu/ml；以基因组为模板时，检测灵敏度为4.61fg/μl。
25.相比于用凝胶电泳判断试验结果的lamp方法，可实现闭管检测，减少样品出现交叉污染，减小了假阳性结果出现概率，并省去了电泳检测的繁琐操作；相比于taqman探针法，无需合成荧光基团修饰探针，更为经济实惠；相比于传统的国标法检测，步骤更简单，缩短了检测周期，能够到达快速检测的目的，同时准确性高、结果可靠。
26.在前述检测体系建立的基础上，本发明确立可视化lamp新型快速检测商品试剂盒，应用于实际检验检测工作中时各方面性能优良，能满足大肠杆菌o157:h7快速、准确、高
效的实际检测需要和现场检测、批量检测的检测需求。
27.第二方面，本发明首先保护一种利用lamp技术检测大肠杆菌o157:h7的引物，所述引物针对靶基因ecs_2840，序列为：
28.f3：5
’–
ggttatatttatgactttcacactg
–3’
，如seq id no：1所示；
29.b3：5
’–
agcgaaccattttaattgagg
–3’
，如seq id no：2所示；
30.fip：5
’–
tgttagcgcaattgacatcaatttactatccttcattttttagtaagcg
–3’
，如seq id no：3所示；
31.bip：5
’–
atgcacattcagttattaccgatgcgcatggactaaatggaagag
–3’
，
32.如seq id no：4所示；
33.lf：5
’–
aacacattcctttgatctatt
–3’
，如seq id no：5所示；
34.lb：5
’–
gggattattctgcaaaactac
–3’
，如seq id no：6所示。
35.第三方面，本发明保护一种大肠杆菌o157:h7的检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有权利要求1所述的引物组。
36.在具体的实施方案中，在组建试剂盒时，需要包含以下步骤：(1)试剂盒的组装；(2)试剂盒的灵敏度评估；(3)试剂盒的特异性评估；(3)试剂盒的抗干扰性能评估；(4)试剂盒的稳定性评估(重复性)；(5)试剂盒的人工污染试验。
37.在更具体的实施方案中，本发明保护一种大肠杆菌o157:h7的检测试剂盒，所述试剂盒采用lamp扩增体系，包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，指示剂1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。
38.优选的，所述试剂盒为荧光定量试剂盒，采用荧光定量lamp扩增体系，包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。
39.更优选的，荧光定量lamp反应程序：扩增程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号。
40.优选的，所述试剂盒为可视化试剂盒，采用可视化lamp扩增体系，包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，钙黄绿素-氯化锰指示剂1μl，2μl dna 模板，加水补足25μl。
41.更优选的，可视化lamp反应程序为：65℃反应40分钟。
42.第四方面，本发明保护前文所述的引物组，或，前文任一所述的检测试剂或试剂盒，在下述任一种应用：
43.(1)在检测大肠杆菌o157:h7或制备检测大肠杆菌o157:h7的产品中的应用；
44.(2)在制备诊断或辅助诊断大肠杆菌o157:h7感染所引起的疾病的产品中的应用；
45.(3)在大肠杆菌o157:h7防控中的应用。
46.针对试剂盒的性能评估中，试剂盒灵敏度分析后得到，基因组为模板时，可视化lamp检测灵敏度为4.61fg/μl；菌液为模板时，可视化lamp检测灵敏度为2.35
×
100cfu/ml。
14为绿色；
59.图11为可视化lamp试剂盒抗干扰试验结果，其中a中1为nk、2-8为浓度为n
×
10
6-n
×
100cfu/ml干扰菌混合菌液与无菌水等体积混合，b中1-7为浓度为n
×
10
6-n
×
100cfu/ml干扰菌混合菌液与目标菌等体积混合、8为无菌水与目标菌等体积混合；如图11所示，a：1-8均为橙黄色、b：1-8均为绿色；
60.图12为可视化lamp试剂盒重复性试验结果，其中a-c分别为nk、2.35
×
107cfu/ml、2.35
×
104cfu/ml；1-6分别为11281、11291、11301、12011、12012、12013；如图12所示，a：1-6均为橙黄色；b：1-6均为绿色；c：1-6均为绿色。
61.图13为可视化lamp试剂盒人工污染试验结果，其中a-c分别为培养0h、3h、6h；1-6分别为初始污染量为2.26
×
104cfu/ml-2.26
×
10-1
cfu/ml；如图13所示，a：nk、5、6为橙黄色，1-4为绿色；b：nk为橙黄色，1-6为绿色；c：nk为橙黄色，1-6为绿色。
具体实施方式
62.下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开商业渠道获得。
63.1.初始lamp体系确定
64.以大肠杆菌o157:h7试验室自筛靶点ecs_2840为靶基因，使用软件进行引物设计，获得4组引物，引物相关信息见表1。采用25μl反应体系，体系组成为：含有环引物的体系组成：外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.4mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna模板，加水补足25μl；不含环引物的体系组成：外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各1.6μm，dntps终浓度1.4mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。反应条件为65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号。以times值较低和假阳性结果较小作为标准，获得最佳的引物组成为引物组1，以最佳的引物组成进行荧光定量lamp检测的体系优化。
65.2.基于荧光染料的荧光定量lamp检测方法的建立
66.2.1荧光定量lamp扩增体系优化
67.以1中获得的最佳引物组成为出发点，分别对体系的引物比例、dntps浓度、mg
2+
浓度、bst 3.0dna聚合酶添加量、反应温度进行优化。
68.引物比例优化：其他条件不变，对荧光定量lamp反应体系中的引物比例进行优化，固定环引物浓度，外引物浓度不变，不断改变内引物的浓度，使内引物与外引物之间的浓度比分别为4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1，通过分析扩增曲线的times值来确定最适的引物比。结果如图1所示，当使用不同比例的内外引物时，扩增曲线几乎重叠，times值无显著差异(p《0.05)。由于在初始体系中引物浓度比为4:1，因此，保持初始比例4:1不变。
69.dntps浓度优化：其他条件不变，对荧光定量lamp反应体系中dntps浓度进行优化，将dntps终浓度调整为：1mmol/l、1.2mmol/l、1.4mmol/l、1.6mmol/l、1.8mmol/l、2mmol/l，通过分析扩增曲线的times值来确定最适的dntps浓度。结果如图2所示，底物量不足或过高
均会影响检测的效果，当浓度为1.2mmol/l时，最小times值为6.58，因此选择1.2mmol/l dntps作为lamp反应的最佳用量。
70.mg
2+
浓度优化：其他条件不变，对荧光定量lamp反应体系中mg
2+
浓度进行优化，调整mg
2+
浓度为3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l，通过分析扩增曲线的times值来确定最适的mg
2+
浓度。结果如图3所示，随着mg
2+
浓度的增加，times值逐渐降低，其中6、7、8mmol/l mg
2+
浓度下的times值差异不显著(p《0.05)。考虑到mg
2+
浓度过高会影响酶的性能，选择6mmol/l mg
2+
作为最佳添加量。
71.bst 3.0dna聚合酶添加量优化：其他条件不变，对荧光定量lamp反应体系中bst 3.0dna聚合酶添加量进行优化，将bst 3.0dna聚合酶添加量调整为0.4μl、0.6μl、0.8μl、1μl、1.2μl、1.4μl，通过分析扩增曲线的times值来确定最适的bst 3.0dna聚合酶添加量。结果如图4所示，在其他条件不变时，仅改变酶添加量，各times值之间无显著差异(p《0.05)。由于初始条件下酶的添加量为1μl，所以酶的添加量保持在1μl为最优。
72.2.2荧光定量lamp扩增体系条件优化
73.反应温度优化：其他条件不变，调整荧光定量lamp方法中的反应温度，选择温度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃共6个梯度，通过分析扩增曲线的times值来确定最适的反应温度，结果见表2，可以得到温度为65℃时，times值最小，选择65℃为最适反应温度。
74.2.3荧光定量lamp的最佳体系为：荧光定量lamp体系(25μl)包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。扩增程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号。
75.3.荧光定量lamp灵敏度评价
76.3.1菌液灵敏度评价
77.将过夜培养的大肠杆菌o157:h7进行菌落计数，将已知初始浓度的大肠杆菌o157:h7菌悬液按照10倍倍比稀释至10-8
，每个浓度梯度吸取1ml提取基因组后进行检测，每个浓度设置3个平行，获得荧光定量lamp技术的最低检出限。
78.以菌液为模板的组别进行平板计数，涂布结果显示，37℃、180rpm过夜培养的大肠杆菌o157:h7(atcc 43889)菌液浓度为8.8
×
107cfu/ml。从图5中看出，以菌液浓度为评价标准时，检测灵敏度为8.8
×
100cfu/ml。
79.3.2基因组灵敏度评价
80.提取大肠杆菌o157:h7基因组并测量浓度，将已知浓度的基因组按照10倍倍比稀释至10-8，获得的稀释菌液作为模板进行检测，每个浓度设置3个平行，获得荧光定量lamp技术的最低检出限。结果如图6所示，当基因组为模板时，检测灵敏度为4.61fg/μl。
81.4.可视化lamp检测技术研究
82.4.1可视化lamp体系建立及反应条件优化
83.可视化lamp体系与荧光定量lamp体系基本一致，不同点在于将荧光定量lamp体系中的sybr green染料替换为可视化指示剂代替荧光指示剂钙黄绿素-氯化锰，如下：
84.外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，
bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，钙黄绿素-氯化锰混合指示剂1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。初始反应条件：65℃反应1小时，反应结束后观察颜色变化。
85.反应时间优化：其他条件不变，调整可视化lamp方法中的反应时间，选择时间20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟；通过对比颜色的差异，判断最适的反应时间。从图7中看出，可视化lamp反应的最佳条件为：65℃反应40分钟。
86.5.可视化lamp快速检测试剂盒及试剂盒相关性能评估
87.5.1可视化lamp快速检测试剂盒的组装与结果判定
88.可视化lamp体系(25μl)包括外侧引物(f3和b3)各0.2μm，内侧引物(fip和bip)各0.8μm，环引物(lf和lb)各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，钙黄绿素-氯化锰指示剂1μl，2μl dna 模板，加水补足25μl，可视化lamp体系的组成如表3。扩增程序为：65℃反应40分钟，反应结束后观察反应管颜色变化。
89.试剂盒的具体组成如表4，包括50组预混液，每组包括10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl、dntps(10mm)3μl、mgso4(100mm)1.5μl、外侧引物f3及b3(10μm)各0.5μl、内侧引物fip及bip(10μm)各2μl、环引物lf及lb(10μm)各1μl，共计700μl。50组的bst 3.0dna聚合酶1μl，共计50μl。此外还有50组1.25mm的钙黄绿素和25mm的氯化锰各0.5μl，分别共计25μl。同时设置空白对照(无菌超纯水)、阳性对照(大肠杆菌o157:h7基因组dna)和阴性对照(单增李斯特菌基因组dna)。可视化lamp反应体系为25μl：开始前钙黄绿素与氯化锰等体积混合配制为指示剂，每个反应管中取预混液14μl，bst 3.0dna聚合酶1μl，钙黄绿素-氯化锰混合指示剂1μl，2μl的待测样品基因组dna加入后，补足无菌纯净水至25μl。
90.设置反应温度为65℃，反应时间为40分钟，反应结束后观察反应管内颜色变化判断试验结果。样品管内颜色由橙黄色变为绿色，空白对照管内颜色保持橙黄色不变，判定检测结果为阳性。样品管和空白对照管颜色均为橙黄色，判定检测结果为阴性，大肠杆菌o157:h7未检出。
91.5.2可视化lamp试剂盒的性能评估
92.5.2.1可视化lamp试剂盒的灵敏度评价
93.5.2.1.1菌液灵敏度检测
94.将过夜培养的大肠杆菌o157:h7进行菌落计数，将已知初始浓度的大肠杆菌o157:h7菌悬液按照10倍倍比稀释至10-10
，每个浓度梯度吸取1ml提取基因组后用组建的试剂盒进行检测，每个浓度设置3个平行，获得试剂盒的最低检出限。
95.以菌液为模板的组别进行平板计数，涂布结果显示，37℃180rpm过夜培养的大肠杆菌o157:h7(atcc 43889)菌液浓度为2.35
×
107cfu/ml。检测结果如图8所示，以菌液浓度为评价标准时，以浓度为2.35
×
107cfu/ml-2.35
×
100cfu/ml的菌液为模板时，反应管颜色为绿色，空白及2.35
×
100cfu/ml以下的反应管颜色保持橙黄色不变，所以检测灵敏度为2.35
×
100cfu/ml。
96.5.2.1.2基因组灵敏度检测
97.提取大肠杆菌o157:h7基因组并测量浓度，将已知浓度的基因组按照10倍倍比稀释至10-10
，获得的稀释菌液作为模板使用组建的试剂盒进行检测，每个浓度设置3个平行，
获得试剂盒的最低检出限。结果见图9，当基因组为模板时，基因组浓度为46.1ng/μl-4.61fg/μl，反应管颜色为绿色，空白及基因组浓度在4.61fg/μl的反应管颜色保持橙黄色不变，因此检测灵敏度为4.61fg/μl。
98.5.2.2可视化lamp试剂盒特异性评价
99.以大肠杆菌o157:h7及非大肠杆菌o157:h7基因组dna为模板(试验菌株见表5)，使用组建的试剂盒进行检测，对试剂盒的特异性进行评估。
100.经检测，从图10中看出，5株大肠杆菌o157:h7属内菌株全部检出，9株非大肠杆菌o157:h7菌株全部未检出。
101.5.2.3可视化lamp试剂盒抗干扰试验
102.将大肠杆菌o157:h7目标菌稀释至3.9
×
103cfu/ml，金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌4种干扰菌分别稀释至n
×
106cfu/ml-n
×
100cfu/ml(菌株平板计数结果见表6)。为验证可视化lamp试剂盒在大肠杆菌o157:h7检测过程中是否具有一定的抗干扰能力，非大肠杆菌o157:h7等体积混合，总菌体量分别为n
×
100cfu/ml、n
×
101cfu/ml、n
×
102cfu/ml、n
×
103cfu/ml、n
×
104cfu/ml、n
×
105cfu/ml、n
×
106cfu/ml，再与3.9
×
103cfu/ml的大肠杆菌o157:h7等体积混合，提取混合菌液基因组dna进行检测，判断该试剂盒在有其它杂菌存在时对大肠杆菌o157:h7基因的检测能力。
103.经检测，由图11-b可知，即使混入106cfu/ml大肠杆菌o157:h7外的金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌的非目标菌，也能检测到103cfu/ml大肠杆菌o157:h7基因，样品管颜色由橙黄色变为绿色。当7组不同浓度的干扰菌混合菌液与无菌水等体积混合后，各管颜色未发生变化，仍然为橙黄色，如图11-a。
104.5.2.4可视化lamp试剂盒稳定性评价
105.5.2.4.1重复性评估
106.试剂盒的重复性评估分为批间重复性评估与批内重复性评估，步骤如下：
107.对不同时间制作的三个试剂盒命名：11281、11291、11301，用试剂盒对不同浓度的目标基因进行检测；依据反应管颜色变化，对试剂盒的批间重复性进行评估。
108.对同一时间制作的三个试剂盒命名：12011、12012、12013，用试剂盒对不同浓度的目标基因进行检测，依据反应管颜色变化，对试剂盒的批内重复性进行评估。
109.重复性试验结果如图12所示。不管是同一时间制作的三个试剂盒，还是不同时间制作的三个试剂盒，对于不同浓度的菌液(a为空白对照、b为2.35
×
107cfu/ml、c为2.35
×
104cfu/ml)，试剂盒均能检测到，样品管颜色由橙黄色变为绿色，试剂盒重复性较好。
110.5.2.5可视化lamp试剂盒人工污染试验
111.将已知初始浓度的大肠杆菌o157:h7菌悬液按照10倍倍比稀释至100cfu/ml。选取浓度为10
5-100cfu/ml菌液和无菌水各10ml分别添加至90ml牛奶中均质，获得人工污染的牛奶样品和空白对照，此时菌液浓度分别为10
4-10-1
cfu/ml。取均质后的25ml的牛奶与225ml的mec+n肉汤混合并均质，在37℃，180rpm条件下培养24h。培养0、3、6小时后分别取1ml菌液，经过水煮法提取基因组并采用试剂盒进行检测，通过颜色变化判断实验结果。
112.菌液浓度为2.26
×
108cfu/ml。检测结果如图13所示，在未增菌时，初始污染量为2.26
×
101cfu/ml及以上的样品，检测管颜色变为绿色，初始污染量为2.26
×
101cfu/ml以下的样品检测管与对照一致为橙黄色。增菌培养至3h和6h，2.26
×
100cfu/ml、2.26
×
10-1
cfu/
ml初始污染量的牛奶样品均可被检测到，检测管颜色均变为绿色，试剂盒实际应用效果好。
113.附表：
114.表1lamp引物序列
[0115][0116]
表2可视化lamp反应温度优化
[0117][0118][0119]
表3可视化lamp反应体系
[0120][0121]
表4可视化lamp试剂盒组成(50t)
[0122][0123]
a：包括f3/b3、fip/bip、lf/lb、dntps、mgso4、10
×
isothermal amplification buffer；b：棕色ep管避光保存。
[0124]
c：阳性对照
[0125]
d：阴性对照
[0126]
表5可视化lamp试剂盒特异性试验结果
[0127][0128]
a：“+”表示检测结果呈阳性，
“‑”
表示实验结果呈阴性
[0129]
表6菌株平板计数结果
[0130][0131][0132]
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种大肠杆菌o157:h7的可视化快速检测体系，其特征在于，所述检测体系通过如下方法建立：针对大肠杆菌o157:h7特异性基因ecs_2840，设计lamp引物，使用环介导等温扩增的方法，建立以sybr green作为荧光指示剂的荧光定量lamp扩增体系，再以钙黄绿素指示剂替换荧光指示剂建立可视化lamp扩增体系，以鉴定大肠杆菌o157:h7；优选的，所述lamp引物的序列为：f3：5
’–
ggttatatttatgactttcacactg
–3’
，如seq id no：1所示；b3：5
’–
agcgaaccattttaattgagg
–3’
，如seq id no：2所示；fip：5
’–
tgttagcgcaattgacatcaatttactatccttcattttttagtaagcg
–3’
，如seq id no：3所示；bip：5
’–
atgcacattcagttattaccgatgcgcatggactaaatggaagag
–3’
，如seq id no：4所示；lf：5
’–
aacacattcctttgatctatt
–3’
，如seq id no：5所示；lb：5
’–
gggattattctgcaaaactac
–3’
，如seq id no：6所示；优选的，所述荧光定量lamp扩增体系，包括外侧引物f3和b3各0.2μm，内侧引物fip和bip各0.8μm，环引物lf和lb各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna 模板，加水补足25μl；更优选的，荧光定量lamp反应程序：扩增程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号；优选的，所述可视化lamp扩增体系，包括外侧引物f3和b3各0.2μm，内侧引物fip和bip各0.8μm，环引物lf和lb各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna 聚合酶终浓度0.32u/μl，钙黄绿素-氯化锰指示剂1μl，2μl dna模板，加水补足25μl；更优选的，可视化lamp反应程序：扩增程序为：65℃反应40分钟。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌o157:h7的可视化快速检测体系，其特征在于，(1)当使用荧光定量lamp反应结束后，检测结果有扩增曲线，times值不超过30，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性；(2)当可视化lamp反应结束后，反应管内颜色由橙黄色变为绿色，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性。3.一种大肠杆菌o157:h7的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一所述的检测体系。4.一种大肠杆菌o157:h7的检测引物，其特征在于，所述引物针对靶基因ecs_2840设计，引物序列为：f3：5
’–
ggttatatttatgactttcacactg
–3’
，如seq id no：1所示；b3：5
’–
agcgaaccattttaattgagg
–3’
，如seq id no：2所示；fip：5
’–
tgttagcgcaattgacatcaatttactatccttcattttttagtaagcg
–3’
，如seq id no：3所示；bip：5
’–
atgcacattcagttattaccgatgcgcatggactaaatggaagag
–3’
，如seq id no：4所示；lf：5
’–
aacacattcctttgatctatt
–3’
，如seq id no：5所示；
lb：5
’–
gggattattctgcaaaactac
–3’
，如seq id no：6所示。5.一种大肠杆菌o157:h7的检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中含有权利要求4所述的引物组。6.根据权利要求4所述的大肠杆菌o157:h7的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用lamp扩增体系，包括外侧引物f3和b3各0.2μm，内侧引物fip和bip各0.8μm，环引物lf和lb各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna 聚合酶终浓度0.32u/μl，指示剂1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。7.根据权利要求5所述的大肠杆菌o157:h7的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为荧光定量试剂盒，采用荧光定量lamp扩增体系，包括外侧引物f3和b3各0.2μm，内侧引物fip和bip各0.8μm，环引物lf和lb各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna 聚合酶终浓度0.32u/μl，20
×
sybr green 1μl，2μl dna模板，加水补足25μl；优选的，荧光定量lamp反应程序：扩增程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号。8.根据权利要求5所述的大肠杆菌o157:h7的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用可视化lamp扩增体系，包括外侧引物f3和b3各0.2μm，内侧引物fip和bip各0.8μm，环引物lf和lb各0.4μm，dntps终浓度1.2mm，mg
2+
终浓度6.0mm，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，bst 3.0dna 聚合酶终浓度0.32u/μl，钙黄绿素-氯化锰指示剂1μl，2μl dna模板，加水补足25μl。9.根据权利要求7所述的大肠杆菌o157:h7的检测试剂盒，其特征在于，可视化lamp反应程序为：65℃反应40分钟。10.权利要求4所述的引物组，或，权利要求5-9任一所述的检测试剂或试剂盒，在下述任一种应用：(1)在检测大肠杆菌o157:h7或制备检测大肠杆菌o157:h7的产品中的应用；(2)在制备诊断或辅助诊断大肠杆菌o157:h7感染所引起的疾病的产品中的应用；(3)在大肠杆菌o157:h7防控中的应用。

技术总结
本发明提供一种大肠杆菌O157:H7可视化快速检测体系及其试剂盒。针对大肠杆菌O157:H7特异性靶基因，使用SYBR Green荧光指示剂进行环介导等温扩增体系的建立并用钙黄绿素作为可视化指示剂代替荧光指示剂，建立了检测大肠杆菌O157:H7的可视化LAMP技术。本发明创造性建立了定量及可视化LAMP检测新技术，可以准确、快速地鉴定出大肠杆菌O157:H7，具备高特异、高灵敏度和抗干扰能力。除此，将建立的可视化LAMP检测体系组装成商品试剂盒，减少检测步骤，提高检测的便捷性，满足现场检测和批量检测的需求。测的需求。测的需求。


技术研发人员：别小妹 王祖未 陆兆新
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/19