一种中分子量铁皮石斛多糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于多糖制备技术领域，尤其涉及一种中分子量铁皮石斛多糖及其制备方法和应用。


背景技术：

2.石斛(dendrobium officinale)是兰科第二大属，是一种多年生草本植物。石斛中含有多种活性成分，包括多糖、生物碱等，其有止咳润肺、健胃生津等作用。因其特殊的生存条件和突出的药用作用，在“中华九大仙草”中排在首位。石斛多糖是铁皮中重要的功效成分，具有突出的医学药用价值。铁皮石斛多糖具有多种药理作用，包括提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等。传统的铁皮石斛多糖提取工艺主要包括热水提取法、酶提取法、超声提取法和半仿生提取法等。水提法简单易行，但普遍存在提取率较低，对原料造成较大的浪费；酶法提取多糖虽能提高提取率且条件也比较温和，但采用纤维素酶会降解o-乙酰-β-d-1,4-葡甘露聚糖，在铁皮石斛、霍山石斛及细茎石斛中均发现有此类多糖。亚临界水提取法具有绿色环保、提取率高等优点，被广泛用于天然产物的提取。在高温高压下，亚临界水可以改变溶剂的极性和介电常数，从而有助于改善提取工艺，提高提取物的传质效率，保持其生物活性，具有很好的应用前景。
3.根据多糖的构效关系的研究进展，多糖活性的强弱与单糖组成、分子量大小及结构有直接的关系，中等分子量大小的多糖(30～100da的范围)往往具有较为优异且全面的生物活性。因此，制备中等分子量、单糖组成和高级结构明确的铁皮石斛多糖具有实际意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，采用亚临界提取的方法，高效提取得到指定分子量范围内的铁皮石斛多糖，再进行纤维素柱层析及葡聚糖凝胶柱分离，获得一个中分子量、单糖组成及高级结构明确的铁皮石斛多糖。
5.本发明的第二个方面提出了一种所述中分子量铁皮石斛多糖的制备方法制得的中分子量铁皮石斛多糖。
6.本发明的第三个方面提出了一种包含所述中分子量铁皮石斛多糖的组合物。
7.本发明的第四个方面提出了一种所述中分子量铁皮石斛多糖和/或组合物的应用。
8.根据本发明的第一个方面，提出了一种中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：将铁皮石斛细粉与水混合，形成匀浆液；
10.s2：将所述匀浆液进行亚临界提取，纯化处理后制得分子量为10kd～100kd的铁皮石斛多糖；
11.s3：将所述分子量为10kd～100kd的铁皮石斛多糖依次通过纤维素柱层析和葡萄糖凝胶柱分离，制得分子量为30kd～60kd所述中分子量铁皮石斛多糖。
12.在本发明的一些实施方式中，所述铁皮石斛细粉为过50目～100目筛的细粉；优选为过60目～80目筛的细粉。
13.在本发明的一些优选的实施方式中，所述铁皮石斛细粉与所述水的质量比为1：(20～30)。
14.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述水为去离子水、超纯水、蒸馏水等。
15.在本发明的一些更优选的实施方式中，s1中还包括在混合后进行浸泡、匀质，形成所述匀浆液；优选地，所述浸泡的时间为10min～30min；进一步优选地，所述匀质的方法为过胶体磨处理5min～15min。
16.在本发明的一些更优选的实施方式中，s2中，所述亚临界提取的时间为30min～60min。
17.在本发明的一些更优选的实施方式中，s2中，所述纯化处理包括固液分离取滤液、浓缩、醇沉、干燥；优选地，所述浓缩的加热温度为60℃～80℃；进一步优选地，所述醇沉的方法包括加入乙醇使所述乙醇的浓度为70％～80％；更进一步优选地，所述干燥的方法包括将醇沉产物搅拌均匀，静置6h～12h后除去乙醇和水，将沉淀物干燥。
18.在本发明的一些更优选的实施方式中，s2中，所述亚临界提取的压力为2mpa～5mpa。
19.在本发明的一些更优选的实施方式中，s2中，所述亚临界提取的时间为0.5h～1.5h。
20.在本发明的一些更优选的实施方式中，s3中，所述纤维素柱包括deae-cellulose-52柱。
21.在本发明的一些更优选的实施方式中，s3中，所述葡聚糖凝胶柱包括sephadex g-75～sephadex g-150柱。
22.根据本发明的第二个方面，提出了一种所述中分子量铁皮石斛多糖的制备方法制得的中分子量铁皮石斛多糖。
23.根据本发明的第三个方面，提出了一种包含所述中分子量铁皮石斛多糖的组合物。
24.根据本发明的第四个方面，提出了一种所述中分子量铁皮石斛多糖和/或所述组合物在制备抗炎化妆品或抗炎药物中的应用。
25.本发明的有益效果为：
26.本发明提供一种亚临界方法提取中分子量铁皮石斛多糖的方法，与以往技术相比，其主要创新点在于：(1)采用亚临界方法提取铁皮石斛多糖，能够更高效提取得到指定分子量范围内的铁皮石斛多糖；(2)使用该提取方法获得的中分子量铁皮石斛多糖单糖组成和高级结构明确，且具有较好的生物活性。
附图说明
27.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
28.图1为本发明实施例1～3及对比例1～4铁皮石斛多糖对raw 264.7细胞的细胞毒
75葡聚糖凝胶柱分离，得到铁皮石斛多糖。
42.对比例1
43.本对比例制备了一种铁皮石斛多糖，具体过程为：
44.1)将铁皮石斛干制品粉碎成60目的细粉，取细粉；2)按料液比为1：20(质量比)加入去离子水，浸泡6h，过胶体磨处理5min，得到匀浆液；3)往匀浆液中缓慢加入乙醇，使溶液中乙醇浓度达到75％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇和水，多糖沉淀物经干燥后得到铁皮石斛多糖。4)将步骤3)中获得的铁皮石斛多糖过deae-cellulose-52柱层析，收集洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液过sephadex g-150葡聚糖凝胶柱分离，得到铁皮石斛多糖。
45.对比例2
46.本对比例制备了一种铁皮石斛多糖，具体过程为：
47.1)将铁皮石斛干制品粉碎成60目的细粉，取细粉；2)按料液比为1：20(质量比)加入去离子水，浸泡6h，过胶体磨处理5min，得到匀浆液；3)往匀浆液中缓慢加入乙醇，使溶液中乙醇浓度达到75％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇和水，多糖沉淀物经干燥后得到铁皮石斛多糖。4)将步骤3)中获得的铁皮石斛多糖过deae-cellulose-52柱层析，收集洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液过sephadex g-100葡聚糖凝胶柱分离，得到铁皮石斛多糖。
48.对比例3
49.本对比例制备了一种铁皮石斛多糖，具体过程为：
50.1)将铁皮石斛干制品粉碎成60目的细粉，取细粉；2)按料液比为1：20(质量比)加入去离子水，浸泡12h；3)将溶液加热至90℃并保持2h，随后采用高速离心机1000g离心力离心，离去石斛粉渣，得热水提取多糖溶液；4)往多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液中乙醇浓度达到75％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇和水，多糖沉淀物经干燥后得到铁皮石斛多糖。5)将步骤4)中获得的铁皮石斛多糖过deae-cellulose-52柱层析，收集洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液过sephadex g-200葡聚糖凝胶柱分离，得到铁皮石斛多糖。
51.对比例4
52.本对比例制备了一种铁皮石斛多糖，具体过程为：
53.1)将铁皮石斛干制品粉碎成60目的细粉，取细粉；2)按料液比为1：20(质量比)加入去离子水，浸泡12h；3)将溶液加热至90℃并保持2h，随后采用高速离心机1000g离心力离心，离去石斛粉渣，得热水提取多糖溶液；4)往多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液中乙醇浓度达到75％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇和水，多糖沉淀物经干燥后得到铁皮石斛多糖。5)将步骤4)中获得的铁皮石斛多糖过deae-cellulose-52柱层析，收集洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液过sephadex g-100葡聚糖凝胶柱分离，得到铁皮石斛多糖。
54.试验例1
55.1、测定方法
56.采用aglient 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为tsk-gel g4000pwxl色谱柱，柱温30℃；进样体积20μl；流动相为超纯水，流速0.6ml/min；示差检测器，检测器温度：35℃。将葡聚糖标准品系列分别用流动相配成浓度为1.0mg/ml的标准溶液，进样量为20μl，采集gpc色谱图。以标准葡聚糖分子量的对数logm w为纵坐标，洗脱体积v为横坐标，绘制“logm w-v”曲线，用breeze gpc系统软件对曲线进行回归拟合，选出与曲线相关度较好的葡聚糖分子量gpc校正曲线方程。
57.样品处理：精确称取石斛多糖2.00mg，用1.0ml超纯水溶解后，过0.22μm的水膜，用高效液相色谱仪对多糖的分子量分布进行测定。
58.2、测定结果
59.实施例和对比例的铁皮石斛多糖的分子量测定结果见表1。可知，实施例1、实施例2和实施例3的铁皮石斛多糖分子量为59.2kda、46.9kda和41.6kda，为中分子量多糖，对比例1和对比例3的分子量分别为315.46kda和286.75kda，分子量较大，而对比例2和对比例4的分子量分别为98.71kda和91.83kda，为中分子量多糖，但多糖纯度较低。可见，水提醇沉法和热水浸提法提取多糖分子量较大，对中分子量多糖的提取效果不如实施例方法好。
60.表1实施例1～3及对比例1～6铁皮石斛多糖的分子量
[0061] 多糖提取率(％)分子量(kda)纯度(％)实施例154.2159.298.85实施例252.1941.992.89实施例353.2836.693.41对比例145.39315.4697.18对比例244.8798.7148.9对比例339.51286.7591.69对比例440.3291.8352.13
[0062]
试验例2
[0063]
1.测定方法
[0064]
配制浓度为10.0μg/ml的各单糖(阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖)标准溶液，然后再配制成5μg/ml的混合标准溶液。从混合标准溶液中分别取出5.0ml、1.0ml、0.5ml、0.1ml、0.05ml溶液，并在每个样品中加入10μg肌醇作为内标，然后用氮吹仪吹干。标准溶液好实施例1～3及对比例1～4的铁皮石斛多糖在100℃下用2m tfa被水解6h。移除过量的tfa后，用0.3ml trisil试剂(吡啶:六甲基二硅胺烷:三甲基氯硅烷＝10：2：1(v:v:v))对多糖水解产物进行硅醚化，反应条件是80℃水浴加热1h，反应完成后用氮气吹干，1ml正己烷定容，最后用gc-ms/ms检测。
[0065]
2.测定结果
[0066]
通过比对可得，实施例1～3及对比例1～4铁皮石斛多糖的单糖组成和摩尔比如表2所示。
[0067]
表2实施例1～3及对比例1～4铁皮石斛多糖的单糖组成摩尔比
[0068]
[0069][0070]
从表2可看出，实施例1的单糖组成为鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为0.6:9.0:2.7:2.9，对比例3与对比例4单糖组成与实施例1一致，摩尔比不同，对比例3与对比例4中鼠李糖摩尔比更大。实施例2和实施例3单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖，实施例1的中分子多糖比实施例2和实施例3的中分子多糖单糖组成多了少量鼠李糖。
[0071]
试验例3抗炎功效的测试
[0072]
1、多糖对raw 264.7细胞的细胞毒性测试
[0073]
1)测试方法
[0074]
将raw 264.7细胞接入含有10％胎牛血淸、1％双抗的dmem培养基中，在37℃、5％co2的条件下进行培养。在96孔板以5
×
103细胞/孔(cells/well)的浓度接种细胞，培养24h后，实验组分别加入不同实施例和对比例的铁皮石斛多糖。药物作用24h后，采用mtt法测试细胞增殖情况，得到多糖对于细胞毒性测试结果。对实验所得数据进行显著性分析。平行试验三次。
[0075]
2)测试结果
[0076]
实验结果见图1，图1为多糖细胞毒性测试结果。从结果可以发现，实施例1～3及对比例1～4的铁皮石斛多糖在最高剂量(1000μg/ml)作用下，均没有明显细胞毒性，因此测试抗炎功效时选择了250μg/ml～1000μg/ml的剂量。
[0077]
2、不同分子量铁皮石斛多糖的抗炎功效
[0078]
1)测试方法
[0079]
对细胞进行消化重悬，细胞悬液的密度为105个/ml。24孔板每孔加入0.5ml细胞悬液，即细胞的铺板密度为5*104个/孔。培养箱培养24h后，吸走24孔板上每个孔的培养基。除了阴性对照组，留1孔作为模型组，其他孔可按药物数量和给药浓度进行分组，每加入0.5ml含药的完全培养基。将24孔板放入培养箱，继续培养24小时。细胞培养约24小时，吸走24孔板上每个孔的培养基。留1孔作为阴性对照组，其他每孔加入0.5ml已配置完成的5μg/ml lps溶液。将24孔板放入培养箱，继续培养24小时。吸取50μl上清于96板中，加入格里斯试剂检测no含量，测试吸光度酶标仪540nm波长测吸光值(od)。数据处理与计算，将实验所测得吸光值用“excel”软件处理，计算不同浓度待测样品处理后细胞的od值。做标准曲线，计算处理组的no含量。另取上清液使用elisa检测il-1β、tnf-α表达量。
[0080]
2)测试结果
[0081]
实验结果如图，图2为no表达量的结果，图3为il-1β表达量的结果，图4为tnf-α表达量的结果。
[0082]
实施例1～3及对比例1～4制备得到的铁皮石斛多糖对raw264.7细胞no表达量的影响如图2，可以发现，实施例及对比例制得的铁皮石斛多糖均能抑制no的表达。此外，实施
例1的抑制效果最好，实施例1～3与对比例1～4相比均有显著性差异，实施例1能更加有效抑制no的表达。
[0083]
实施例1～3及对比例1～4制备得到的铁皮石斛多糖对raw264.7细胞il-1β表达量的影响如图3，可以发现，实施例及对比例制得的铁皮石斛多糖均能抑制il-1β的表达。此外，实施例1的抑制效果最好，更加有效抑制il-1β的表达。
[0084]
实施例1～3及对比例1～4制备得到的铁皮石斛多糖对raw264.7细胞tnf-α表达量的影响如图4，可以发现，实施例及对比例制得的铁皮石斛多糖均能抑制tnf-α的表达。并且实施例1～3与对比例1～4相比均有显著性差异，实施例1～3能更加有效抑制tnf-α的表达。
[0085]
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：将铁皮石斛细粉与水混合，形成匀浆液；s2：将所述匀浆液进行亚临界提取，纯化处理后制得分子量为10kd～100kd的铁皮石斛多糖；s3：将所述分子量为10kd～100kd的铁皮石斛多糖依次通过纤维素柱层析和葡萄糖凝胶柱分离，制得分子量为30kd～60kd所述中分子量铁皮石斛多糖。2.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：所述铁皮石斛细粉与所述水的质量比为1：(20～30)。3.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：s2中，所述亚临界提取的时间为30min～60min。4.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：s2中，所述亚临界提取的压力为2mpa～5mpa。5.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：s2中，所述亚临界提取的时间为0.5h～1.5h。6.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：s3中，所述纤维素柱包括deae-cellulose-52柱。7.根据权利要求1所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：s3中，所述葡聚糖凝胶柱包括sephadex g-75～sephadex g-150柱。8.一种如权利要求1～7任一项所述的中分子量铁皮石斛多糖的制备方法制得的中分子量铁皮石斛多糖。9.一种包含如权利要求8所述的中分子量铁皮石斛多糖的组合物。10.一种如权利要求8所述的中分子量铁皮石斛多糖和/或如权利要求9所述的组合物在制备抗炎化妆品或抗炎药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种中分子量铁皮石斛多糖及其制备方法和应用，本发明采用亚临界提取的方法，高效提取得到指定分子量范围内的铁皮石斛多糖，再进行纤维素柱层析及葡聚糖凝胶柱分离，获得一个中分子量、单糖组成及高级结构明确的铁皮石斛多糖。确的铁皮石斛多糖。


技术研发人员：余意 梁明 林晓亮 余庆涛 李文治 张婷 龙洁怡
受保护的技术使用者：无限极（中国）有限公司
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/19