橙花叔醇合成酶突变体、基因、基因工程菌及其应用

1.本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及橙花叔醇合成酶突变体、基因、基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸dimethylallyl diphosphate，dmapp和异戊烯基焦磷酸isopenteny diphosphate，ipp来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的dmapp和ipp首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(c
10
)倍半萜(c
15
)和二萜(c
20
)等天然产物。橙花叔醇是一种芳香的倍半萜精油成分，广泛应用于化妆品和洗涤。此外，橙花叔醇还具有抗病毒、抗肿瘤和抗疟疾的作用。
3.苦皮藤(学名:celastrus angulatus)是卫矛科南蛇藤属植物。藤状灌木；小枝常具4-6纵棱，皮孔密生，圆形到椭圆形，白色，腋芽卵圆状，长2-4毫米。叶大，近革质。分布于中国河北、山东、河南、陕西、甘肃等地区。生长于海拔1000-2500米山地丛林及山坡灌丛中。树皮纤维可供造纸及人造棉原料；果皮及种子含油脂可供工业用；根皮及茎皮为杀虫剂和灭菌剂。目前研究主要集中在对苦皮藤中的有效成分苦皮藤素进行分离与结构鉴定和杀虫作用机理研究，没有对苦皮藤素生物合成中倍半萜合成酶的相关文献。因此研究苦皮藤倍半萜合成酶的功能及其序列特征对萜类化合物的分布具有重要意义。
4.所有文献中未报道属于苦皮藤中的橙花叔醇合成酶点突变有关的内容。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供橙花叔醇合成酶突变体。
6.本发明的第二个目的是提供上述橙花叔醇合成酶突变体的编码基因。
7.本发明的第三个目的是提供含上述编码基因的重组质粒。
8.本发明的第四个目的是提供含上述重组质粒的基因工程菌。
9.本发明的第五个目的是提供上述基因工程重组菌制备橙花叔醇的应用。
10.本发明的技术方案概述如下：
11.橙花叔醇合成酶突变体，所述橙花叔醇合成酶突变体为下列之一：
12.seq id no.1氨基酸序列235位赖氨酸突变为谷氨酸、
13.seq id no.1氨基酸序列241位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、
14.seq id no.1氨基酸序列321位缬氨酸突变为亮氨酸和
15.seq id no.1氨基酸序列471位亮氨酸突变为缬氨酸。
16.上述橙花叔醇合成酶突变体的编码基因。
17.含上述编码基因的重组质粒。
18.含上述重组质粒的基因工程菌。
19.上述橙花叔醇合成酶突变体制备橙花叔醇的应用。
20.本发明的有益效果：利用橙花叔醇合成酶突变体(优选k235e，i241f，v321l及l471v),可用于制备具有较高利用价值的橙花叔醇。该反应具有成本低、绿色环保、工艺简单、催化效率高、无需添加外源性辅酶等优势,工业化前景广阔。
21.本发明实现了橙花叔醇合成酶canes2突变体的异源表达，将橙花叔醇在酿酒酵母中的产量大大提高，产量提高至50ml摇瓶发酵1.5g/l。同时canes2进行突变的方法对苦皮藤倍半萜化合物的形成机制和生物胁迫机理研究奠定基础。
附图说明：
22.图1为橙花叔醇合成酶基因canes2所编码的氨基酸突变的位点。
23.图2为橙花叔醇合成酶canes2的基因表达质粒(pesc-ura-canes2)示意图。
24.图3为基因工程重组菌株的橙花叔醇产量图。
具体实施方式
25.本发明从苦皮藤中挖掘的一条并经密码子优化的橙花叔醇合成酶基因canes2(seq idno.2)，利用相同功能的橙花叔醇合成酶氨基酸序列(seq id no.1)具有相似的进化保守区这一特点，对上述的橙花叔醇合成酶基因canes2核苷酸序列进行定点突变，并从中筛选出四种以橙花叔醇合成酶基因canes2表达质粒(pesc-ura-canes2)为载体，见图2，以酿酒酵母saccharomyces cerevisiae lwg003(文章来源：characterization of trans-nerolidol synthase from celastrusangulatus maxim and production of trans-nerolidol in engineeredsaccharomyces cerevisiae)为宿主，实现了橙花叔醇合成酶canes2突变体的异源表达，将橙花叔醇在酿酒酵母中的产量大大提高。
26.以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
27.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件进行。引物和序列为金唯智生物科技有限公司合成。
28.实施例1
29.利用序列比对工具mega-x及web-logo网站，将苦皮藤来源的并经密码子优化的橙花叔醇合成酶基因canes2编码的氨基酸序列与其它来源的橙花叔醇合成酶基因编码的氨基酸序列的比对，筛选出突变位点k235，i241，v321及l471，见图1。
30.实施例2
31.构建橙花叔醇合成酶突变体，包括如下步骤：
32.首先，委托金唯智公司合成经密码子优化的橙花叔醇合成酶基因(seq id no.2所示)。利用pcr技术，分别以seq id no.2所示的核苷酸序列为模板，以表1所示的引物对为上、下游引物，分别扩增得到canes2野生型及突变体基因(k235e，i241f，v321l及l471v)，经琼脂糖凝胶电泳验证后进行回收纯化。
33.表1引物序列表
[0034][0035]
实施例3
[0036]
构建含有编码橙花叔醇合成酶突变体基因的重组质粒
[0037]
选择pesc-ura空载质粒(市售)，使用限制性核酸内切酶bamhi和hind iii对空载质粒进行双酶切后经琼脂糖凝胶电泳验证后进行回收纯化。
[0038]
然后使用诺唯赞vazyme的同源重组酶cloneexpressⅱ对实施例2中扩增的canes2野生型及突变体基因和线性化pesc-ura空载质粒分别进行连接。混合好的连接混合物于37℃反应30min并通过大肠杆菌转化导入dh5α感受态。使用canes2-f/canes2-r引物pcr验证，将阳性条带对应的菌株送去dna测序，得到阳性canes2突变体重组质粒。
[0039]
实施例4
[0040]
重组酿酒酵母的构建
[0041]
分别以实施例3构建的野生型和突变体重组质粒作为橙花叔醇合成酶表达载体利用醋酸锂转化法导入酿酒酵母lwg003菌株。将转入重组质粒的酿酒酵母细胞涂布于sc-ura营养缺陷型筛选固体培养基平板，30℃培养箱培养2～3天，分别得到重组酿酒酵母菌株lwg003/pesc-ura-canes2(k235e)、lwg003/pesc-ura-canes2(i241f)、lwg003/pesc-ura-canes2(v321l)、lwg003/pesc-ura-canes2(l471v)以及橙花叔醇合成酶野生型表达菌株lwg003/pesc-ura-canes2。
[0042]
实施例5
[0043]
重组酿酒酵母菌株摇瓶发酵生产橙花叔醇
[0044]
挑取实施例4中构建的重组酿酒酵母菌株进行摇瓶发酵，橙花叔醇合成酶野生型
表达菌株作为对照。接单菌落于2ml sc-ura培养基中，于30℃摇床中220rpm培养16h。按初始od600为0.05转接于50mlsc-ura培养基中，进行摇瓶发酵培养。在24h时添加终浓度为10g/l的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加10％正十二烷进行双相发酵培养。于30h和54h时添加终浓度为10g/l的酒精进行补充微生物生长所需碳源。发酵截止时间为96h。如图3所示，lwg003/pesc-ura-canes2(k235e)、lwg003/pesc-ura-canes2(i241f)、lwg003/pesc-ura-canes2(v321l)、lwg003/pesc-ura-canes2(l471v)表达的k235e、i241f、v321l及l471v突变体的催化活性有所提高，
[0045]
橙花叔醇合成酶突变体为下列之一：
[0046]
seq id no.1氨基酸序列235位赖氨酸突变为谷氨酸；
[0047]
seq id no.1氨基酸序列241位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；
[0048]
seq id no.1氨基酸序列321位缬氨酸突变为亮氨酸；
[0049]
seq id no.1氨基酸序列471位亮氨酸突变为缬氨酸。
[0050]
橙花叔醇产量相比野生型表达菌株有明显提升，橙花叔醇的产量分别提高了1.6，3，1.8和1.7倍。
[0051]
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。

技术特征：
1.橙花叔醇合成酶突变体，其特征在于所述橙花叔醇合成酶突变体为下列之一：seq id no.1氨基酸序列235位赖氨酸突变为谷氨酸；seq id no.1氨基酸序列241位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；seq id no.1氨基酸序列321位缬氨酸突变为亮氨酸；seq id no.1氨基酸序列471位亮氨酸突变为缬氨酸。2.权利要求1所述橙花叔醇合成酶突变体的编码基因。3.含权利要求2所述编码基因的重组质粒。4.含权利要求3所述重组质粒的基因工程重组菌。5.权利要求4的基因工程重组菌制备橙花叔醇的应用。

技术总结
本发明公开了橙花叔醇合成酶突变体、基因、基因工程菌及其应用，橙花叔醇合成酶突变体，为下列之一：SEQ ID NO.1氨基酸序列235位赖氨酸突变为谷氨酸、241位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、321位缬氨酸突变为亮氨酸和471位亮氨酸突变为缬氨酸；本发明利用橙花叔醇合成酶突变体用于制备具有较高利用价值的橙花叔醇。该反应具有成本低、绿色环保、工艺简单、催化效率高、无需添加外源性辅酶等优势,工业化前景广阔。本发明实现了橙花叔醇合成酶CaNES2突变体的异源表达，将橙花叔醇在酿酒酵母中的产量大大提高。大提高。大提高。


技术研发人员：乔建军 李伟国 宋洪健 梁冬梅 陈瑞琦 王胜利
受保护的技术使用者：天津大学浙江研究院（绍兴）
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/19