一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用

1.本发明属于结核分枝杆菌技术领域，具体涉及一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌，俗称结核杆菌，是引发结核病的一种细菌。结核病是一种慢性传染性疾病，主要通过呼吸道传播，传染源主要是排菌的肺结核病人的痰。尽管结核病是一种可治愈的疾病，但结核病目前仍是全球十大死亡原因之一，并且全球的结核病发病率和死亡率下降缓慢。据世界卫生组织报道，2019年全球估计有1000万人罹患结核病和140万人死于结核病。
3.现有的结核病诊断方法包括痰涂片镜检法、分枝杆菌菌种鉴定法和痰结核菌常规培养法等。其中痰涂片镜检法快速和价廉，但无法辨别死菌活菌且特异性差；分枝杆菌菌种鉴定法可以精确地鉴定分枝杆菌的不同菌种，但操作复杂且部分使用的药品具有一定危险性；痰结核菌常规培养法可鉴定死菌活菌，但耗费时间长且敏感性低。此外由于结核分枝杆菌的细胞壁中含有大量类脂，占细菌干重的23.77％，其中40％为蜡质，并且结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，因此结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，导致提取结核分枝杆菌核酸较困难。
4.世界卫生组织于2015年提出《终结结核病战略》，即到2030年结核病死亡率和发病率分别降低90％和80％，到2035年结核病死亡率和发病率分别降低95％和90％。为了实现这个目标，本发明提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，提高结核病实验室诊断能力，缩短诊断时间，实行结核病的早期快速诊断及其耐药性检测，达到治疗用药有效和有针对性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，具体采用以下的技术方案：
6.一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法，包括以下步骤：
7.(1)配制液体培养基，所述液体培养基的原料包括牛初乳、葡萄糖、middlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80，其中所述牛初乳、葡萄糖、middlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80的质量比为1.5-2.5：2.0-3.0：1.0-1.8：1.2-2.4：0.05-0.15：0.5-0.7：0.6-1.0；
8.(2)液化痰液，收集患者痰液，加入1-2倍体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至所述患者痰液中，震荡，充分液化所述患者痰液；
9.(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.5-6.8，37℃培养，菌落生长10-14天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群；
10.(4)与裂解液混合，将步骤(3)获得的高浓度结核分枝杆菌群，加入1.0-1.2倍裂解
液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，裂解液由2-4mol/l尿素、2-4mol/l氯化钾、1.5-2.5mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、20-60g/l十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，所述裂解液ph＝6.0；
11.(5)离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置，磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液ph＝6.0；
12.(6)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0；
13.(7)使用纳米孔测序技术检测步骤(6)得到的结核分枝杆菌核酸，构建纳米孔测序文库。
14.优选的，步骤(1)具体步骤为：以质量份称取1.0-1.8份middlebrook 7h9肉汤基础，至200-350份蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加1.5-2.5份牛初乳、2.0-3.0份葡萄糖、1.2-2.4份椰汁、0.05-0.15份叶酸、0.5-0.7份甘油和0.6-1.0份吐温-80至middlebrook 7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基。
15.优选的，步骤(2)中，震荡25min-30min。
16.优选的，步骤(3)中，菌落生长12天。
17.优选的，步骤(6)中，所述清洗液为盐酸溶液，所述洗脱液为氢氧化钠溶液。
18.优选的，步骤(7)具体步骤为：
19.(1)设计结核分枝杆菌特异性分型基因is6100、hsp65、rpob和gyra引物；
20.(2)在各个正向引物-f的5’端加上tttctgttggtgctgatattg碱基填充序列，各个反向引物-r的5’端加上acttgcctgtcgctctatcttc碱基填充序列，得到含有第二轮pcr引物结合位点的扩增引物；
21.(3)将第二轮pcr引物结合位点的扩增引物稀释，混合各基因的正反向引物；其次将混合后的引物形成引物池；
22.(4)合成适用于第二轮pcr的barcode标签引物，将所有barcode干粉引物稀释，并将相同barcode的正反向引物混合，形成barcode引物池；
23.(5)用引物池对结核分枝杆菌核酸进行第一轮扩增并纯化；
24.(6)用barcode引物进行第二轮扩增并纯化；
25.(7)构建纳米孔测序文库并纯化。
26.优选的，is6100的引物序列包含具有seq01所示的核苷酸序列和包含具有seq02所示的核苷酸序列；hsp65的引物组包含具有seq03所示的核苷酸序列和包含具有seq04所示的核苷酸序列；rpob的引物组包含具有seq05所示的核苷酸序列和包含具有seq06所示的核苷酸序列；gyra的引物组包含具有seq07所示的核苷酸序列和包含具有seq08所示的核苷酸序列。
27.本发明还提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法在快速鉴定结核杆菌的应用。
28.本发明的有益效果为：由于结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，因此结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，导致提取结核分枝杆菌核酸较困难。本发明首先将牛初乳、葡萄
糖、mi ddlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80作为原料配制液体培养基，快速培养大量结核分枝杆菌，再将尿素、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、聚乙二醇辛基苯基醚、十六烷基三甲基溴化铵和磷酸钾缓冲液组成裂解液，高效提取结核分枝杆菌核酸，提高结核分枝杆菌核酸提取质量，最后使用纳米孔测序技术检测结核分枝杆菌核酸，缩短结核分枝杆菌核酸检测时间至1天内，并且检出率高，以达到快速鉴定结核分枝杆菌的目的，操作简单且流程短。
具体实施方式
29.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
30.实施例1
31.快速培养大量结核分枝杆菌：
32.(1)以质量份称取3g middlebrook 7h9肉汤基础，至600g蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加4g牛初乳、5g葡萄糖、3.6g椰汁、0.2g叶酸、1.2g甘油和1.6g吐温-80至middlebrook 7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基；
33.(2)收集患者痰液(患者为2022年南昌大学第一附属医院高新医院的结核病患者)，加入1.5倍体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至患者痰液中，震荡25min，充分液化患者痰液；
34.(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.5，37℃培养，菌落生长12天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群。
35.实施例2
36.快速培养大量结核分枝杆菌：
37.(1)以质量份称取2g middlebrook 7h9肉汤基础，至400g蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加3g牛初乳、4g葡萄糖、2.4g椰汁、0.1g叶酸、1.0g甘油和1.2g吐温-80至middlebrook 7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基；
38.(2)收集患者痰液(患者为2022年南昌大学第一附属医院高新医院的结核病患者)，加入等体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至患者痰液中，震荡30min，充分液化患者痰液；
39.(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.8，37℃培养，菌落生长10天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群。
40.实施例3
41.快速培养大量结核分枝杆菌：
42.(1)以质量份称取3.6g middlebrook 7h9肉汤基础，至600g蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加5g牛初乳、6g葡萄糖、4.8g椰汁、0.3g叶酸、1.4g甘油和2.0g吐温-80至middlebrook 7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基；
43.(2)收集患者痰液(患者为2022年南昌大学第一附属医院高新医院的结核病患者)，加入2倍体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至患者痰液中，震荡30min，充分液化患者痰液；
44.(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.5，37℃培养，菌落生长14天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群。
45.实施例4
46.高效提取结核杆菌核酸：
47.(1)向实施例1制备的高浓度结核分枝杆菌群加入1.2倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，使结核分枝杆菌灭活并释放核酸；裂解液由3mol/l尿素、3.5mol/l氯化钾、2mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、40g/l十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，用磷酸调整ph＝6.0；
48.(2)12000rpm离心混合液5min，吸取1000μl上清液至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠溶液600μl，混匀，静置5min；
49.(3)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0。将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体，将离心管取下，加入500μl ph＝4.0的盐酸溶液，震荡混匀30s；将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；将离心管取下，加入100μl ph＝9.0的氢氧化钠溶液洗脱液，吹打混匀，静置3min；将离心管置于磁力架上静置；将上清液转移到新的离心管中，得到结核分枝杆菌核酸。
50.实施例5
51.高效提取结核杆菌核酸：
52.(1)向实施例2制备的高浓度结核分枝杆菌群加入1倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，使结核分枝杆菌灭活并释放核酸；裂解液由4mol/l尿素、4mol/l氯化钾、2.5mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、60g/l十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，用磷酸调整ph＝6.0；
53.(2)12000rpm离心混合液5min，吸取1000μl上清液至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠溶液600μl，混匀，静置5min；
54.(3)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0。将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体，将离心管取下，加入500μl ph＝4.0的盐酸溶液，震荡混匀30s；将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；将离心管取下，加入100μl ph＝9.0的氢氧化钠溶液洗脱液，吹打混匀，静置3min；将离心管置于磁力架上静置；将上清液转移到新的离心管中，得到结核分枝杆菌核酸。
55.对比例1
56.培养结核分枝杆菌：
57.(1)以质量份称取3g middlebrook 7h9肉汤基础，至600g蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加4g牛初乳、5g葡萄糖、1.2g
甘油和1.6g吐温-80至middlebrook 7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基；
58.(2)收集患者痰液(患者为2022年南昌大学第一附属医院高新医院的结核病患者)，加入1.5倍体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至患者痰液中，震荡25min，充分液化患者痰液；
59.(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.5，37℃培养，菌落生长12天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群。
60.对比例2
61.提取结核杆菌核酸：
62.(1)向实施例1制备的高浓度结核分枝杆菌群加入1.2倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，使结核分枝杆菌灭活并释放核酸；裂解液由3mol/l尿素、4mol/l氯化钾、1％聚乙二醇辛基苯基醚和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，用磷酸调整ph＝6.0；
63.(2)12000rpm离心混合液5min，吸取1000μl上清液至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠溶液600μl，混匀，静置5min；
64.(3)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0。将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体，将离心管取下，加入500μl ph＝4.0的盐酸溶液，震荡混匀30s；将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；将离心管取下，加入100μl ph＝9.0的氢氧化钠溶液洗脱液，吹打混匀，静置3min；将离心管置于磁力架上静置；将上清液转移到新的离心管中，得到结核分枝杆菌核酸。
65.对比例3
66.提取结核杆菌核酸：
67.(1)向对比例1制备的高浓度结核分枝杆菌群加入1.2倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，使结核分枝杆菌灭活并释放核酸；裂解液由3mol/l尿素、3.5mol/l氯化钾、2mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、40g/l十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，用磷酸调整ph＝6.0；
68.(2)12000rpm离心混合液5min，吸取1000μl上清液至离心管，加入重悬好的含有聚乙烯亚胺修饰的磁珠溶液600μl，混匀，静置5min；
69.(3)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0。将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体，将离心管取下，加入500μl ph＝4.0的盐酸溶液，震荡混匀30s；将离心管置于磁力架上静置1min，除去离心管内液体；将离心管取下，加入100μl ph＝9.0的氢氧化钠溶液洗脱液，吹打混匀，静置3min；将离心管置于磁力架上静置；将上清液转移到新的离心管中，得到结核分枝杆菌核酸。
70.实施例6
71.使用纳米孔测序技术检测结核分枝杆菌核酸，构建纳米孔测序文库：
72.(1)设计结核分枝杆菌特异性分型基因is6100、hsp65、rpob和gyra引物，具体引物序列信息如表1所示；
73.(2)在各个正向引物-f的5’端加上tttctgttggtgctgatattg碱基填充序列，各个反向引物-r的5’端加上acttgcctgtcgctctatcttc碱基填充序列，得到含有第二轮pcr引物结合位点的扩增引物，具体引物序列如表2所示；
74.(3)将表2中所有引物稀释至100μm，等比例混合各基因的正反向引物；其次将混合后的引物形成引物池，引物池中is6100、hsp65、rpob、gyra对应的引物浓度比例为0.5：1：1.2：1。不同比例的引物混合也可实现本发明结果，该比例混合是一种优选。
75.(4)合成适用于第二轮pcr的barcode标签引物，每个barcode引物对应一个样本，使每个样本带有不同的barcode标签。将所有barcode干粉引物稀释到10μm，并将相同barc ode的正反向引物等比例混合，形成barcode引物池，具体引物序列如表3所示。
76.(5)用混合后的引物池对实施例4、实施例5、对比例2和对比例3获得的结核分枝杆菌核酸进行pcr扩增(加上1个pcr阴性对照)：反应总体系为50μl，其中2
×
phusionhfbu fferpcrmastermix(neb)25μl，优化引物池5μl，核酸50ng，ddh2o补至50μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火60s，每个循环降低1℃，72℃延伸15s，10个循环；95℃变性15s，62℃退火60s，72℃延伸15s，20个循环；循环结束后72℃延伸5min，4℃保存。
77.在50μl多重pcr产物中加入30μl ampurexpbeads，吹打混匀后室温静置5min，使磁珠与pcr产物充分结合；将纯化体系置于磁力架上，等待5min直至磁珠完全吸附于磁力架一侧，去除上清液；加入200μl新鲜配制的80％乙醇，磁力架上静置30s后，弃上清液，并重复洗涤一次，充分去除杂质；使用移液器充分去除残留的乙醇，开盖室温风干5min，待磁珠干燥；从磁力架上取下纯化管，加入25μl ddh2o洗脱核酸，吹打混匀，使得磁珠处于完全悬浮状态，室温静置3min，充分洗脱核酸；重新将纯化管置于磁力架上静置3min，待磁珠完全吸附于磁力架一侧，吸取23μl洗脱液用于第二轮扩增。
78.(6)用barcode标签引物(bc01-bc05)进行二轮pcr扩增，使不同样本带上不同的标签，以便于一起混合上机测序。反应体系为50μl，其中2
×
phusionhfbufferpcrmastermix(neb)25μl，barcode引物2μl，第一轮扩增纯化后产物23μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，6个循环；循环结束后72℃延伸5min，4℃保存。
79.在50μl多重pcr产物中加入30μl ampurexpbeads，吹打混匀后室温静置5min，使磁珠与pcr产物充分结合；将纯化体系置于磁力架上，等待5min直至磁珠完全吸附于磁力架一侧，去除上清液；加入200μl新鲜配制的80％乙醇，磁力架上静置30s后，弃上清液，并重复洗涤一次，充分去除杂质；使用移液器充分去除残留的乙醇，开盖室温风干5min，待磁珠干燥；从磁力架上取下纯化管，加入30μl ddh2o洗脱核酸，吹打混匀，使得磁珠处于完全悬浮状态，室温静置3min，充分洗脱核酸；重新将纯化管置于磁力架上静置3min，待磁珠完全吸附于磁力架一侧，吸取27μl用于文库构建。
80.(7)构建纳米孔测序文库并纯化：
81.①
文库混合(pooling)：将二轮扩增后的5份纯化产物按照每个样本100ng进行poolin g(不足100ng的加10μl)，然后用ddh2o补充总体积至50μl。
82.②
末端修复和3’端加a尾：总反应体系为65μl，混合后的dna溶液50μl，末端修复mix(vazyme)15μl。反应程序为：30℃反应15min，65℃终止反应15min，4℃保存。
⑧⑨⑩
83.③
末端修复产物纯化：在65μlpcr产物加入39μlampurexpbeads，之后纯化方式与步骤(5)中的磁珠纯化方法相同，最后洗脱dna时用30μlddh2o洗脱，取25μl用于接头连接反
应。
84.④
纳米孔测序接头连接：总反应体系为50μl，末端修复纯化产物25μl，5
×
ligatio nbuffer(neb)10μl，t4rapiddnaligase(neb)8μl，adaptermix(nanopore)1μl，ddh2o6μl。反应程序为：20℃反应15min，4℃保存。
85.⑤
接头连接产物纯化：在50μl接头连接产物中加入30μlampurexpbeads，吹打混匀后室温静置5min，使磁珠与pcr产物充分结合；将纯化体系置于磁力架上，等待5min直至磁珠完全吸附于磁力架一侧，使用移液器去除上清；加入200μlsfb(nanoporelsk109试剂盒提供)，磁力架上静置30s后弃上清，重复一次；吸干净残留的sfb，开盖室温晾干5min，待磁珠干燥即加入15μlddh2o洗脱dna；吹打混匀后室温静置3min，吸取13μl即得到终文库。
86.⑥
进行纳米孔测序：使用nanopore公司的minion测序仪(测序试剂盒：sqk-lsk109，测序芯片：r9)r9芯片，在样本加入芯片前进行芯片活性诱发5min，使芯片中的保存液完全被测序缓冲液替代；按照牛津纳米孔官方说明进行文库loading；测序试剂盒选择sqk-lsk109，选择trimbarcode，测序模式选择highaccuracy模式进行纳米孔测序。
87.⑦
数据库分析比对：测序数据下机后，纳米孔测序仪对测序结果进行自动转化，生成fastq格式的测序文件进行后续分析。下机数据进行质控分析，质控流程选择qscore≥9去除低质量reads与接头序列；将序列长度小于450bp或者大于750bp的序列进行过滤，得到符合预期设计的目标序列；目标序列与数据库中的结核分枝杆菌基因组序列进行比对；生成检测到的物种以及序列数，如表4所示。
88.表1结核分枝杆菌特异性引物序列
89.引物名称引物序列(5'-3')序列编号my-is6100-fgtggccaactcgacatccseq01my-is6100-ragtgtggctaaccctgaaccseq02my-hsp65-faacgtcgtcctggaraagaaseq03my-hsp65-rgtcgagaccttggagctgacseq04my-rpob-fcggtcgctataaggtcaacaaseq05my-rpob-rcggycgctayaaggtcaacaaseq06my-gyra-fggatcgaaccggttgacatcseq07my-gyra-rgattctccagcgcccagaaseq08
90.表2结核分枝杆菌相关基因扩增引物
91.引物名称引物序列(5'-3')序列编号tngs-my-is6100-ftttctgttggtgctgatattgcgtggccaactcgacatccseq09tngs-my-is6100-racttgcctgtcgctctatcttcagtgtggctaaccctgaaccseq10tngs-my-hsp65-ftttctgttggtgctgatattgcaacgtcgtcctggaraagaaseq11tngs-my-hsp65-racttgcctgtcgctctatcttcgtcgagaccttggagctgacseq12tngs-my-rpob-ftttctgttggtgctgatattgccggtcgctataaggtcaacaaseq13tngs-my-rpob-racttgcctgtcgctctatcttccggycgctayaaggtcaacaaseq14tngs-my-gyra-ftttctgttggtgctgatattgcggatcgaaccggttgacatcseq15tngs-my-gyra-racttgcctgtcgctctatcttcgattctccagcgcccagaaseq16
92.表3 barcode引物
[0093][0094][0095]
表4 4个样品和阴性对照组的检测序列数
[0096]
实施例4实施例5对比例2对比例3阴性对照组is6100186416429358960hsp651935175710249220rpob157214948786300gyra132012637965940
[0097]
综上所述，(1)本发明将牛初乳、葡萄糖、middlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80作为原料配制液体培养基，其中椰汁、叶酸等具有协同作用，加快结核杆菌培养速率；(2)因为结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，因此结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，导致提取结核分枝杆菌核酸较困难，本发明利用磁珠法提取核酸，使用的裂解液加入了三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、聚乙二醇辛基苯基醚、十六烷基三甲基溴化铵，溶解荚膜，提高核酸提取效率，并且氯化钾调节渗透压，保护核酸，提高结核分枝杆菌核酸提取质量；(3)本发明使用纳米孔测序技术将检测时间缩短至1天内，设计结核分枝杆菌特异性分型基因is6100、hsp65、rpob和gyra引物，利用多重pcr技术将待测病原菌靶基因在一个反应中进行扩增，可以同时检测多种结核分枝杆菌。
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以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

技术特征：
1.一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制液体培养基，所述液体培养基的原料包括牛初乳、葡萄糖、middlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80，其中所述牛初乳、葡萄糖、middlebrook 7h9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80的质量比为1.5-2.5：2.0-3.0：1.0-1.8：1.2-2.4：0.05-0.15：0.5-0.7：0.6-1.0；(2)液化痰液，收集患者痰液，加入1-2倍体积的质量百分含量为4％的naoh溶液至所述患者痰液中，震荡，充分液化所述患者痰液；(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整ph至6.5-6.8，37℃培养，菌落生长10-14天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群；(4)与裂解液混合，将步骤(3)获得的高浓度结核分枝杆菌群，加入1.0-1.2倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，裂解液由2-4mol/l尿素、2-4mol/l氯化钾、1.5-2.5mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、20-60g/l十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/l磷酸钾缓冲液组成，所述裂解液ph＝6.0；(5)离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置，磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液ph＝6.0；(6)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液ph＝4.0,所述洗脱液ph＝9.0；(7)使用纳米孔测序技术检测步骤(6)得到的结核分枝杆菌核酸，构建纳米孔测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体步骤为：以质量份称取1.0-1.8份middlebrook 7h9肉汤基础，至200-350份蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到middlebrook 7h9肉汤基础溶液，添加1.5-2.5份牛初乳、2.0-3.0份葡萄糖、1.2-2.4份椰汁、0.05-0.15份叶酸、0.5-0.7份甘油和0.6-1.0份吐温-80至middlebrook7h9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，震荡25min-30min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，菌落生长12天。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述清洗液为盐酸溶液，所述洗脱液为氢氧化钠溶液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)具体步骤为：(1)设计结核分枝杆菌特异性分型基因is6100、hsp65、rpob和gyra引物；(2)在各个正向引物-f的5’端加上tttctgttggtgctgatattg碱基填充序列，各个反向引物-r的5’端加上acttgcctgtcgctctatcttc碱基填充序列，得到含有第二轮pcr引物结合位点的扩增引物；(3)将第二轮pcr引物结合位点的扩增引物稀释，混合各基因的正反向引物；其次将混合后的引物形成引物池；(4)合成适用于第二轮pcr的barcode标签引物，将所有barcode干粉引物稀释，并将相同barcode的正反向引物混合，形成barcode引物池；(5)用引物池对结核分枝杆菌核酸进行第一轮扩增并纯化；
(6)用barcode引物进行第二轮扩增并纯化；(7)构建纳米孔测序文库并纯化。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，is6100的引物序列包含具有seq01所示的核苷酸序列和包含具有seq02所示的核苷酸序列；hsp65的引物组包含具有seq03所示的核苷酸序列和包含具有seq04所示的核苷酸序列；rpob的引物组包含具有seq05所示的核苷酸序列和包含具有seq06所示的核苷酸序列；gyra的引物组包含具有seq07所示的核苷酸序列和包含具有seq08所示的核苷酸序列。8.一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法在快速鉴定结核杆菌的应用。

技术总结
本发明公开了一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，包括以下步骤：(1)配制液体培养基；(2)液化痰液；(3)菌群培养；(4)与裂解液混合；(5)离心混合液；(6)洗脱核酸；(7)纳米孔测序技术检测核酸。本发明首先将牛初乳、葡萄糖、Middlebrook7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温-80配制液体培养基，快速培养大量结核分枝杆菌，再将尿素、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、聚乙二醇辛基苯基醚、十六烷基三甲基溴化铵和磷酸钾缓冲液组成裂解液，高效提取结核分枝杆菌核酸，提高结核分枝杆菌核酸提取质量，最后使用纳米孔测序技术检测结核分枝杆菌核酸，缩短检测时间至1天内，并且检出率高，以达到快速鉴定结核分枝杆菌的目的。以达到快速鉴定结核分枝杆菌的目的。


技术研发人员：陈开森 夏良华 于圣铭
受保护的技术使用者：南昌市高新区人民医院（南昌大学第一附属医院高新医院）
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/19