一种金刚烷胺鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物的制备及应用

1.本发明属于医药化工领域，涉及一种金刚烷胺和鬼臼毒素偶联物的制备方法，环糊精包合物的制备方法和自组装形成纳米粒子的制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是由异常状态细胞生长引起的疾病，是导致全球非自然死亡的第二大疾病，是引发人类健康威胁的主要疾病之一。为了治疗癌症，研究人员从自然资源中寻找有前途的抗癌药物，同时世界各地的科学家小组也在探索合成抗癌新分子药物。其中鬼臼毒素是一种天然存在木脂类抗肿瘤成份，作为治疗多种不同类型癌症的化疗药物，如宫颈癌、骨肉瘤、鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌和睾丸癌。由于其广泛的药理活性，已成为很有吸引力的研究对象之一。鬼臼毒素是拓扑异构酶抑制剂依托泊苷的天然产物前体，半合成抗癌药物依托泊苷和替尼泊苷的创新激发了人们对这种结构表型的长期研究兴趣。鬼臼毒素衍生物以成为近几十年来广泛的化学修饰和药理研究中心。但是未修饰的鬼臼毒素存在水溶性差，生物利用度低，对正常细胞毒性大的缺点，以及缺乏对肿瘤细胞的选择性，使其抗肿瘤应用受到限制。
3.癌症的治疗方法目前临床上主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗等。化疗药物一般都具有很大的细胞毒性，药物通过血管带到全身，对体内癌细胞以及正常细胞都有很大的破坏作用，毒副作用十分明显。因此如何将化疗药物定向带到恶性肿瘤组织从而靶向杀伤癌细胞且不影响正常细胞从而提高患者生存率和生活质量成为了人们努力的方向。
4.环糊精是由d-型吡喃葡萄糖通过α-1,4糖苷键首尾相连而成的环状低聚糖，它主要包括α-，β-，γ-环糊精三种，它的分子呈锥桶状的立体结构，其分子具有亲水的外壁和疏水的内空腔。环糊精可广泛应用于药品、食品、化妆品制造业等，在制药业中，主要用于增加药物的溶解度、稳定性和生物利用度。且环糊精在包合疏水药物后通常具有两亲性，使其能自组装形成纳米粒子，这有可能克服耐药机制。同时，为了改善鬼臼毒素和金刚烷胺的水溶性、增加其稳定性、降低毒副作用，需要寻求在细胞环境中具有响应性键合基团，使鬼臼毒素和金刚烷胺同时键合到聚合物分子中，使聚合物偶联物在肿瘤部位作用时能及时有效地释放两种药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种含有肿瘤部位或肿瘤细胞内微环境敏感键的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物的制备方法，再利用金刚烷胺和环糊精强的非共价结合能力形成包合物。包合物又具有两亲性可在水中自组装形成纳米粒子。增强了鬼臼毒素的水溶性，在肿瘤细胞内更易于释放鬼臼毒素。该抗癌药对癌细胞具有一定的选择性、以及对正常细胞较低的毒副作用。其制备方法简单且产率较高，适于放大合成和实际生产应用。
6.基于此，本发明设计了一系列氧化还原敏感的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物的制备方法。并对其使用环糊精进行包合以提高水溶性，在水中包合物可自组装形成纳米粒子，可
提高在肿瘤部位的药物积累，将其应用于抗肿瘤研究。
7.本发明的目的是设计和制备一系列氧化还原敏感的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物，制备不同环糊精的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物包合物，以及构建金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物的纳米药物传递系统，并比较不同环糊精包合对药物释放和抗肿瘤效果的影响。
8.术语说明：
9.室温是指25℃
10.本发明的技术方案：
11.一种被动靶向传递抗癌药物鬼臼毒素的组装体，是基于环糊精和金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物组合的纳米球组装体。
12.一种被动靶向传递抗癌药物鬼臼毒素的组装体的制备方法，步骤如下：
13.1)二硫代二丙酸修饰的鬼臼毒素化合物1的合成：
14.先将乙酰氯进行重蒸处理，重蒸后的乙酰氯中加入二硫代二丙酸，在65℃下冷凝回流反应6h，反应结束后冷却至室温在进行减压旋蒸处理去掉大部分的乙酰氯，剩余液体倒入冷乙醚中进行沉淀，过滤去掉滤液，重复三次，将固体加入到二氯甲烷中，再加入鬼臼毒素，4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。接着在机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物1。结构式如下：
[0015][0016]
金刚烷胺修饰鬼臼毒素-二硫代二丙酸化合物2的合成：
[0017]
把化合物1和金刚烷胺按一定的比例加入到二氯甲烷中，再加入4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。接着在机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物2。结构式如下：
[0018]
[0019]
2)金刚烷胺和硫代二丙酸的直接偶联：
[0020]
将3,3
’‑
硫代二丙酸加入到n,n-2-甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶剂中，再加入4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在将溶解了金刚烷胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶剂中，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。接着在机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-硫代二丙酸单酯。结构式为：
[0021][0022]
3)金刚烷胺-硫代二丙酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0023]
把金刚烷胺-硫代二丙酸单酯和鬼臼毒素按1:1的比例加入到二氯甲烷中，再加入的4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-硫代二丙酸酯-鬼臼毒素。结构式为：
[0024][0025]
4)金刚烷胺和二硫代二乙酸的直接偶联：
[0026]
将2,2
’‑
二硫代二乙酸加入到n,n-2-甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶剂中，再加入4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在将溶解着金刚烷胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶剂中，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯。结构式为：
[0027][0028]
5)金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0029]
把金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯和鬼臼毒素按1:1的比例加入到二氯甲烷中，在加入的4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌反应，反应
结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-二硫代二乙酸酯-鬼臼毒素。结构式为：
[0030][0031]
6)金刚烷胺和二硫代二丁酸的直接偶联：
[0032]
将4,4
’‑
二硫代二丁酸加入到n,n-2-甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶剂中，在加入4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在将溶解着金刚烷胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶剂中，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯。结构式为：
[0033][0034]
7)金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0035]
把金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯和鬼臼毒素按1:1的比例加入到二氯甲烷中，再加入的4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌反应，反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应液除去4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤有机相使ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得金刚烷胺-二硫代二丁酸酯-鬼臼毒素。结构式为：
[0036][0037]
8)环糊精和金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素包合物的制备：
[0038]
称取一定量的β-环糊精溶解在甲醇-水溶液中，完全溶解后再称取一定量的金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素加入到溶液中，放置在室温中，持续搅拌，滤纸过滤去除未被包合的金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素，将滤液进行冷冻干燥，可得白色固体金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/β-环糊精包合物。
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1～1:10。
[0056]
所述含有使用的固体化合物的二氯甲烷溶液中，固体化合物的浓度为0.01mmol/ml～1mmol/ml。
[0057]
所述的环糊精与金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素的摩尔比为1:1～30:1
[0058]
所述的含有环糊精的甲醇-水溶液中，环糊精的浓度为0.001mmol/ml～10mmol/ml，含有金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素的甲醇-水溶液中，金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素的浓度为0.001mmol/ml～10mmol/ml。
[0059]
所述含有金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/环糊精包合物的水溶液中，金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/环糊精包合物的浓度为0.01mmol/ml～1mmol/ml。
[0060]
加热反应的温度为15～65℃；加热反应的时间为6h～24h。
[0061]
所用环糊精为阿尔法环糊精、倍他环糊精、伽马环糊精、羟丙基倍他环糊精、甲基倍他环糊精、羟丙基伽马环糊精、羟丙基阿尔法环糊精、磺丁基倍他环糊精等。
[0062]
其他金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物的使用量和金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素一致。
[0063]
本发明的优点是：制备的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精纳米粒子不仅具有肿瘤细胞敏感键，还通过环糊精增加鬼臼毒素的水溶性的同时降低鬼臼毒素对正常细胞的毒性。因为包合物可以自组装形成纳米粒子，所以抗癌药物鬼臼毒素可以通过epr效应被动靶向到癌细胞当中，从而实现抗癌药物对癌细胞的选择性杀伤，减少对正常细胞的毒副作用。该药物传递系统与直接使用鬼臼毒素相比，明显提高了鬼臼毒素的水溶性，降低了毒副作用，提高了生物利用度。因为肿瘤细胞中谷胱甘肽(gsh)浓度比正常细胞中的浓度更高，所以二硫键能够在肿瘤细胞中高浓度的谷胱甘肽条件下发生断裂，从而达到释放药物的目的；在肿瘤细胞的特征之一是活性氧的浓度很高，而单硫键对于活性氧及其敏感，很容易发生断裂。因此选用二硫键或者单硫键作为鬼臼毒素和金刚烷胺的中间连接子。再利用金刚烷胺和β-环糊精之间强的非共价结合能力来増强鬼臼毒素的水溶性。因为环糊精包合物具有两亲性，可以自组装形成纳米粒子。而纳米粒子可在癌细胞处聚集，这为癌细胞对纳米粒子进行内吞作用提供了条件，从而可将抗癌药物运送到癌细胞内。该工艺的制备过程简单，易于实施并且材料成本低，在癌症的靶向治疗领域有较大的应用前景。
附图说明
[0064]
图1为游离鬼臼毒素、金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/β-环糊精包合物、金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物在相同浓度下的hela细胞活性。
[0065]
图2为游离鬼臼毒素、金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/β-环糊精包合物、金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物在不同缓冲液条件下释放鬼臼毒素的释放。
[0066]
图3为金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物的sem。
[0067]
图4为金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物制备成纳米后的dls的粒径。
[0068]
图5为金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物制备成纳米
粒子后的zate电位。
[0069]
图6为金刚烷胺-二硫代二丙酸酯-鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精包合物纳米制备过程中的丁达尔效应。
具体实施方式
[0070]
下面结合实例对本发明进一步说明，本发明的实例仅仅是用于说明本发明，而不是限制本发明。依据上述说明内容，由本领域技术人员在不偏离本发明技术思想范围内，进行若干推演、替换以及多样化的变更和修改，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0071]
实例1：
[0072]
金刚烷胺和鬼臼毒素偶联物的制备，步骤如下：
[0073]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸单酯化合物1的合成：
[0074]
将20ml的乙酰氯进行重蒸处理，称取3’3-二硫代二丙酸2.51g(0.0119mol)，加入到乙酰氯中，在65℃下搅拌反应6h，同时冷凝回流，反应完成后溶液从无色变成橙黄色溶液，反应结束后加入一定量甲苯在旋蒸除去乙酰氯，旋蒸一般重复3-4次，可得油状物体，加入少量dmso进行溶解，将液体倒入搅拌中的冷乙醚中进行沉淀，抽滤获得固体，在45℃下真空干燥4h。可得二硫代二丙酸酐0.826g，产率为32％。称取二硫代二丙酸酐332.4mg(1.73mmol)溶解在15ml的二氯甲烷中，再加入鬼臼毒素41.4mg(0.1mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap)18.2mg(0.14mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)26.7mg(0.14mmol)，常温下反应一晚上，经过tlc确认反应结束，再使用稀盐酸洗涤反应除出4-二甲氨基吡啶，重复三次，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，在使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物1鬼臼毒素-二硫代二丙酸单酯28.152mg(0.046mmol)，产率为52.3％。
[0075]
检测显示本发明制备的鬼臼毒素-二硫代二丙酸单酯的核磁表征如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):6.80(s,2'-h),6.54(s,5'-h),6.40(s,2,6-h),6.01～5.99(d,10'-h),5.94～5.93(d,7'-h),4.61～4.60(d,7-h),4.42～4.39(t,9'-h),4.23～4.18(t,9'-h),3.81～3.76(t,10,11,12-h),3.01～2.95(m,14,15-h),2.93～2.87(d,8-h),2.87～2.81(m,13,16-h),2.80～2.76(s,8'-h).
[0076]
金刚烷胺修饰鬼臼毒素-二硫代二丙酸单酯化合物2的合成：
[0077]
把化合物1鬼臼毒素-二硫代二丙酸单酯60.6mg(0.1mmol)和金刚烷胺15.1mg(0.1mmol)加入到5ml的二氯甲烷中，再加入的4-二甲氨基吡啶18.2mg(0.14mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐26.7mg(0.14mmol)，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物2鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺(ppt-ss-ad)45.1mg(0.061mmol)，产率为61％。
[0078]
检测显示本发明制备的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺的核磁表征如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):6.80(s,9-h),6.54(s,6-h),6.40(s,20,24-h),6.01～5.99(d,1-h),5.94～5.93(d,10-h),5.24～5.17(d,49-h),4.61～4.60(d,13-h),4.42～4.39(t,16-h),4.23～4.18(t,16-h),3.81～3.76(t,26,29,51-h),3.01～2.70(m,31,32,53,
56-h),2.51～2.47(m,11,12-h),2.15～2.01(d,43,45,46-h),2.01～1.95(d,41,42,44-h),1.71～1.64(d,47,48,50-h).
[0079]
实例2：
[0080]
金刚烷胺和硫代二丙酸的直接偶联：
[0081]
将3,3
’‑
硫代二丙酸(178.2mg)加入到n,n-2-甲基甲酰胺(1ml)和二氯甲烷(5ml)的混合溶剂中，再加入4-二甲氨基吡啶(142mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(200mg)，再将溶解着金刚烷胺(151mg)的二氯甲烷(4ml)溶液滴加到混合溶剂中，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-硫代二丙酸单酯(180.7mg)。
[0082]
金刚烷胺和硫代二丙酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0083]
把金刚烷胺-硫代二丙酸单酯(325mg)和鬼臼毒素(400mg)加入到二氯甲烷(10ml)中，再加入的4-二甲氨基吡啶(132mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(191mg)，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-硫代二丙酸酯-鬼臼毒素(334.35mg)。检测显示本发明制备的鬼臼毒素-硫代二丙酸酯-金刚烷胺的核磁表征如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):6.80(s,9-h),6.54(s,6-h),6.40(s,20,24-h),6.01～5.99(d,1-h),5.94～5.93(d,10-h),5.24～5.17(d,49-h),4.61～4.60(d,13-h),4.42～4.39(t,16-h),4.23～4.18(t,16-h),3.81～3.76(t,26,29,51-h),3.01～2.65(m,32,33,49,50-h),2.51～2.47(m,11,12-h),2.15～2.01(d,41,43,44-h),2.01～1.95(d,39,42,40-h),1.71～1.64(d,46,47,45-h).
[0084]
实例3：
[0085]
金刚烷胺和二硫代二乙酸的直接偶联：
[0086]
将2,2
’‑
二硫代二乙酸(182mg)加入到n,n-2-甲基甲酰胺(1ml)和二氯甲烷(5ml)的混合溶剂中，再加入4-二甲氨基吡啶(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(200mg)，再将溶解着金刚烷胺(151mg)的二氯甲烷(4ml)溶液滴加到混合溶剂中，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯(200mg)。
[0087]
金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0088]
把金刚烷胺-二硫代二乙酸单酯(310mg)和鬼臼毒素(400mg)加入到二氯甲烷中，再加入的4-二甲氨基吡啶(132mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(191mg)，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-二硫代二乙酸酯-鬼臼毒素(398mg)。检测显示本发明制备的鬼臼毒素-二硫代二乙酸酯-金刚烷胺的核磁表征如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):6.80(s,2'-h),6.54(s,6-h),6.40(s,20,24-h),6.01～5.99(d,1-h),5.94～5.93(d,10-h),5.24～5.17(d,47-h),4.61～4.60(d,13-h),4.42～4.39
(t,16-h),4.23～4.18(t,16-h),3.81～3.76(t,26,29,30-h),3.01～2.85(m,32,49-h),2.51～2.47(m,11,12-h),2.15～2.01(d,40,42,43-h),2.01～1.95(d,38,39,41-h),1.71～1.64(d,44,45,46-h).
[0089]
实例4：
[0090]
金刚烷胺和二硫代二丁酸的直接偶联：
[0091]
将4,4
’‑
二硫代二丁酸(238mg)加入到n,n-2-甲基甲酰胺(2ml)和二氯甲烷(8ml)的混合溶剂中，再加入4-二甲氨基吡啶(150mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(210mg)，再将溶解着金刚烷胺(151mg)的二氯甲烷(10ml)溶液滴加到混合溶剂中，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，用水洗涤使有机相的ph为中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯(248mg)。
[0092]
金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯与鬼臼毒素的直接偶联：
[0093]
把金刚烷胺-二硫代二丁酸单酯(371mg)和鬼臼毒素(410mg)加入到二氯甲烷中，再加入的4-二甲氨基吡啶(150mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(210mg)，在常温反应一晚上，利用tlc对反应进行检测，反应完成后使用稀盐酸洗去4-二甲氨基吡啶，再用水调节ph到中性。有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，过滤去除固体，再使用柱层析进行提纯。减压蒸馏获得化合物金刚烷胺-二硫代二丁酸酯-鬼臼毒素(405mg)。检测显示本发明制备的鬼臼毒素-二硫代二丁酸酯-金刚烷胺的核磁表征如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):6.80(s,2'-h),6.54(s,6-h),6.40(s,20,24-h),6.01～5.99(d,1-h),5.94～5.93(d,10-h),5.24～5.17(d,47-h),4.61～4.60(d,13-h),4.42～4.39(t,16-h),4.23～4.18(t,16-h),3.81～3.76(t,26,29,30-h),3.05～2.45(m,32,50,51,49,52,53-h),2.51～2.47(m,11,12-h),2.15～2.01(d,40,42,43-h),2.01～1.95(d,38,39,41-h),1.71～1.64(d,44,45,46-h).
[0094]
实例5：
[0095]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺和β-环糊精包合物的制备：
[0096]
称取β-环糊精(113.5mg)溶解在20ml甲醇-水(v:v＝50:50)的混合溶液中,搅拌到全部溶解，再取37mg的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺加入到混合溶液中，将其放置与室温下搅拌24h，完成后把溶液过滤，除掉未反应的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺，再将溶液装入西林瓶中进行冷冻干燥，及可得鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/β-环糊精包合物制备过程完成后取少量的冻干产物使用去离子水溶解，使用紫外可见分光光度计下检测包合物的吸收波长。
[0097]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺和羟丙基-β-环糊精包合物的制备：
[0098]
称取羟丙基-β-环糊精(113.5mg)溶解在20ml甲醇-水(v:v＝50:50)的混合溶液中,搅拌到全部溶解，再取37mg的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺加入到混合溶液中，将其放置与室温下搅拌24h，完成后把溶液过滤，除掉未反应的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺，再将溶液装入西林瓶中进行冷冻干燥，及可得鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/羟丙基-β-环糊精包合物制备过程完成后取少量的冻干产物使用去离子水溶解，使用紫外可见分光光度计下检测包合物的吸收波长。
[0099]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺和磺丁基-β-环糊精包合物的制备：
[0100]
称取磺丁基-β-环糊精(113.5mg)溶解在20ml甲醇-水(v:v＝50:50)的混合溶液中，搅拌到全部溶解，再取37mg的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺加入到混合溶液中，将其放置与室温下搅拌24h，完成后把溶液过滤，除掉未反应的鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺，再将溶液装入西林瓶中进行冷冻干燥，及可得鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/磺丁基-β-环糊精包合物制备过程完成后取少量的冻干产物使用去离子水溶解，使用紫外可见分光光度计下检测包合物的吸收波长。
[0101]
实例6：
[0102]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/β-环糊精包合物纳米药物的制备：
[0103]
取鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/β-环糊精10mg溶解在2ml的去离子水中，完全溶解后放置到超声波清洗器中进行超声处理，35％的功率超声20分钟，超声完成后使用激光笔观察溶液，能看到明显的丁达尔效应。
[0104]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/羟丙基-β-环糊精包合物纳米药物的制备：
[0105]
取鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/羟丙基-β-环糊精10mg溶解在2ml的去离子水中，完全溶解后放置到超声波清洗器中进行超声处理，35％的功率超声20分钟，超声完成后使用激光笔观察溶液，能看到明显的丁达尔效应。
[0106]
鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/磺丁基-β-环糊精包合物纳米药物的制备：
[0107]
取鬼臼毒素-二硫代二丙酸酯-金刚烷胺/磺丁基-β-环糊精10mg溶解在2ml的去离子水中，完全溶解后放置到超声波清洗器中进行超声处理，35％的功率超声20分钟，超声完成后使用激光笔观察溶液，能看到明显的丁达尔效应。
[0108]
细胞毒性实验：
[0109]
hela细胞在96孔板中培养，接种密度为0.5
×
104个细胞，孵育24h。用dmem培养基将鬼臼毒素，ppt-ss-ad/β-环糊精和ppt-ss-ad/羟丙基-β-环糊精的稀释到浓度均为81μmol/l,每孔加入100μl，每个浓度设3个复孔，并设对照组,对照组加入不含药的培养基，在37℃的co2，孵化器中孵育24h后，每孔加入20μl mtt(5mg/ml)，在37℃下再孵育4h，去除培养基，加入150μl dmso，然后在570nm处测定吸光度计算细胞活力。
[0110]
从图1中可以看出，在相同浓度下，ppt-ss-ad/β-环糊精包合物和ppt-ss-ad/羟丙基-β-环糊精包合物比游离鬼臼毒素的细胞抑制率更好。
[0111]
体外释放实验
[0112]
由于癌细胞中具有比正常细胞更高的gsh含量,从而使二硫键发生断裂以释放药物。因此ppt-ss-ad/环糊精包合物很容易被分解释放出鬼臼毒素-ss-金刚烷胺，在gsh的作用下断裂二硫键释放出鬼臼毒素，从而刺激药物在癌细胞中的释放。dtt是一种强还原剂，其效果与谷胱甘肽相似。研究了高dtt(10mm)和不含dtt的1％吐温80pbs溶液在37℃振荡(150rpm)条件下鬼臼毒素在ppt-ss-ad/环糊精包合物中的释放。在50ml释放介质(dtt含量为10mm和不含dtt的1％吐温80ph为7.4pbs溶液)中加入2ml ppt-ss-ad/环糊精包合物溶液和ppt溶液，释放时间分别为15min、30min、1、2、4、6、8、10、12、24h，在以上时间段取200ul样品进行测定，同时补充200ul新鲜pbs缓冲液，测定释放率。
[0113]
从图2中可以看出，在相同浓度下，ppt-ss-ad/β-环糊精包合物和ppt-ss-ad/羟丙基-β-环糊精包合物在含有dtt的条件下比没有dtt的条件下具有更高的释放率，一般可达到60％以上，并且在8小时内有一定的突释效果。

技术特征：
1.一种同时键合金刚烷胺和鬼臼毒素的偶联物，其特征在于，所述的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物是将金刚烷胺和鬼臼毒素通过含有敏感键的连接子进行偶联，该敏感键为单硫键或二硫键。由下列化学结构式表达：由下列化学结构式表达：其中n为从1～12的正整数。例如：r＝-ch
2-s-ch
2-；-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-；-ch
2-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-ch
2-；-ch
2-ch
2-s-s-ch
2-ch
2-；-ch
2-s-s-ch
2-；-ch
2-ch
2-ch
2-s-s-ch
2-ch
2-ch
2-。2.一种同时键合金刚烷胺和鬼臼毒素的偶联物，其特征在于，所述制备方法步骤如下：(1)将金刚烷胺与连接子r(r＝3,3
’‑
二硫代二丙酸、2,2
’‑
硫代二乙酸、3,3
’‑
硫代二丙酸、4,4
’‑
硫代二丁酸、2,2
’‑
二硫代二乙酸、4,4
’‑
二硫代二丁酸等)加入溶剂中，在催化加热条件下搅拌反应，反应结束后，将溶剂旋蒸去除，利用柱层析法可得金刚烷胺衍生物。所述金刚烷胺衍生物的结构式为：(2)将步骤(1)所制备的金刚烷胺衍生物和鬼臼毒素加入到溶剂中，在催化加热条件下搅拌反应，反应结束后，将溶剂旋蒸去除，利用柱层析法可得金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物。所述金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物的结构式为：。3.如权利要求2所述的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物的制备方法，其特征在于，
(1)步骤(1)所述金刚烷胺和连接子r的摩尔比为1:1～1:10，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或者n,n-二甲基甲酰胺等有机溶剂，催化剂为4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、双环已基碳酰亚胺、1-羟基苯并三唑、对甲基苯磺酸或者n-乙基二异丙胺等；加热反应的温度为15～65℃；加热反应的时间为6h～24h。(2)步骤(2)所述金刚烷胺衍生物和鬼臼毒素的摩尔比为1:1～1:10，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或者n,n-二甲基甲酰胺等有机溶剂，催化剂为4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、双环已基碳酰亚胺、1-羟基苯并三唑、对甲基苯磺酸或者n-乙基二异丙胺等；加热反应的温度为15～65℃；加热反应的时间为6h～24h。4.一种金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物的制备方法。所述制备方法为：将金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物溶解在溶剂中，再缓慢的加入到环糊精的水溶液中。加热条件下搅拌。搅拌结束后，过滤除去不溶物，将溶液移至冷冻干燥机进行冻干，得到金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物。5.如权利要求4所述的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物的制备方法，其特征在于，金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物和环糊精的摩尔比为1:1～1:30；所用环糊精为阿尔法环糊精、倍他环糊精、伽马环糊精、羟丙基倍他环糊精、甲基倍他环糊精、羟丙基伽马环糊精、羟丙基阿尔法环糊精、磺丁基倍他环糊精等；所用溶剂为乙腈、甲醇、四氢呋喃和无水乙醇等溶剂；加热反应的温度为15～65℃；搅拌时间为6h～48h；冻干时间为12h～72h。6.一种金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物纳米粒子的制备方法，所述制备方法为：将金刚烷胺-鬼臼毒素/环糊精包合物溶解在水溶液中，放置在超声设备中进行超声分散，使其自组装形成纳米粒子。7.如权利要求6所述的金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物纳米粒子的制备方法，其特征在于，金刚烷胺-鬼臼毒素偶联物/环糊精包合物中的环糊精为阿尔法环糊精、倍他环糊精、伽马环糊精、羟丙基倍他环糊精、甲基倍他环糊精、羟丙基伽马环糊精、羟丙基阿尔法环糊精、磺丁基倍他环糊精等；水溶液为去离子水、生理盐水、pbs缓冲液等水溶液；超声功率为10％～60％；超声时间为5min～40min。

技术总结
本发明制备一种金刚烷胺鬼臼毒素的偶联物，该偶联物将金刚烷胺和鬼臼毒素通过连接子(此处的连接子指3,3


技术研发人员：邱能 陈磊
受保护的技术使用者：成都理工大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/19