一种可抑制黑色素的siRNA分子及其应用的制作方法

一种可抑制黑色素的sirna分子及其应用
技术领域
1.本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种可抑制黑色素的sirna分子及其应用。


背景技术：

2.随着人们生活理念的更新和进步以及生活水平的不断提高，人们对于化妆品的消费追求也在不断的提升。
3.随着科学的进步，证实人类皮肤的颜色的深浅主要取决于黑色素细胞所产生的黑色素的数量和分布。同时，黑色素的形成过程是由多种信号分子共同参与形成的复杂调控过程，而这个过程离不开酪氨酸酶的参与。小眼球相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,mitf)基因作为一种调控酪氨酸酶表达的关键因子，其活性可以直接影响黑色素的形成。目前，市场上有着众多的美白产品，多是酪氨酸酶的抑制剂，如曲酸、苯二酚等；但是它们往往具有刺激性和细胞毒性，从而损害角质层甚至危害人体健康。
4.近些年来出现的小干扰rna(sirna)技术，能够与相应的特异mrna结合，并沉默该mrna，从而降低基因的表达。但是现有技术中采用小干扰rna技术对黑色素相关基因进行基因沉默时，对细胞的增殖能力也会产生较大程度的抑制。
5.如何提供一种能够有效降低酪氨酸酶表达水平，降低黑色素形成的小干扰rna分子，同时能够兼顾较好的细胞增殖能力，以实现美白效果，成为本领域亟待解决的技术难题。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种sirna分子，包括：如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链；
7.其中至少一条单链上含有硫代磷酸化学修饰或2'甲氧基修饰。
8.本发明发现，采用硫代磷酸化学修饰或2'甲氧基修饰手段对上述sirna分子进行修饰，能够抵抗核酸酶的降解，增加sirna分子的疏水性及对某些蛋白质的亲和力，从而显著延长半衰期，有效降低酪氨酸酶表达水平，降低黑色素形成，同时能够较好的兼顾细胞的增殖能力。
9.优选地，所述正义链中，第1～3位碱基之间以及第17～20位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基；
10.所述反义链中，第18～20位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
11.优选地，所述正义链中，第1～2位的碱基以及第17～19位的碱基为2'甲氧基修饰的碱基；
12.所述反义链中，第18～19位的碱基为2'甲氧基修饰的碱基。
13.本发明进一步发现，在上述位点进行硫代磷酸酯修饰或2'甲氧基修饰，能够使得sirna分子的稳定性大幅提升，从而显著提升对黑色素合成的抑制效果，同时上述修饰方式
能够进一步降低sirna分子对细胞增殖能力的影响。
14.进一步，本发明提供了一种组合物，其中含有上述任一实施方式中的sirna分子。
15.优选地，本发明提供了一种药物组合物，其含有上述任一实施方式中的sirna分子以及药学上可接受的辅料。
16.进一步，本发明还提供了上述任一实施方式中的sirna分子、组合物或药物组合物在抑制小眼球相关转录因子基因表达中的应用。
17.进一步，本发明还提供了上述任一实施方式中的sirna分子、组合物或药物组合物在降低酪氨酸酶表达水平中的应用。
18.进一步，本发明还提供了上述任一实施方式中的sirna分子、组合物或药物组合物在抑制黑色素合成中的应用。
19.进一步，本发明还提供了上述任一实施方式中的sirna分子、组合物或药物组合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
20.进一步，本发明还提供了上述任一实施方式中的sirna分子或组合物在化妆品领域中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
22.本发明的sirna分子能够有效靶向降低mitf基因的表达，从而抑制黑色素的合成，同时能够降低sirna分子对细胞增殖能力的影响，具有应用于美白产品的重大推广价值。
附图说明
23.图1是本发明提供的h-mitf基因表达水平检测结果图。
24.图2是本发明提供的黑色素检测结果图。
具体实施方式
25.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
27.下述所提到的a375细胞系购自中科院典藏细胞库，使用含10％fbs(bi)的dmem培养基(sigma)(含1.5mm l-glutamine，100u/ml penicillin,100μg/ml streptomycin)进行常规培养。下述转染试剂为gp-transfect-mate(genepharma)。下述多功能酶标仪为tecan m1000。
28.无修饰的sirna分子是以小眼球相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,mitf)基因相对保守的区域为模板，选取23bp的核苷酸序列设计的，由上海吉玛制药技术有限公司合成，包括：如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链，命名为simitf-4；
29.seq id no.1：5
′‑
gcaguaccuuucuaccacutt-3
′
30.seq id no.2：5
′‑
agugguagaaagguacugctt-3
′
。
31.对合成的小干扰rna序列进行硫代磷酸化学修饰，即在*号标记前后2个碱基之间进行硫代磷酸化学修饰，正义链为：
[0032]5′‑
g*c*aguaccuuucuacca*c*u*tt-3
′
；反义链为：5
′‑
agugguagaaagguacug*c*tt-3
′
，获得硫代磷酸化学修饰的sirna分子，命名为simitf-1。
[0033]
对合成的小干扰rna序列进行2'甲氧基修饰，即在m号标记前面的碱基进行二甲氧修饰，正义链为：5
′‑
gmcmaguaccuuucuaccamcmumtt-3
′
；反义链为：5
′‑
agugguagaaagguacugmcmtt-3
′
，命名为simitf-2。
[0034]
对合成的小干扰rna序列进行lna修饰，即对+号标记后面的碱基进行lna修饰，正义链为：
[0035]5′‑
g+c+aguaccuuucuacc+a+c+utt-3
′
；反义链为：5
′‑
agugguagaaagguacu+g+ctt-3
′
，命名为simitf-3。
[0036]
上述修饰均由上海吉玛制药技术有限公司完成。
[0037]
下述实施例设置了sirna oligo阴性对照，其序列为与mitf基因无对应靶位的无关序列，其正义链如seq id no.3所示，反义链如seq id no.4所示，命名为nc；
[0038]
seq id no.3：5
′–
uucuccgaacgugucacgutt
–3′
[0039]
seq id no.4：5
′–
acgugacacguucggagaatt
–3′
。
[0040]
下述实施例还设置了空白对照，即用等量的无菌去离子水作为空白对照，命名为b。
[0041]
实施例1细胞培养及转染
[0042]
1、a375细胞于37℃ 5％ co2饱和湿度培养箱中培养。细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用2ml pbs洗涤细胞两次。
[0043]
2、加入1ml trypsin-edta solution，混匀后，37℃放置1min。
[0044]
3、小心吸去胰酶溶液，在加入2ml含10％ fbs的dmem培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
[0045]
4、血球计数板计数，按1
×
105细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后37℃ 5％ co2培养24小时。
[0046]
5、1od sirna干粉用120uldepc水溶解，终浓度约为20μm，不同组别分别采用simitf-1～simitf-4，sirna oligo，每组重复3个。
[0047]
6、在1.5ml ep管中加入250μl无血清的dmem培养基，再加入16μl sirna，取另一1.5mlep管，加入250μl无血清的dmem培养基，加入5μl gp-transfect-mate，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20min。
[0048]
7、吸去6孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入6孔板中，混匀后，在培养箱中温育6h。
[0049]
8、吸弃转染液，加入2ml含10％ fbs的dmem培养液，于37℃、5％co2继续培养至24h、48h，分别收样，用于rt-pcr检测。
[0050]
实施例2h-mitf基因表达水平检测
[0051]
提取不同培养时间点细胞的总rna，对h-mitf基因表达水平进行检测。
[0052]
h-actb引物如seq id no.5和seq id no.6所示；
[0053]
h-mitf引物如seq id no.7和seq id no.8所示。
[0054]
其中，逆转录反应体系如表1所示：
[0055]
表1
[0056]
组分终浓度.用量2
×
逆转录缓冲液2
×
10μl逆转录引物(1um)50nm1.2μl总rna—2μlmmlv逆转录酶(200u/μl)2u/μl0.2μldepc水 to 20μl
[0057]
逆转录程序为：42℃30min；85℃10min。
[0058]
实时荧光定量反应体系如表2所示。
[0059]
表2
[0060]
组分终浓度.用量2
×
定量pcr master mix1
×
10μl上游引物(20um)0.08μm0.08μl下游引物(20um)0.08μm0.08μlcdna模板—2μltaq dna聚合酶(2.5u/μl)0.05u/μl0.4μldd h2o 加至20μl
[0061]
pcr反应程序为：
[0062]
95℃，3分钟，变性；
[0063]
95℃，12秒；62℃，40秒，40循环。
[0064]
结果如图1所示，实验以b为校准h-actb内参。
[0065]
实施例3细胞毒性检测
[0066]
1、当a375细胞在10cm平皿中生长至85％左右时，倾去培养液，用1ml pbs洗涤细胞两次。
[0067]
2、向平皿中加入1ml胰酶溶液(含有0.25％的胰酶和0.53mm的edta),轻轻摇匀，37℃放置2分钟，吸去胰酶溶液。
[0068]
3、加入2ml完全培养基(dmem培养基+10％ fbs)，吹打平皿底层的细胞使之成为单细胞悬液。
[0069]
4、利用血球计数板对单细胞悬液进行计数，根据计数结果将细胞稀释至5
×
105细胞/ml。
[0070]
5、取一个新的96孔板，每孔加入5
×
103个细胞，然后放置于37℃、5％co2培养箱这培养过夜。
[0071]
6、细胞贴壁后，吸去培养液，按cck-8和完全培养基1:20的比例配置cck-8溶液，向96孔板每孔加入100μl，每组三重复，同时设置调零组，即直接在空孔中加入100μ1的cck-8溶液，避光培养2小时，酶标仪450nm波长测0小时的od值。
[0072]
7、吸去96孔板中的cck-8溶液，pbs洗一遍，每孔加入100μl提前配好的sirna转染混合液，在37℃、5％co2培养箱孵育4小时后，换用完全培养基继续分别培养24、48、72小时。
[0073]
8、cck-8和完全培养基1:20的比例配置cck-8溶液，向96孔板每孔加入100μl，避光培养2小时，酶标仪450nm波长分别测转染后24、48、72小时的od值。
[0074]
结果如表3所示。
[0075]
表3
[0076]
项目bncsimitf-1simitf-20h0.7440.7250.7323330.73566724h1.6571661.3053151.2108340.97709848h2.1444872.1216411.9586361.57557272h2.3169662.211251.9752031.793251
[0077]
可见，simitf-1处理组细胞增殖情况优于simitf-2处理组。
[0078]
实施例4黑色素检测结果
[0079]
1、a375细胞在10cm平皿中培养至85％左右时，小心吸去培养液，用2ml pbs润洗细胞两遍。
[0080]
2、加入1ml胰酶溶液(含有0.25％的胰酶和0.53mm的edta),轻轻混匀，然后37℃静置1分钟。
[0081]
3、小心洗出胰酶溶液，再加入2ml完全培养基(dmem培养基+10％fbs)，轻轻吹打细胞使之成为单细胞悬液。
[0082]
4、用血球计数板对细胞悬液进行计数，向6孔板的每个孔中加入1
×
105细胞浓度，轻轻摇匀后37℃ 5％ co2培养24小时。
[0083]
5、每1od的sirna用120ul depc水溶解，形成终浓度约为20μm的溶液。
[0084]
6、取一个干净无菌的1.5ml ep管，向其中加入250μl的dmem培养基(不含血清)，再加入16μl的sirna溶液，轻轻混匀；取另一干净无菌的1.5mlep管，向其中加入250μl的dmem培养基(不含血清)，再加入5μl的转染试剂，轻轻摇匀；两个ep管均在室温放置5min，然后将两管溶液混合，再室温放置20min。
[0085]
7、小心吸去6孔板中的细胞培养基，将混合好的转染物逐滴加到6孔板中，轻轻摇匀，放置37℃5％ co2培养箱中孵育4h。
[0086]
8、轻轻吸去转染液，每孔加入2ml的完全培养基，放置37℃、5％co2的培养箱中继续培养48小时，收集细胞用于黑色素检测。
[0087]
9、将1ml的细胞悬浮液(106个细胞)与1ml的裂解液(含有10％二甲基亚砜和1n naoh)等体积进行混匀，在80℃水浴锅中轻轻摇匀60min。
[0088]
10、将上述产物于2000rpm下离心10分钟后，使用多功能酶标仪在475nm处测定黑色素含量。实验重复3次。
[0089]
结果如图2所示。实验证明，本发明采用硫代磷酸化学修饰或2'甲氧基修饰的sirna具有明显的降低黑色素表达的效果。
[0090]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种sirna分子，其特征在于，包括：如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链；其中至少一条单链上含有硫代磷酸化学修饰或2'甲氧基修饰。2.根据权利要求1所述的sirna分子，其特征在于，所述正义链中，第1～3位碱基之间以及第17～20位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基；所述反义链中，第18～20位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。3.根据权利要求1所述的sirna分子，其特征在于，所述正义链中，第1～2位的碱基以及第17～19位的碱基为2'甲氧基修饰的碱基；所述反义链中，第18～19位的碱基为2'甲氧基修饰的碱基。4.一种组合物，其特征在于，其含有权利要求1～3中任一项所述的sirna分子。5.一种药物组合物，其特征在于，其含有权利要求1～3中任一项所述的sirna分子以及药学上可接受的辅料。6.权利要求1～3中任一项所述的sirna分子、或权利要求4所述的组合物、或权利要求5所述的药物组合物在抑制小眼球相关转录因子基因表达中的应用。7.权利要求1～3中任一项所述的sirna分子、或权利要求4所述的组合物、或权利要求5所述的药物组合物在降低酪氨酸酶表达水平中的应用。8.权利要求1～3中任一项所述的sirna分子、或权利要求4所述的组合物、或权利要求5所述的药物组合物在抑制黑色素合成中的应用。9.权利要求1～3中任一项所述的sirna分子、或权利要求4所述的组合物、或权利要求5所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。10.权利要求1～3中任一项所述的sirna分子、或权利要求4所述的组合物在化妆品领域中的应用。

技术总结
本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种可抑制黑色素的siRNA分子及其应用。siRNA分子包括：如SEQ ID NO.1所示的正义链和如SEQ ID NO.2所示的反义链；其中至少一条单链上含有硫代磷酸化学修饰或2'甲氧基修饰。本发明的siRNA分子能够有效靶向降低MITF基因的表达，从而抑制黑色素的合成，同时能够兼顾较好的细胞增殖能力，具有应用于美白产品的重大推广价值。值。


技术研发人员：王昉 陈昊伟
受保护的技术使用者：丁妈给力（北京）生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/19