1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗特发性肺纤维化药物中的应用

1,2,4三唑并4,3-b哒嗪衍生物在制备抗特发性肺纤维化药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及1,2,4三唑并4,3-b哒嗪衍生物在制备抗特发性肺纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,ipf)是一种罕见、发病机理未明、慢性、进行性且不可逆的严重肺部纤维化疾病。不同于普通感染所致的肺纤维化，ipf严重影响人体呼吸功能，致使患者出现干咳、进行性呼吸困难等症状，且随着病情加重，患者呼吸功能不断恶化，甚至死亡。ipf的发病率与年龄呈正相关，此外吸烟、空气污染、过敏、病毒感染等因素都能促使ipf发生。随着全球人口老龄化的加剧，ipf的发病率和死亡率也呈现逐年递增的趋势。
3.目前，ipf患者的中位生存期仅有3.8年，主要的治疗方法包括药物治疗、氧疗和肺移植。其中，尼达尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone)是目前主要的ipf治疗性药物，相比于对照人群，服用尼达尼布和吡非尼酮的患者中位生存期能延长52周以上。然而，长期服用这两种药物伴随着强烈的副作用，约15％的患者因强烈的药物反应而不得不终止治疗。此外，nintedanib和pirfenidone药品价格较高，患者负担较大。综上，目前ipf治疗药物还存在效果不显著、毒副作用较大以及治疗费用昂贵等问题。因此，开发新型高效、廉价的ipf治疗性药物对于挽救患者生命具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供小分子化合物c1632在治疗ipf方面的应用。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.本发明的第一方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；
[0007][0008]
本发明的第二方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备改善肺密度的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；
[0009][0010]
本发明的第三方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制成纤维细胞增生的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；
[0011][0012]
本发明的第四方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制肺部羟脯氨酸的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；
[0013][0014]
本发明的第五方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制免疫细胞浸润的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；
[0015][0016]
在本发明的一些实施方式中，所述免疫细胞包括cd45、cd68、cd3。
[0017]
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
[0018]
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、ph调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。
[0019]
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。
[0020]
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。
[0021]
本发明的有益效果是：
[0022]
本发明提供了式(i)所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物(c1632)、其药学上可接受的盐在制备特发性肺纤维化药物中的应用。
[0023]
本发明发现c1632可以能显著抑制特发性肺纤维化进展，降低特发性肺纤维化中成纤维细胞增生和胶原合成，抑制免疫细胞炎性浸润的活性，保护肺泡结构从而阻断特发性肺纤维化中肺密度上升，改善肺密度、通气量；而且c1632为已知的小分子药物，能溶于水、乙醇或者dmso，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，可以作为治疗特发性肺纤维化的候选药物。
附图说明
[0024]
图1为c1632显著抑制小鼠肺纤维化进展。图1a为ipf小鼠模型构建及c1632药物处理实验流程图；图1b为正常小鼠、纤维化小鼠和c1632治疗后的纤维化小鼠肺组织拍照；图1c为将各处理组小鼠肺置于水中，只有ipf小鼠肺密度大于水而下层，而对照组和c1632治疗组的肺密度均小于水；图1d为各个处理组小鼠的肺密度统计；图1e为he和masson染色检测小鼠肺组织结构和纤维化程度；图1f为he染色中各组小鼠纤维化区域；图1g为masson染色中各组小鼠纤维化区域；图1i为检测各个处理组小鼠肺部羟脯氨酸含量。其中，*表示p《0.05，**表示p《0.01。
[0025]
图2为1632抑制特发性肺纤维化中的免疫浸润。图2a为ihc检测c1632治疗组和对照ipf组小鼠肺组织中cd45、cd68和cd3表达水平；图2b为cd45的表达水平；图2c为cd68的表达水平；图2d为cd3的表达水平。
[0026]
图3为1632具有较好的药物安全性。图3a为体重统计；图3b-图3s为血常规分析：图3b为淋巴细胞密度；图3c为淋巴细胞比例；图3d为单核细胞密度；图3e为单核细胞比例；图3f为嗜中性粒细胞密度；图3g为嗜中性粒细胞比例；图3h为白细胞数；图3i为红细胞数；图3j为血红蛋白含量；图3k为红细胞压积；图3l为平均红细胞体积；图3m为平均红细胞血红蛋白含量；图3n为红细胞平均血红蛋白浓度；图3o为红细胞分布宽度；图3p为血细胞密度；图3q为平均血小板体积；图3r为血小板分布宽度；图3s为血小板压积。
具体实施方式
[0027]
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
[0028]
实验材料与方法：
[0029]
1、c57bl/6小鼠购自集广东药康生物科技有限公司。硫酸博来霉素购自阿拉丁。
[0030]
2、ipf小鼠模型构建：小鼠麻醉后在用导气管在肺部注射2mg/kg的博来霉素，构建肺纤维化小鼠模型。
[0031]
3、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物c1632由本实验室合成，其结构式如式(i)所
示：
[0032][0033]
合成路径如下所示：
[0034][0035]
c1632为已知的小分子药物，能溶于水或者dmso，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。
[0036]
小鼠肺密度测定：肺密度测定采用排水法，具体如下：
①
小鼠麻醉后处死，取肺并称重记录为mlung；
②
接着称取1.5ml离心管空管重量，灌满生理盐水后再次记录离心管重量，根据生理盐水的重量和密度计算管准确体积vtube；
③
将肺组织完全没入离心管的生理盐水中，排除空气后盖上盖子，擦去管四周水渍称重记录为m；
④
计算管内生理盐水重量msaline＝mtube-mlung；
⑤
计算管内生理盐水体积vsaline＝msaline
×
ρsaline，其中ρsaline是生理盐水的密度；
⑥
计算肺体积vlung＝vtube-vsaline；
⑦
计算肺密度ρl ung＝mlung/vlung。
[0037]
4、免疫组化测定肺组织免疫细胞浸润：取肺组织浸泡于4％多聚甲醛中固定，接着进行梯度脱水，程序如下：70％乙醇5h；80％乙醇1h；90％乙醇1h；95％乙醇1h；无水乙醇1h；无水乙醇0.5h；无水乙醇+to(1:1)1h；to 1h；to 1h；石蜡(62℃)1h；石蜡(62℃)1h；石蜡(62℃)1h。脱水后包膜至蜡块中进行切片，切片厚度4μm。石蜡切片65摄氏度烘烤1h后，经过二甲苯5min；二甲苯5min；无水乙醇5min；95％乙醇5min；90％乙醇5min；85％乙醇5min；75％乙醇5min；柠檬酸修复液中微沸10min；接着自然冷却至室温；3％双氧水10min；山羊抗血清室温封闭1h；孵浴cd45(abcam)、cd3(abcam)或cd68(abcam)一抗过夜；接着用pbs洗3次每次5min；加入免疫组化二抗(福建迈新)室温20min；接着用dab显色试剂盒(福建迈新)进行显色2min；用水冲洗dab接着苏木素染色2min；流水冲洗8min返蓝；待片子干燥后加中性树胶封片拍照。
[0038]
5、masson染色检测肺组织纤维化程度：masson三色染色试剂盒(福建迈新)。
[0039]
实施例1
[0040]
为了研究c1632是否能用于ipf的治疗，申请人根据图1a中的方法对ipf小鼠进行c1632给药处理，具体将小鼠分为
①
正常小鼠+生理盐水组；
②
正常小鼠+c1632组；
③
ipf小
鼠+生理盐水组；ipf+c1632组每组小鼠至少4只。实验结束后取小鼠肺组织进行拍照，结果发现对照组肺无明显异常，呈粉红色，表面光滑。模型组肺呈暗红色，部分肺叶呈灰白色，质地变硬，可见散在大小不等的点片状灰白色斑块，c1632处理的模型组肺形态、色泽和硬度更接近对照组(图1b)。将上述肺叶置于水中，结果表明ipf造模小鼠密度大于水，而正常小鼠和采用c1632进行治疗的ipf小鼠肺密度小于水(图1c)。
[0041]
进一步检测了各组小鼠的肺密度，结果表明ipf小鼠肺密度较大，而c1632处理能明显降低ipf小鼠的肺密度(图1d)。这说明c1632能显著改善ipf小鼠肺部的空气含量从而降低肺密度，提高肺部空气交换的能力。h&e和masson染色也表明c1632治疗组小鼠肺部含有更多的肺泡结构和更少的纤维化区域(图1e-图1g)。
[0042]
羟脯氨酸是胶原特有的氨基酸，其含量是检测肺纤维化的重要指标，对各处理组小鼠肺中羟脯氨酸定量结果表明c1632能够显著抑制小鼠肺羟脯氨酸的增多(图1i)。
[0043]
以上结果说明了c1632显著抑制小鼠特发性肺纤维化的进展。
[0044]
实施例2c1632抑制特发性肺纤维化中的免疫浸润
[0045]
在实施例1中说明了c1632抑制肺纤维化进展，申请人猜测其也能抑制肺纤维化过程中免疫细胞的招募。为此通过ihc检测了c1632治疗组的cd45(总免疫细胞)、cd68(巨噬细胞)和cd3(t细胞)的浸润情况。结果表明注射c1632显著降低了ipf小鼠肺中包括巨噬细胞和t细胞在内的免疫细胞浸润(图2)。
[0046]
实施例3c1632具有较好的药物安全性
[0047]
为了检测c1632的药物安全性，申请人对ipf的模型c57bl/6小鼠及对照小鼠分别给予每周3次腹腔注射68mg/kg体重的c1632，并且称量其体重，实验结束时取全血进行血常规检测。结果表明相比于对应的生理盐水组c1632并未显著改变小鼠的体重(图3a)。此外，各组小鼠的血常规各项指标多处于参考区间内，值得注意的是正常小鼠给予c1632能极显著的增加血小板平均容积(mpv)但对模型组给予c1632对mpv并无显著影响。而c1632能极显著抑制正常小鼠pdw(血小板平均容积)，对纤维化小鼠的该指标并无显著影响。总体而言c1632并不会导致ipf小鼠的血常规指标变差(图3b-3s)。
[0048]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；2.[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备改善肺密度的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；3.[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制成纤维细胞增生的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；4.[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制肺部羟脯氨酸的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；5.[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抑制免疫细胞浸润的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐；6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括cd45、cd68、cd3。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、ph调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。9.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。10.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。

技术总结
本发明公开了1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗特发性肺纤维化药物中的应用。本发明发现1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物可以能显著抑制特发性肺纤维化进展，降低特发性肺纤维化中成纤维细胞增生和胶原合成，抑制免疫细胞炎性浸润的活性，保护肺泡结构从而阻断特发性肺纤维化中肺密度上升，改善肺密度、通气量；而且C1632为已知的小分子药物，能溶于水、乙醇或者DMSO，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，可以作为治疗特发性肺纤维化的候选药物。可以作为治疗特发性肺纤维化的候选药物。


技术研发人员：谢晨 陈艳莲 黄辉 谢宇捷
受保护的技术使用者：中山大学附属第八医院（深圳福田）
技术研发日：2023.02.09
技术公布日：2023/7/19