一种用于狗细小病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用的制作方法

一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用。


背景技术：

2.犬细小病毒(cpv)是对犬科动物危害最大的传染病之一，犬细小有肠炎型和心肌炎型两种病型，有时某些肠炎病例也伴有心肌炎型变化。肠炎型主要表现为：精神沉郁、厌食，体温升高、呕吐，腹泻、严重的呕吐物及粪便中会带有血色。心肌炎型常无先兆性表现，或仅表现轻度腹泻、继而突然衰弱、呼吸困难、心脏听诊出现杂音、短时间内死亡。细小病毒作为狗的常见烈性、具有高度传染性疾病，它于1978年首次发生在狗身上，后来经过研究发现，该病毒可能是由于猫泛白细胞减少症病毒变异而来。该病毒直接影响狗的消化系统，不仅会在很大程度上危害狗的健康，而且还有很高的致死率。细小病毒通常感染40天左右的幼犬，此时母源抗体消失，狗狗的抵抗力下降，在更换饮食及环境或者接触外界病原时会感染。该病毒通过狗直接接触和接触患病狗粪便进行传播，除此之外，环境或人群可能也会传播病毒，因为细小病毒具有耐寒、耐热、耐湿和干燥的特点，所以它可以在环境中长时间存活，即使是来自受感染狗的少量粪便也可能携带病毒并感染健康的狗。
3.犬细小病毒不仅仅局限于狗会传染，野生动物也会患病，比如狐狸、浣熊以及臭鼬等，而且此病毒可感染任何年龄阶段、任何品种以及性别的狗，但是最常见于感染幼犬以及自身抵抗力较低的狗。
4.对于细小病毒感染可以通过临床症状以及全身检查进行初步诊断，但是还需要其他措施对疾病进行确诊，以便给患病狗制定出良好的治疗计划，常见的诊断措施主要包括以下几种：cpv试纸板检测、elisa(酶联免疫吸附试验)测试、pcr(聚合酶链式反应)测试、全血细胞计数检测和血液生化检测。其中，cpv试纸板检测是兽医临床应用最广泛的一种诊断手段，可直接对患病狗狗粪便进行采样，然后进行检测，如果狗狗被病毒感染，试纸板会显示阳性，如未被感染，则显示阴性。此种检测方法的优点是诊断快速、方便；但是准确率可能会因为很多因素而出现细微的差距，比如试纸板质量、病毒毒株类型以及数量等。elisa检测准确率较高，可在15分钟内完成，但是偶尔也会因为很多因素产生假阳性或假阴性的结果。pcr测试比elisa和试纸板诊断的准确率都要高，但是需要将患病狗的粪便样品专门送到动物疾病检测实验室进行专门检测，此种方法虽然准确率高于elisa和试纸板检测，但耗费时间较长。全血细胞计数检测是细小病毒感染诊断的关键，因为细小病毒感染最先侵害的部位就是骨髓，当骨髓被病毒侵害后，白细胞数量就会逐渐降低，如果狗同时具有elisa阳性和低白细胞计数，则可以对细小病毒感染进行确诊。血液生化检测是诊断出病毒是否对肝脏、肾脏等器官造成损害，还可通过检测看狗脱水的程度和酸碱度是否平衡，对制定治疗计划有很好的辅助作用。
5.等温扩增技术是一种新的扩增技术，用于代替pcr扩增技术，操作方便，节约时间成本，可以对样本进行现场快速诊断，结果判定简单，无需电泳，可直接用肉眼观察扩增产
物中燃料颜色变化来判定结果。但是，目前还没有关于狗细小病毒lamp检测的报道。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用，本发明的引物组具有检测灵敏度高和特异性强的优势。
7.本发明提供了一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物cpv-1-f3、cpv-1-b3，内引物cpv-1-fip、cpv-1-bip和环引物cpv-1-lf、cpv-1-lb；所述cpv-1-f3的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述cpv-1-b3的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述cpv-1-fip的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述cpv-1-bip的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述cpv-1-lf的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述cpv-1-lb的核苷酸序列如seq id no：6所示。
8.本发明还提供了一种用于狗细小病毒lamp检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
9.优选的，所述试剂盒还包括反应预混液，所述反应预混液包括bst2.0warmstartdna聚合酶、缓冲液和酸碱指示剂。
10.优选的，所述反应预混液以10μl计，包括：0.67μlbst2.0warmstartdna聚合酶、8.33μl缓冲液和1μl酸碱指示剂。
11.优选的，所述酸碱指示剂包括酚红。
12.优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
13.优选的，所述阳性对照品为包括狗细小无感染性基因片段；所述阴性对照品为双蒸水。
14.本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的狗细小病毒lamp检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
15.1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；
16.2)以所述裂解后的样品液为模版，采用所述引物组进行lamp扩增反应，得到扩增产物；
17.3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品是否含有犬细小病毒；当显色为黄色或橙色时，则待测样品中含有犬细小病毒，当显色为紫红色或粉红色时，则待测样品中不含犬细小病毒。
18.优选的，步骤2)中所述lamp扩增反应的反应体系以20μl计，包括：反应预混液10μl、引物组8μl和裂解后的样品液2μl；
19.所述引物组由以下终浓度的成分组成：10μm的cpv-1-f30.5μl、10μm的cpv-1-b30.5μl、20μm的cpv-1-fip2μl、20μm的cpv-1-bip2μl、20μm的cpv-1-lf1μl、20μm的cpv-1-lb1μl和ddh2o1μl。
20.优选的，所述lamp扩增反应的程序为：60～65℃、50min，15℃、2min。
21.本发明提供了一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物cpv-1-f3、cpv-1-b3，内引物cpv-1-fip、cpv-1-bip和环引物cpv-1-lf、cpv-1-lb。本发明引物组在恒温60～65℃条件下，能够实现狗细小病毒(cpv)的检测，与普通pcr相比，在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。包含本发明的引物
组的试剂盒具有操作简便、敏感性高、重复性好和特异性强的特点。
附图说明
22.图1为电泳条带结果，其中，1.特异性反应液2021090201、2.特异性反应液2021090201阴性对照、3.特异性反应液2021090202、4.特异性反应液2021090202阴性对照、5.特异性反应液2021090203、6.特异性反应液2021090203阴性对照、m：dl2000dnamarker；
23.图2为犬细小病毒检测灵敏度实验结果图；
24.图3为特异性试验结果；其中：1为犬瘟热、2为犬腺、3为犬冠状、4为犬疱疹、5为猫细小、+为阳性对照、-为阴性对照；
25.图4为重复性实验结果。
具体实施方式
26.本发明提供了一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物cpv-1-f3、cpv-1-b3，内引物cpv-1-fip、cpv-1-bip和环引物cpv-1-lf、cpv-1-lb；所述cpv-1-f3的核苷酸序列如seq id no：1所示，具体为：ggtaactttggtcaacaagt；所述cpv-1-b3的核苷酸序列如seq id no：2所示，具体为：aaaccaaagtctcctggaa；所述cpv-1-fip的核苷酸序列如seq id no：3所示，具体为：gttggttcaatttgcttacttcctttcaatttaaagcaattgttctgg；所述cpv-1-bip的核苷酸序列如seq id no：4所示，具体为：ttgtgagaattggatggaagaaagattatgttcaacattctgtctctt；所述cpv-1-lf的核苷酸序列如seq id no：5所示，具体为：cctttttgatcaattctaattgtttg；所述cpv-1-lb的核苷酸序列如seq id no：6所示，具体为：cctgaacatacacaaccaat。
27.本发明提供了一种用于狗细小病毒lamp检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
28.在本发明中，所述试剂盒优选的还包括反应预混液，所述反应预混液包括bst2.0warmstartdna聚合酶、缓冲液和酸碱指示剂。在本发明中，所述反应预混液以10μl计，优选的包括：0.67μlbst2.0warmstartdna聚合酶、8.33μl缓冲液和1μl酸碱指示剂。在本发明中，所述酸碱指示剂优选的包括酚红。
29.在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照品和阴性对照品。在本发明中，所述阳性对照品优选为包括狗细小无感染性基因片段；所述阴性对照品优选为双蒸水。
30.本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的狗细小病毒lamp检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
31.1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；
32.2)以所述裂解后的样品液为模版，采用所述引物组进行lamp扩增反应，得到扩增产物；
33.3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品是否含有犬细小病毒；当显色为黄色或橙色时，则待测样品中含有犬细小病毒，当显色为紫红色或粉红色时，则待测样品中不含犬细小病毒。
34.本发明首先将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；所述裂解时，所用溶液为样品裂解液；所述待测样品和样品裂解液的体积比为2:5；所述裂解的条件为95℃处理
5min。
35.得到裂解后的样品液后，本发明以所述裂解后的样品液为模版，采用所述引物组进行lamp扩增反应，得到扩增产物。
36.在本发明中，所述lamp扩增反应的反应体系以20μl计，优选的包括：反应预混液10μl、引物组8μl和裂解后的样品液2μl；所述引物组优选的由以下终浓度的成分组成：10μm的cpv-1-f30.5μl、10μm的cpv-1-b30.5μl、20μm的cpv-1-fip2μl、20μm的cpv-1-bip2μl、20μm的cpv-1-lf1μl、20μm的cpv-1-lb1μl和ddh2o1μl。
37.在本发明中，所述lamp扩增反应的程序为：60～65℃、50min，15℃、2min。
38.得到扩增产物后，本发明根据所述扩增产物的颜色判断待测样品是否含有犬细小病毒；当显色为黄色时，则待测样品中含有犬细小病毒，当显色为紫红色或粉红色时，则待测样品中不含犬细小病毒。
39.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
40.实施例1
41.犬细小病毒检测引物及探针设计与筛选
42.根据美国国立生物技术信息中心已公开的ncbi-blast数据库blast中已公开的参考序列，使用等分子生物学工具进行基因组序列比对分析，获得犬细小病毒序列特异性的保守区域。经过对多种犬细小病毒的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择保守的基因做为靶标基因，以此目的片段进行检测引物和探针设计。根据保守靶序列，利用工具进行等温扩增引物的设计。所设计引物进一步通过blastn和primer-blast检索验证；所设计引物序列如表1所示：
43.表1靶基因和等温扩增引物信息
[0044][0045]
(1)设计三组引物，将不同引物按照所需浓度/量配制成不同的特异性反应液，随机抽取一组通用反应液与六组特异性反应液，配制反应预混液。加入阳性的质控品进行等温扩增反应。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳的方法来判断引物的可行性及效果，若引物可行则发生反应有相应的电泳条带。电泳结束，在蓝光切胶仪下观察；
[0046]
(2)分别取不同引物组，然后依次选择加入阳性质控，放入等温扩增仪，65℃、50min进行扩增。
[0047]
(3)琼脂糖核酸电泳：
[0048]
称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶，加入100ml1
×
tae，微波炉加热至全部融化，加入10ul核酸染料。摇匀至胶槽中，冷却后得到1.5％琼脂糖凝胶。将步骤(2)反应结束的产物分别与上样缓冲液混合。使用10ul的移液器将混合物加入至胶板的小槽中。加样后立即电泳(电压120v)。电泳完毕后，在蓝光切胶仪下观察，若引物可行则发生反应有相应的电泳条带。实验结果参见图1，结果显示：引物组cpv-1能扩增出dna，其他引物不可行，最适宜引物组为cpv-1。
[0049]
实施例2：敏感性实验
[0050]
(1)以人工合成的犬细小无感染基因片段作为阳性质控品，由苏州金唯智生物科技有限公司合成；配制不同浓度的阳性质控品，将阳性质控品按1：1000(9*107拷贝/μl)、1:
10000(9*106拷贝/μl)、1:100000(9*105拷贝/μl)、1:1000000(9*104拷贝/μl)、1:10000000(9*103拷贝/μl)、1:100000000(9*102拷贝/μl)、1:1000000000(9*101拷贝/μl)和1:10000000000(9拷贝/μl)8个稀释度稀释。用同一批试剂盒对不同稀释度样品检测，检测步骤如下所示：1)分别取特异性反应液和通用反应液，然后每份添加封闭油，各组添加量如下表2所示，离心15s；
[0051]
表2.反应体系
[0052]
成分单次体系通用反应液10μl病毒特异反应液8μl封闭油50μl
[0053]
2)打开盖子，分别加入2μl的不同浓度的阳性质控品，盖紧盖子，瞬间离心，让封闭油彻底覆盖预混液；3)放入等温基因扩增仪，选择扩增程序进行扩增，60℃反应50min，10℃2min。
[0054]
(2)结果判定：扩增反应结束后，阳性成黄色，阴性成玫红色，
[0055]
(3)结果
[0056]
用3批试剂盒对不同稀释度阳性质控品进行检测。结果表明，3批试剂盒对犬瘟热病毒核酸样品的最低检出限量均为180拷贝(如图2和表3所示)。
[0057]
表3.犬细小病毒检测敏感性实验结果
[0058][0059]
实施例3：特异性实验
[0060]
按照实施例2的检测步骤分别对犬瘟热病毒阳性样品、犬腺病毒阳性样品、犬冠状病毒阳性样品、犬疱疹病毒及猫细小阳性样品进行反应。配制反应预混液，加入2ul的样本。拧紧盖子，瞬离，让封闭油彻底覆盖预混液，放入等温基因扩增仪，65℃-50min，10℃-2min进行扩增。
[0061]
结果判定：扩增反应结束后，阳性成黄色，阴性成玫红色。
[0062]
实验结果：对犬瘟热病毒阳性样品、犬腺病毒阳性样品、犬冠状病毒阳性样品、犬疱疹病毒及猫细小样品检测，检测结果均为阴性，对犬瘟热核酸阳性样本进行检测，检测结果为阳性。结果如图3所示。
[0063]
实施例4：重复性实验
[0064]
1、取一批试剂盒，分别对犬细小病毒核酸阳性样本3份、弱阳性样本3份、阴性样本3份检测，其中犬细小病毒核酸阳性样本、弱阳性样本由人工合成的犬细小病毒无感染性基因片段制备，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。每份样品需要进行3次批间检验，每一
批批内重复3次。配制反应预混液，加入2μl的样本。拧紧盖子，瞬离，让封闭油彻底覆盖预混液，放入等温基因扩增仪，65℃、50min进行扩增。
[0065]
2、结果判定：扩增反应结束后，阳性成黄色，弱阳性为橙色，阴性成玫红色。
[0066]
3、实验结果：
[0067]
试剂盒对犬细小病毒核酸阳性样本、弱阳性样本的检测均为阳性，阳性对照反应后为黄色、弱阳性为橙色，对犬细小病毒核酸阴性样本的检测为阴性，反应后为玫红色，且对阳性样品和阴性样本的批间和批内检测结果均100％一致，结果如图4所示。
[0068]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种用于狗细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物cpv-1-f3、cpv-1-b3，内引物cpv-1-fip、cpv-1-bip和环引物cpv-1-lf、cpv-1-lb；所述cpv-1-f3的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述cpv-1-b3的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述cpv-1-fip的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述cpv-1-bip的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述cpv-1-lf的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述cpv-1-lb的核苷酸序列如seq id no：6所示。2.一种用于狗细小病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应预混液，所述反应预混液包括bst2.0 warmstart dna聚合酶、缓冲液和酸碱指示剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应预混液以10μl计，包括：0.67μl bst2.0 warmstart dna聚合酶、8.33μl缓冲液和1μl酸碱指示剂。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述酸碱指示剂包括酚红。6.根据权利要求1～4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包括狗细小无感染性基因片段；所述阴性对照品为双蒸水。8.权利要求1所述的引物组或权利要求2～7任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的狗细小病毒lamp检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；2)以所述裂解后的样品液为模版，采用所述引物组进行lamp扩增反应，得到扩增产物；3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品是否含有犬细小病毒；当显色为黄色或橙色时，则待测样品中含有犬细小病毒，当显色为紫红色或粉红色时，则待测样品中不含犬细小病毒。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述lamp扩增反应的反应体系以20μl计，包括：反应预混液10μl、引物组8μl和裂解后的样品液2μl；所述引物组由以下终浓度的成分组成：10μm的cpv-1-f30.5μl、10μm的cpv-1-b30.5μl、20μm的cpv-1-fip 2μl、20μm的cpv-1-bip 2μl、20μm的cpv-1-lf 1μl、20μm的cpv-1-lb 1μl和ddh2o 1μl。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述lamp扩增反应的程序为：60～65℃、50min，15℃、2min。

技术总结
本发明属于病毒的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于狗细小病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用；所述引物组包括外引物CPV-1-F3、CPV-1-B3，内引物CPV-1-FIP、CPV-1-BIP和环引物CPV-1-LF、CPV-1-LB。本发明引物组在恒温60～65℃条件下，能够实现狗细小病毒(CPV)的检测，与普通PCR相比，在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。包含本发明的引物组的试剂盒具有操作简便、敏感性高、重复性好和特异性强的特点。特点。特点。


技术研发人员：刘佳铤 武小琰 潜奕青 余飞
受保护的技术使用者：杭州百裕生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/7/19