一种具有强糖脂代谢能力的3D生物打印人肝脏类器官的建立方法与流程

一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法。


背景技术：

2.糖尿病和肥胖等代谢性疾病正在全球范围内流行，世界卫生组织（who）预测，超重和肥胖将很快成为营养不良和传染病之后最严重的公共卫生问题。糖尿病是一系列血糖代谢紊乱性疾病，可导致严重的长期并发症，包括心血管疾病、足溃疡和眼损伤等。据估计，全世界有超过4.2亿人患有糖尿病，而且发病率仍呈上升趋势。肥胖是由于过量和不平衡的饮食摄入、不健康的生活方式和脂质代谢紊乱造成的，会增加患心血管疾病、癌症和骨关节炎的可能性。肝脏是糖类和脂质的合成、代谢、储存及再分配的主要器官，对于维持机体正常生理功能起到至关重要的作用。因此，构建肝脏为基础的体外糖脂代谢研究模型对于研究糖尿病和肥胖等代谢性疾病的发病机理以及筛选治疗药物具有重要意义。
3.现有的用于糖脂代谢研究的体外细胞模型主要是细胞球样体和微流控生物反应器。细胞球样体虽然操作简便，但结构单一、结构可调节性差；微流控生物反应器可以模拟体内细胞受到的物理刺激，但制造成本高、不易实现高通量。另外，目前上述两种技术模型的糖脂代谢能力仍远低于体内条件，影响到后续药物筛选结果的准确性。
4.目前体外用于研究肝脏代谢常用的细胞有人原代肝细胞、hepg2细胞和heparg细胞。人原代肝细胞是体外肝脏代谢研究的金标准，但其获取难度高，且体外条件下不易长期培养。hepg2细胞在体外常规培养条件下代谢能力不足；heparg细胞的代谢表达谱虽然与人原代肝细胞相近，但其获取成本高、培养条件复杂。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，通过对hepg2细胞培养条件的优化，提高了hepg2细胞的代谢能力，并结合3d生物打印技术成功构建了人肝脏类器官模型，该模型的糖脂代谢能力与现有模型相比有较大幅度提高，且部分指标已经达到了体内（in vivo）水平。
6.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，包括以下步骤：s1.称取明胶、海藻酸钠和羟乙基纤维素；s2.将明胶溶于超纯水中，加入海藻酸钠和羟乙基纤维素不断搅拌至体系均匀，灭菌，冷藏保存备用，制得生物墨水；s3.将细胞悬液与步骤s2制得的生物墨水混合均匀，制得载细胞生物墨水，装载于无菌注射器中，使用3d生物打印机进行打印，得到人肝脏类器官模型；
s4.将步骤s3打印得到的人肝脏类器官模型于含金属离子的溶液中交联，然后在培养基中培养，得到具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官。
7.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述明胶、海藻酸钠和羟乙基纤维素的质量比为18-22：3-5：3-5。
8.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述灭菌的条件为118-125℃，0.05-0.15mpa下灭菌20-30min。
9.作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述载细胞生物墨水的细胞密度为4-6
×
10
6 cells / ml；所述细胞悬液与生物墨水的体积比为1:3-5。
10.作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述打印的条件为20-30℃、3-7mm/s打印速度、50-70%挤出倍率。
11.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述含金属离子的溶液为cacl2、bacl2、fecl2、cucl2、mgcl2、zncl2中的至少一种。
12.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述含金属离子的溶液为2-4wt%的cacl2溶液。
13.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述培养基为高糖dmem培养基（英文全称为dulbecco's modification of eagle's medium，中文解释为：改良eagle培养基，是一种含有氨基酸和葡萄糖的培养基），其含8-12vol%胎牛血清、14-18vol%非必需氨基酸和5-10vol%必需氨基酸。
14.作为本发明的进一步改进，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种；所述必需氨基酸选自甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸中的至少一种。
15.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述培养条件为37℃、5%co2，其中%为体积百分比。
16.本发明具有如下有益效果：本发明在传统的明胶-海藻酸钠生物墨水中加入羟乙基纤维素（hec），增加明胶交联网络的致密性，提高模型的机械强度和长时间培养下的结构稳定性。同时，hec具有保水作用，可以使模型结构内长时间保有更多营养物质，有利于细胞的生长增殖。另外，在常规的dmem培养基中额外加入非必需氨基酸（nea）和必需氨基酸（ea），进一步提高了hepg2细胞的代谢能力。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为人肝脏类器官设计图；图2为人肝脏类器官实物图；图3为不同生物墨水的频率扫描图；图4为不同生物墨水的温度扫描图；图5为不同生物墨水打印结构的机械强度比较图；
图6为不同生物墨水打印结构的溶胀率比较图；图7为不同生物墨水打印结构的稳定性比较图；图8为不同条件下的细胞活力比较图；图9为不同生物墨水的肝脏类器官尿素分泌量比较图；图10为不同生物墨水的肝脏类器官白蛋白分泌量比较图；图11为不同条件下的葡萄糖消耗量比较图；图12为不同条件下的糖原含量比较图；图13为不同条件下的糖异生率比较图；图14为不同条件下的总胆固醇含量比较图；图15为不同条件下的甘油三酯含量比较图。
具体实施方式
19.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1本实施例提供一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，包括以下步骤：s1.称取18重量份明胶、3重量份海藻酸钠和3重量份羟乙基纤维素；s2.将明胶加入10重量份超纯水中，室温溶胀至无明显液体流动，于40℃下加热完全溶解为澄清透明溶液，在搅拌条件下加入处方量的海藻酸钠和羟乙基纤维素至体系均匀，118℃，0.05mpa下灭菌20min，在超净台中转移至50ml无菌离心管，于4℃下保存备用；s3.将细胞悬液与步骤s2制得的生物墨水按照体积比为1:3混合均匀，制得载细胞生物墨水，细胞密度为4
×
10
6 cells / ml，装载于无菌注射器中，使用3d生物打印机，20℃、3mm/s打印速度、50%挤出倍率进行打印，得到人肝脏类器官模型；s4.将步骤s3打印得到的人肝脏类器官模型加入2wt%的cacl2溶液中交联30s，然后在高糖dmem培养基中，37℃、5%co2（其中%为体积百分比）培养，前8天隔天换液，8天后每天换液，得到具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官。人肝脏类器官模型的格栅结构设计图和实物图分别如图1、2所示。
21.所述高糖dmem培养基含10vol%胎牛血清、16vol%非必需氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸，摩尔浓度比为1：1：1：1：1：1）和8vol%必需氨基酸（甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸，摩尔浓度比为2：1：8：8：8：8：4：8）。
22.实施例2本实施例提供一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，包括以下步骤：s1.称取22重量份明胶、5重量份海藻酸钠和5重量份羟乙基纤维素；s2.将明胶加入10重量份超纯水中，室温溶胀至无明显液体流动，于40℃下加热完
全溶解为澄清透明溶液，在搅拌条件下加入处方量的海藻酸钠和羟乙基纤维素至体系均匀，125℃，0.15mpa下灭菌30min，在超净台中转移至50ml无菌离心管，于4℃下保存备用，制得生物墨水；s3.将细胞悬液与步骤s2制得的生物墨水按照体积比为1:5混合均匀，制得载细胞生物墨水，细胞密度为6
×
10
6 cells / ml，装载于无菌注射器中，使用3d生物打印机，30℃、7mm/s打印速度、70%挤出倍率进行打印，得到人肝脏类器官模型；s4.将步骤s3打印得到的人肝脏类器官模型加入4wt%的cacl2溶液中交联30s，然后在高糖dmem培养基中，37℃、5%co2（其中%为体积百分比）培养，前8天隔天换液，8天后每天换液，得到具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官。
23.所述高糖dmem培养基含10vol%胎牛血清、16vol%非必需氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸，摩尔浓度比为1：1：1：1：1：1）和8vol%必需氨基酸 （甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸，摩尔浓度比为2：1：8：8：8：8：4：8）。
24.实施例3本实施例提供一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，包括以下步骤：s1.称取20重量份明胶、4重量份海藻酸钠和4重量份羟乙基纤维素；s2.将明胶加入10重量份超纯水中，室温溶胀至无明显液体流动，于40℃下加热完全溶解为澄清透明溶液，在搅拌条件下加入处方量的海藻酸钠和羟乙基纤维素至体系均匀，121℃，0.1mpa下灭菌25min，在超净台中转移至50ml无菌离心管，于4℃下保存备用，制得生物墨水；s3.将细胞悬液与步骤s2制得的生物墨水按照体积比为1:4混合均匀，制得载细胞生物墨水，细胞密度为5
×
10
6 cells / ml，装载于无菌注射器中，使用3d生物打印机，25℃、5mm/s打印速度、60%挤出倍率进行打印，得到人肝脏类器官模型；s4.将步骤s3打印得到的人肝脏类器官模型加入3wt%的cacl2溶液中交联30s，然后在高糖dmem培养基中，37℃、5%co2（其中%为体积百分比）培养，前8天隔天换液，8天后每天换液，得到具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官。
25.所述高糖dmem培养基含10vol%胎牛血清、16vol%非必需氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸，摩尔浓度比为1：1：1：1：1：1）和8vol%必需氨基酸 （甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸，摩尔浓度比为2：1：8：8：8：8：4：8）。
26.测试例：1、流变学实验对实施例3配制好的生物墨水与传统的明胶-海藻酸钠生物墨水进行频率扫描和温度扫描，对其剪切变稀特性及溶液-凝胶转变温度（t
sg
）进行研究，实验结果分别如图3、4所示。
27.实验结果表明，实施例3生物墨水具有剪切变稀特性，其黏度对于频率的变化相较于传统生物墨水更加敏感，更适合用于3d生物打印。另外，实施例3生物墨水的t
sg = 35.414℃＞传统生物墨水的t
sg = 29.472℃，说明实施例3生物墨水在打印温度（25 ℃）下更加接
近软凝胶状态，更适合挤出式3d生物打印。同时，在培养条件（37℃、5% co2）下的结构稳定性也会更高。
28.2.机械强度实验将打印好的16层格栅结构于2、4、6、8、10、12、14和16天通过压力测试仪测定其机械强度，实验结果如图5所示。
29.实验结果表明，实施例3生物墨水与传统生物墨水相比具有更大的压缩模量，即更高的机械强度。且在长达16天的培养过程中，传统生物墨水组的机械强度降低了66.50%，而实施例3生物墨水组的机械强度仅降低23.62%，说明使用实施例3生物墨水打印的结构稳定性更高，更利于体外长期培养。
30.3.溶胀实验将打印好的16层格栅结构用3%cacl2溶液交联30s后，在高糖dmem培养基中于37℃、5%co2条件下孵育24h至溶胀平衡，吸去表面水分后称重，记为wm。冻干后称重，记为wd。
31.按照如下公式计算溶胀率（s），实验结果如图6所示：s =（w
m-wd）/ wd×
100%实验结果表明，传统生物墨水组的溶胀率为1892.22%，而实施例3生物墨水组的溶胀率可达3685.06%，说明实施例3生物墨水组的结构中含有更多培养基，即更多营养成分，更有利于细胞生长增殖。
32.4.稳定性实验将打印好的16层格栅结构于第2、4、6、8、10、12、14和16天冻干后称重，按照干重计算剩余质量百分比（m），实验结果如图7所示。
33.实验结果表明，实施例3生物墨水组质量损失更加缓慢，在第16天时剩余质量百分比为51.25%，而传统生物墨水组只有34.62%，说明实施例3生物墨水组的结构更加稳定，在细胞长期培养的过程中更有利。
34.5.细胞活力实验将打印好的人肝脏类器官模型（4层）使用cck-8试剂盒在第2、4、6、8、10、12、14和16天测定细胞活力，实验结果如图8所示。
35.实验结果表明，与2d培养条件相比，3d生物打印技术可以在长期培养的过程中保持较高的细胞活力。另外，实施例3生物墨水组与传统生物墨水组的细胞活力变化趋势相似，均在第8天达到峰值，随后保持稳定，但实施例3生物墨水组的细胞活力整体更高，细胞生长状态更好。
36.6.肝功能指标测定将打印好的人肝脏类器官模型（4层）于第4、6、8、10、12、14和16天使用尿素测定试剂盒、白蛋白测定试剂盒分别测定培养基中的尿素、白蛋白的含量，实验结果如图9、10所示。
37.实验结果表明，实施例3生物墨水组和传统生物墨水组的尿素、白蛋白分泌量均在第8天达到峰值，随后有所降低并保持稳定。在长达16天的培养过程中，实施例3生物墨水组的尿素、白蛋白分泌量均高于传统生物墨水组，说明使用实施例3生物墨水构建的人肝脏类器官合成、分泌能力更强。
38.7.糖脂代谢实验
在实施例3中所述的培养基更换频率的基础上，将打印好的人肝脏类器官模型（4层）于第4、6、8、10、12、14和16天更换新鲜的高糖dmem培养基培养24h后，使用葡萄糖含量试剂盒、糖原含量试剂盒分别测定葡萄糖消耗量及细胞内糖原含量。
39.在上述时间点更换新鲜的dmem培养基（无血清、无葡萄糖）培养24h后，使用新鲜的dmem培养基（无血清、无葡萄糖，含10mm的l-乳酸钠和1mm的丙酮酸钠）继续培养24h后，使用葡萄糖含量试剂盒测定培养基中葡萄糖含量，以反映肝脏类器官模型的糖异生率。
40.在上述时间点使用总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒分别测定细胞内总胆固醇和甘油三酯的含量，以反映模型的脂质合成代谢能力，实验结果分别如图11-15所示。
41.实验结果表明，实施例3生物墨水组与传统生物墨水组相比，其葡萄糖消耗量、细胞内糖原含量、糖异生率、细胞内总胆固醇和甘油三酯的含量均有显著提高。同时，上述5个指标的最大值均已超过相关文献报道的最大值，且除葡萄糖消耗量外，其余4个指标已经达到了与体内（in vivo）条件相近的水平，说明使用实施例3生物墨水构建的人肝脏类器官模型具有强糖脂代谢能力，优于现有模型，在相关药物筛选的应用上更有优势。
42.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.称取明胶、海藻酸钠和羟乙基纤维素；s2.将明胶溶于超纯水中，加入海藻酸钠和羟乙基纤维素不断搅拌至体系均匀，灭菌，冷藏保存备用，制得生物墨水；s3.将细胞悬液与步骤s2制得的生物墨水混合均匀，制得载细胞生物墨水，装载于无菌注射器中，使用3d生物打印机进行打印，得到人肝脏类器官模型；s4.将步骤s3打印得到的人肝脏类器官模型于含金属离子的溶液中交联，然后在培养基中培养，得到具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官。2.根据权利要求1所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s1中所述明胶、海藻酸钠和羟乙基纤维素的质量比为18-22：3-5：3-5。3.根据权利要求1所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s2中所述灭菌的条件为118-125℃，0.05-0.15mpa下灭菌20-30min。4.根据权利要求1所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s3中所述载细胞生物墨水的细胞密度为4-6
×
106cells/ml；所述细胞悬液与生物墨水的体积比为1:3-5。5.根据权利要求1所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s3中所述打印的条件为20-30℃、3-7mm/s打印速度、50-70％挤出倍率。6.根据权利要求1所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s4中所述含金属离子的溶液为cacl2、bacl2、fecl2、cucl2、mgcl2、zncl2中的至少一种。7.根据权利要求6所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s4中所述含金属离子的溶液为2-4wt％的cacl2溶液。8.根据权利要求6所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s4中所述培养基为高糖dmem培养基，其含8-12vol％胎牛血清、14-18vol％非必需氨基酸和5-10vol％必需氨基酸。9.根据权利要求6所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种；所述必需氨基酸选自甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸中的至少一种。10.根据权利要求6所述具有强糖脂代谢能力的3d生物打印人肝脏类器官的建立方法，其特征在于，步骤s4中所述培养条件为37℃、5％co2，其中％为体积百分比。

技术总结
本发明提出了一种具有强糖脂代谢能力的3D生物打印人肝脏类器官的建立方法，属于生物技术领域，包括：S1.称取明胶、海藻酸钠和羟乙基纤维素；S2.将明胶溶于超纯水中，加入海藻酸钠和羟乙基纤维素不断搅拌至体系均匀，灭菌，制得生物墨水；S3.将细胞悬液与步骤S2制得的生物墨水混合均匀，制得载细胞生物墨水，装载于无菌注射器中，使用3D生物打印机进行打印，得到人肝脏类器官模型；S4.将步骤S3打印得到的人肝脏类器官模型于含金属离子的溶液中交联，然后在培养基中培养，得到具有强糖脂代谢能力的3D生物打印人肝脏类器官。本发明制备的人肝脏类器官的糖脂代谢能力与现有模型相比有较大幅度提高，且部分指标达到体内水平。且部分指标达到体内水平。


技术研发人员：吴春勇 张峻颖 庄肯 袁耀佐 康立峰
受保护的技术使用者：江苏省食品药品监督检验研究院
技术研发日：2023.01.03
技术公布日：2023/7/19