作为用于延缓衰老的活性物质的胶原蛋白水解物的制作方法

1.本发明涉及用作活性物质以延缓人或动物的身体内的细胞的衰老的胶原蛋白水解物。


背景技术：

2.一方面，人或动物的身体内的生物学衰老与外部环境影响有关，这些影响在一生中累积。然而，与这样的环境影响无关，在单个的身体细胞的水平上，衰老和一生中端粒的逐渐缩短之间也存在着普遍的联系。端粒是染色体末端的重复的dna片段，每次细胞分裂时，端粒最初会变短。这种缩短可以由dna合成酶端粒酶部分地补偿，端粒酶(telomerase)的活性在不同的细胞类型中差异很大。一旦端粒的长度降低到低于特定值，则不再有进一步的细胞分裂。
3.对于生物体的衰老过程和寿命，与其说与端粒的原始长度相关，不如说与端粒缩短速率更相关，例如端粒缩短速率可被定义为每年生命以碱基对计的端粒的平均缩短(参见k whittemore等人.pnas 116(2019)15122-15127中)。
4.一段时间以来，一直在寻找对抗端粒的缩短的活性物质，从而以这种方式延缓人或动物的身体内的细胞的衰老，由此延缓组织、器官和整个身体的衰老。这种考虑特别(但不仅仅)与皮肤的衰老有关，因为这在外表上特别明显。
5.作为用于延缓衰老的相应活性物质，已经提出了各种植物提取物，例如wo2005/044179a2中的黄芪(astralagus)属和升麻(cimicifuga)属或wo2018/139835a1中的树参(dendropanax)属和卡帕藻(kappaphycus)属的植物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提出一种有效的活性物质，其用于延缓人或动物的身体内的细胞的衰老。
7.根据本发明，为了实现该目的，提出使用胶原蛋白水解物作为相应的活性物质。细胞试验已经能够显示胶原蛋白水解物显著对抗端粒的缩短并激活端粒酶，这将在下文中详细解释。
8.特别地，本发明涉及胶原蛋白水解物用于延缓皮肤的衰老的用途。其通常表现为形成皱纹、丧失弹性、形成所谓的雀斑等的形式。在这种情况下，受胶原蛋白水解物的作用影响的身体的细胞是成纤维细胞。
9.本发明范围内衰老可被延缓的其它类型的身体细胞是其它结缔组织细胞如成骨细胞和软骨细胞、以及肌肉细胞(肌细胞)、神经系统细胞(神经元)和免疫系统细胞。
具体实施方式
10.在本发明的优选实施方案中，胶原蛋白水解物的用途是非治疗用途，也就是说，特别是美容用途。这是考虑到作为自然过程的身体的生物学衰老并不是需要医学意义上的治
疗的病理性病况的事实。然而，延缓衰老可有助于改善生活质量。
11.根据本发明的其它方面，胶原蛋白水解物的用途是预防和/或治疗与年龄相关的疾病的治疗用途。特别地，与端粒的缩短相关的这类疾病为动脉粥样硬化、慢性肝病、炎性肠病和某些肾上腺和脾脏疾病。随着年龄的增长而渐增地出现的其它疾病是骨质疏松症、关节病、肌肉减少症和例如阿尔茨海默病等痴呆症。
12.在根据本发明的用途中，胶原蛋白水解物优选对抗身体的细胞中的端粒的缩短，特别是降低端粒缩短速率。如上所述，至少在不同物种之间进行比较时，端粒缩短速率与寿命有关。在人成纤维细胞中进行的细胞试验能够明确显示由胶原蛋白水解物导致的该速率的降低。
13.在根据本发明的用途的范围内，胶原蛋白水解物可以激活身体的细胞中的端粒酶(enzyme telomerase)。在用人成纤维细胞进行的细胞试验中也可以显示出这种效果。然而，端粒酶的激活不一定是对抗端粒的缩短的唯一作用机制。
14.诚然，来自胶原蛋白水解物的积极的生理学作用早已为人所知，尤其是与骨质疏松症或关节疾病相关。然而，完全没有迹象表明胶原蛋白水解物和端粒之间的相互作用，因此在本发明范围内观察到的活性完全令人惊讶。
15.取决于胶原蛋白水解物的用途是非治疗性的还是治疗性的，在本发明的范围内，胶原蛋白水解物可以作为营养补充剂施用或作为药物施用。在任何情况下，胶原蛋白水解物是无论如何都不存在任何健康风险并且没有已知的有害副作用的产品。
16.优选地，胶原蛋白水解物是口服施用的。已知即使在高达10000da的相对高的分子量下，胶原蛋白水解物的肽也至少在一定程度上在肠道中被重吸收。因此，原则上，口服施用的胶原蛋白水解物可以到达身体的所有细胞作为作用部位。
17.胶原蛋白水解物的实际施用形式可以是作为粉末、溶液、凝胶、片剂或胶囊。
18.施用的胶原蛋白水解物的日剂量，特别是在口服施用的情况下，有利地为约0.5g至约20g、优选约2g至约15g、更优选约3g至约10g、特别是约4g至约8g的日剂量。
19.作为根据本发明的活性物质，胶原蛋白水解物通常具有500至15000da、优选1000至8000da、更优选1500至5000da、最优选1800至2200da的平均分子量。在每种情况下，引述的数字是指重均分子量，其可以特别通过凝胶渗透色谱法来确定。
20.优选地，胶原蛋白水解物是通过含胶原蛋白的起始材料的酶水解而产生的。对于这种水解，特别地，使用微生物或植物来源的内肽酶或外肽酶。适当选择肽酶和水解条件使得能够产生在各个期望的分子量范围内的胶原蛋白水解物。
21.含胶原蛋白的起始材料通常选自脊椎动物、优选哺乳动物或鸟类的皮或骨，特别是牛或猪的皮(牛皮或猪皮)。作为替代物，含胶原蛋白的起始材料可以选自鱼、特别是冷水鱼或温水鱼的皮、骨和/或鳞。
22.然而，作为起始材料，胶原蛋白水解物也可以从无脊椎动物获得并在本发明的范围内使用。例如，胶原蛋白水解物可以从软体动物或水母产生。
23.胶原蛋白水解物可以由这些起始材料以一步法产生，或经由明胶的中间阶段产生，在这种情况下，可以使用a型明胶和b型明胶二者。
24.优选地，胶原蛋白水解物是通过至少两种不同特异性的内切蛋白酶、特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶(即分别在特定氨基酸之前和之后破坏胶原蛋
白分子的氨基酸序列的蛋白酶)的依次作用来产生的。有利的是，金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶是来自微生物枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(aspergillus oryzae)和蜂蜜曲霉(aspergillus melleus)的酶。
25.作为选择合适的内切蛋白酶的结果，不仅可以获得胶原蛋白水解物的特定分子量分布，还可以影响水解物中的肽的末端的氨基酸类型。在这方面，优选例如胶原蛋白水解物的至少50％的n-末端氨基酸是疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
26.作为酶水解的替代方案，在本发明的范围内，胶原蛋白水解物可以通过重组基因表达来产生。通过使用天然胶原蛋白序列，特别是来自牛或猪的天然胶原蛋白序列，并在遗传修饰的细胞(例如酵母、细菌或植物细胞，特别是烟草)中表达它们，可以生产与含胶原蛋白的相应原料的水解产物基本相同的产品。在这种情况下，可以获得更窄或精确预定的分子量分布。
27.根据本发明的其它实施方案，将胶原蛋白水解物与对抗身体的细胞中的端粒的缩短的至少一种其它活性物质组合施用。在一些情况下，这种组合使得能够实现甚至更显著的效果。
28.对抗端粒的缩短的至少一种其它活性物质优选选自黄芪属(黄蓍)、升麻属(美洲升麻)、树参属和卡帕藻属的植物的植物提取物。
29.根据本发明的其它实施方案，胶原蛋白水解物是在不含除了胶原蛋白水解物以外的任何其它活性物质的组合物中施用的。特别地，可以规定施用的组合物基本上完全由胶原蛋白水解物构成。
30.在胶原蛋白水解物不用作唯一活性物质的情况下，根据本发明的其它实施方案，其可以与具有积极的生理学作用的一种以上的其它组分组合(例如在营养补充剂或药物中)。这类组分优选选自维生素c，b、d、e和k系列维生素、共轭亚油酸、咖啡因及其衍生物、瓜拉那提取物、绿茶提取物、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)、肌酸、l-肉碱、l-瓜氨酸、l-精氨酸、α-硫辛酸、n-乙酰半胱氨酸、nadh、d-核糖、天冬氨酸镁、抗氧化剂如花色素苷(anthocyanin)、类胡萝卜素、黄酮类、白藜芦醇、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和黄原胶如芒果苷、矿物质如铁、镁、钙、锌、硒和磷，以及其它蛋白质、水解物或肽如大豆蛋白、小麦蛋白或乳清蛋白。
31.此外，本发明涉及用于延缓人或动物的身体内的细胞的衰老的方法，其包括向人或动物施用胶原蛋白水解物。已经结合根据本发明的胶原蛋白水解物描述了该方法的优点和优选实施方案。
32.参照下文中的实施例更详细地解释胶原蛋白水解物对端粒的缩短的有效性。
33.实施例
34.关于胶原蛋白水解物对端粒长度和端粒酶的活性的作用，由西班牙马德里的life length进行了下文中描述的对人成纤维细胞的体外试验。
35.1.胶原蛋白水解物对端粒长度的作用
36.1.1细胞培养物
37.所有试验都是对成人成纤维细胞的细胞培养物进行的。在每种情况下，在补充有10％胎牛血清、100单位/ml的青霉素和1000单位/ml的链霉素的高葡萄糖dmem(dulbecco改
良eagle培养基)中以每cm
2 2000个细胞进行接种。每2至3天替换一次培养基，每4至5天，细胞在70％至80％的汇合度(confluence)时传代。
38.与标准条件下的细胞培养物平行的，也在氧化条件下测试细胞培养物，其中上述培养基额外包含10μm的h2o2。
39.1.2胶原蛋白水解物
40.用于试验的胶原蛋白水解物(kh)由申请人以的名称销售。它是由来自猪皮的a型明胶通过酶水解生产的，平均分子量约为2000da。
41.在广泛的浓度范围测试了胶原蛋白水解物的作用。为此，在每种情况下，(在标准条件和氧化条件下)使其中向培养基添加有0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml或10mg/ml的胶原蛋白水解物的细胞培养物生长。相应的对照批次没有添加胶原蛋白水解物。
42.1.3群体倍增次数(population doubling)
43.使细胞培养物生长8周，其中每周确定每次传代的群体倍增次数(pd)。
44.对于标准条件和氧化条件，累积pd在下表中示出。
45.标准条件下每次传代的累积pd
46.kh[mg/ml]00.010.1110第1周3.22.92.63.42.6第2周6.76.56.86.86.2第3周10.29.710.110.39.5第4周13.513.213.913.712.6第5周16.816.216.816.515.9第6周19.518.419.719.518.7第7周23.122.523.223.222.5第8周25.224.725.224.824.5
[0047]
氧化条件下每次传代的累积pd
[0048][0049][0050]
正如预期的，氧化条件下的群体倍增次数始终小于标准条件下的群体倍增次数。相反，胶原蛋白水解物的存在对pd没有显著影响，即，细胞生长本身不受到胶原蛋白水解物影响。
[0051]
1.4端粒长度和缩短速率的确定
[0052]
端粒长度通过荧光原位杂交(fish)来确定。为此，使用与三个重复端粒序列杂交的荧光标记的肽核酸探针。给定的端粒的荧光强度与其长度成比例，在已知端粒长度的对照细胞的辅助下进行定量。
[0053]
在所有测试的细胞培养物中，在4周后和在8周后测定端粒长度，并且在对照批次中，在培养开始时(第0周)测定端粒长度。将细胞固定并使用胃蛋白酶进行裂解，其中对各时间点和各细胞培养物进行五次细胞裂解。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对dna进行染色，并使用探针进行端粒的杂交。
[0054]
然后使用荧光显微镜对dapi染色的细胞核进行定位，并对杂交的端粒的荧光进行定量，其中对每个批次(细胞裂解)评价15个不同的图像区段(image section)。使用适当的软件计算端粒长度和分布，并使用学生t检验进行统计学分析。
[0055]
1.5结果
[0056]
1.5.1端粒长度
[0057]
由通过荧光显微法获得的数据，在4周后和8周后，对于各细胞培养物，计算端粒长度的中值、第20个百分位数(在每种情况下以千碱基对(kbp)为单位)和“短端粒”(小于3kbp)的比例。结果在下表中示出。在每种情况下还示出了根据t检验的p值，其中将各样品与无胶原蛋白水解物的对照批次的相应样品进行比较。在值为p《0.05的情况下，与对照批次的差异为统计上显著的；这些值以粗体示出。
[0058]
标准条件下的端粒长度
[0059][0060]
氧化条件下的端粒长度
[0061][0062]
这些数据显示至少在培养成纤维细胞8周后胶原蛋白水解物对端粒长度的显著作用。这种作用在标准条件下以及在h2o2的存在下均适用，并且适用于所有测试浓度。
[0063]
1.5.2端粒缩短速率
[0064]
为了计算端粒缩短速率，对于各细胞培养物，将4周后和8周后的端粒长度减去培养开始时的端粒长度，除以各自的pd值(参见第1.3节)。因此，该速率表示每次群体倍增端粒的平均缩短。
[0065]
结果在下表中示出，在此，在与对照批次的比较中，在p值低于0.05的情况下，也存在统计学显著性。
[0066]
标准条件下的端粒缩短速率
[0067]
kh[mg/ml]周速率[bp/pd]p值0463.1-0.01449.00.030.1448.50.051459.00.510436.60.0020885.2-0.01873.80.00070.1873.10.0031876.60.00510876.81.0
[0068]
氧化条件下的端粒缩短速率
[0069]
kh[mg/ml]周速率[bp/pd]p值0489.4-0.01482.40.50.1473.00.2
1468.50.110484.10.60892.1-0.01876.70.00010.1866.80.00061886.40.2108120.70.001
[0070]
这些数据显示至少在培养成纤维细胞8周后胶原蛋白水解物对端粒缩短速率的显著作用。这种作用在标准条件下以及在h2o2的存在下均适用，并且适用于所有测试浓度。
[0071]
2.胶原蛋白水解物对端粒酶活性的影响
[0072]
2.1细胞培养物
[0073]
对成人成纤维细胞的原代培养物进行试验。培养基是补充有10％胎牛血清、100单位/ml的青霉素和1000单位/ml的链霉素的高葡萄糖dmem(dulbecco改良eagle培养基)。
[0074]
在培养开始时和在24小时后，确定端粒酶活性。
[0075]
2.2胶原蛋白水解物
[0076]
使用与用于测定端粒长度的胶原蛋白水解物(参见第1.2节)相同的胶原蛋白水解物。向培养基添加0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml或10mg/ml的量的这种物质。未向对照批次添加胶原蛋白水解物。
[0077]
2.3确定端粒酶活性
[0078]
通过trap法(端粒重复序列扩增方案)确定端粒酶的活性。为此，裂解细胞并提取蛋白质。添加寡核苷酸底物，并借助提取的端粒酶以对应于天然端粒的方式将其延长。
[0079]
使用定量实时pcr扩增端粒酶的反应产物。测量变量是在其后荧光首次超过阈值的循环次数(ct值)。借助于不同浓度的hela细胞进行校准使得可以计算样品的相对端粒酶活性(rta)。
[0080]
2.4结果
[0081]
培养开始时的成纤维细胞和24小时后不同kh浓度的成纤维细胞中的相对端粒酶活性各测定三次。下表示出了在每种情况下与对照批次(无kh)进行比较时，平均值和标准偏差(sd)以及根据t检验得出的p值。如果p值低于0.05，则存在统计学显著性。
[0082]
相对端粒酶活性
[0083]
kh[mg/ml]小时rta平均值sdp值001.90.3-0241.40.4-0.01240.90.20.60.1241.60.50.031242.50.40.310242.11.00.2
[0084]
这些数据显示，通过添加浓度为0.1、1或10mg/ml的胶原蛋白水解物，成纤维细胞中的端粒酶活性增加，尽管这种增加仅在0.1mg/ml的情况下显著。

技术特征：
1.一种胶原蛋白水解物，其用作活性物质以延缓人或动物的身体内的细胞的衰老。2.根据权利要求1使用以延缓皮肤的衰老的胶原蛋白水解物，其中所述身体的细胞是成纤维细胞。3.根据权利要求1或2使用的胶原蛋白水解物，其中所述用途是非治疗用途，特别是美容用途。4.根据权利要求1或2使用的胶原蛋白水解物，其中所述用途是预防和/或治疗与年龄相关的疾病的治疗用途。5.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物对抗身体的细胞中的端粒的缩短，特别是降低端粒缩短速率。6.根据权利要求5使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物激活身体的细胞中的端粒酶。7.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是口服施用的。8.根据权利要求7使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是以粉末、溶液、凝胶、片剂或胶囊的形式施用的。9.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是以约0.5g至约20g的日剂量、优选以约2g至约15g的日剂量、更优选以约3g至约10g的日剂量、特别是以约4g至约8g的日剂量施用的。10.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物的平均分子量为500至15000da、优选1000至8000da、更优选1500至5000da、最优选1800至2200da。11.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是通过含胶原蛋白的起始材料的酶水解而产生的。12.根据权利要求11使用的胶原蛋白水解物，其中所述含胶原蛋白的起始材料选自脊椎动物、优选哺乳动物、鸟类或鱼类的皮或骨，特别是牛或猪的皮。13.根据权利要求11或12使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是通过至少两种不同特异性的内切蛋白酶、特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的依次作用而产生的。14.根据权利要求13使用的胶原蛋白水解物，其中所述金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶选自来自微生物枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉和蜂蜜曲霉的酶。15.根据权利要求14使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物的至少50％的n-末端氨基酸是疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。16.根据权利要求1至10中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是通过重组基因表达而产生的。17.根据前述权利要求中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物要与对抗身体的细胞中的端粒的缩短的至少一种其它活性物质组合施用。18.根据权利要求17使用的胶原蛋白水解物，其中所述至少一种其它活性物质选自黄芪属(黄蓍)、升麻属(美洲升麻)、树参属和卡帕藻属的植物的植物提取物。19.根据权利要求1至16中任一项使用的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物要
在不含除了所述胶原蛋白水解物以外的任何其它活性物质的组合物中施用。20.根据权利要求19使用的胶原蛋白水解物，其中要施用的组合物基本上完全由所述胶原蛋白水解物构成。

技术总结
本发明涉及用作活性物质以延缓人或动物的身体内的细胞的衰老的胶原蛋白水解物。的身体内的细胞的衰老的胶原蛋白水解物。


技术研发人员：斯特凡
受保护的技术使用者：格利达股份公司
技术研发日：2021.07.13
技术公布日：2023/7/20