一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于酸奶发酵技术领域，具体涉及一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法及其应用。


背景技术：

2.酸奶发酵剂是酸奶制备过程中必不可少的核心原料，酸奶质量的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质、类型及活力。目前酸奶生产中应用的酸奶发酵剂主要有液态发酵剂、冷冻发酵剂和浓缩冻干发酵剂，其中应用最普遍的是浓缩冻干发酵剂，也叫直投式酸奶发酵剂，其主要的制备过程包括乳酸菌种的增殖培养、浓缩分离、加入冻干保护剂进行乳化，再经过一定的方式干燥而成的固体粉末状发酵剂，其活菌数高，产酸速率快，在酸奶生产过程中无需传代，可以直接接种，使用方便，而且可以保证酸奶产品批次间的质量的稳定性，因此直投式发酵剂(dvs)以其高浓度、高活力以及稳定的产香性、产粘性及产酸性等生产性能而备受发酵乳制品生厂商的青睐，因此进行直投式酸奶发酵剂制备核心工艺的研究很有必要。
3.国内的一些科研机构和公司也陆续开展对乳酸菌发酵剂的研究和生产，其中直投式酸奶发酵剂的制备过程中涉及的菌体高密度培养技术是制备高活性乳酸菌、高得率发酵剂极其关键的中间工艺环节，目前，在前期发酵培养中多采用单菌发酵培养增殖的工艺，例如cn10502287b公开了一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，其制备工艺是将筛选出的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别培养，然后在发酵罐中分别放大培养，待发酵液中活菌数达到一定数量后，将发酵液分离，向得到的两种菌泥中分别加入冻干保护剂，然后分别经过冷冻干燥，干燥后得到单一冻干高活性菌粉；将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的冻干菌粉与其他的辅料按照比例充分混匀复配即得到直投式酸奶发酵剂，其主要采用的就是单菌发酵培养工艺，单菌发酵培养工艺在发酵培养过程中容易出现od增长缓慢，od偏低，导致产量和活菌数以及活性偏低。
4.cn108774627a公开了一种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备工艺及其在酸奶发酵剂冻干粉中的应用，其采用混菌发酵的工艺，在种子保藏阶段直接将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合，制备成混合菌种，然后种子活化阶段就采用混菌培养，经过3次活化培养，制备得到发酵混菌种子，然后在进行上罐发酵培养，并在发酵过程中采用二次接种保加利亚乳杆菌，促进嗜热链球菌的生长，采用此种方法，经过多次混菌传代培养，容易造成嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌二者复配比例的失衡，进而造成批次之间的差异，另外该专利也未涉及到冻干和复配工艺。
5.因此针对现有直投式酸奶发酵剂的现状，突破单菌发酵培养工艺的限制，研究形成一套高活性可产业化的直投式酸奶发酵剂的制备工艺对解决国内发酵剂产品质量和产业化落后的现状意义深远。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法及其应用。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述制备方法包括：（1）发酵培养：将嗜热链球菌种子液、嗜热链球菌发酵培养基与保加利亚乳杆菌种子液混合培养，得到嗜热链球菌发酵液；将保加利亚乳杆菌种子液、保加利亚乳杆菌发酵培养基与嗜热链球菌种子液混合培养，得到保加利亚乳杆菌发酵液；（2）离心冻干：将嗜热链球菌发酵液与保加利亚乳杆菌发酵液分别离心，收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，乳化，冷冻干燥，得到以嗜热链球菌为主冻干菌粉和以保加利亚乳杆菌为主冻干菌粉；（3）复配：将嗜热链球菌冻干菌粉和保加利亚乳杆菌冻干菌粉混合，即得。
8.本发明依据嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌互利共生的关系，在前期菌体高密度培养阶段创造性地采用混菌培养方式，即在嗜热链球菌发酵培养时添加少量的保加利亚乳杆菌共同培养，而在保加利亚乳杆菌培养时添加少量的嗜热链球菌共同培养，与单菌发酵相比产量、活菌数、发酵活性显著提升。
9.优选地，所述嗜热链球菌种子液和保加利亚乳杆菌种子液的制备方法包括：分别活化并扩大培养嗜热链球菌菌株和保加利亚乳杆菌菌株，得到嗜热链球菌种子液和保加利亚乳杆菌种子液。
10.优选地，所述活化包括将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别接种至脱脂乳，培养。
11.优选地，所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的接种量独立地为1-10%，例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
12.优选地，所述嗜热链球菌的培养温度为35-45℃，培养时间为8-16 h，所述培养温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，所述培养时间可以选择8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、16 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
13.优选地，所述保加利亚乳杆菌的培养温度为35-45℃，培养时间为10-20 h，所述培养温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，所述培养时间可以选择10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14.优选地，所述扩大培养包括将活化后的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种于种子培养基中，培养。
15.优选地，所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的接种量独立地为1-3%，例如1%、2%、3%等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
16.优选地，所述嗜热链球菌培养至od
600
为6-8，例如6、6.5、7、7.5、8等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
17.优选地，所述保加利亚乳杆菌培养至od
600
为7-10，例如7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
18.优选地，步骤（1）所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备方法具体包括将保加利亚乳杆菌种子液与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养，再与嗜热链球菌种子液混合培养。
19.保加利亚乳杆菌种子液先与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养，再与嗜热链球菌种子液混合培养，效果优于将保加利亚乳杆菌种子液、嗜热链球菌种子液和保加利亚乳杆菌发酵培养基同时混合。
20.优选地，步骤（1）所述嗜热链球菌发酵液的制备中，嗜热链球菌种子液的接种量为2-4%，保加利亚乳杆菌种子液的接种量为0.1-0.5%。
21.当以上述特定的接种量接种时，效果更佳。
22.所述嗜热链球菌种子液的接种量可以选择2%、2.5%、3%、3.5%、4%等，所述保加利亚乳杆菌种子液的接种量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
23.优选地，步骤（1）所述嗜热链球菌发酵液的制备中，培养温度为35-45℃，培养时间为5-8 h。
24.所述培养温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，所述培养时间可以选择5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5 h、8 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
25.优选地，所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备中，保加利亚乳杆菌种子液的接种量为2-4%，嗜热链球菌种子液的接种量为0.1-0.5%。
26.当以上述特定的接种量接种时，效果更佳。
27.所述保加利亚乳杆菌种子液的接种量可以选择2%、2.5%、3%、3.5%、4%等，所述嗜热链球菌种子液的接种量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
28.优选地，所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备中，保加利亚乳杆菌种子液与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养的温度为35-45℃，时间为3-5 h。
29.所述保加利亚乳杆菌种子液与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养的温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，培养时间可以选择3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
30.优选地，所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备中，与嗜热链球菌种子液混合培养的温度为35-45℃，时间为5-8 h。
31.所述与嗜热链球菌种子液混合培养的温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，培养时间可以选择5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5 h、8 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
32.优选地，步骤（2）所述保护剂包括海藻糖、甘油、菊粉、山梨糖醇、半胱氨酸或浓缩牛奶蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
33.优选地，所述菌泥与保护剂的质量比为1: (0.3-2)，其中(0.3-2)中的具体点值均可选择0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等，
上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
34.优选地，所述嗜热链球菌冻干菌粉中嗜热链球菌菌株活菌数不低于5
×
10
11 cfu/g，例如5
×
10
11 cfu/g、6
×
10
11 cfu/g、7
×
10
11 cfu/g、8
×
10
11 cfu/g、9
×
10
11 cfu/g、1
×
10
12 cfu/g等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
35.优选地，所述保加利亚乳杆菌冻干菌粉中保加利亚乳杆菌菌株活菌数不低于2
×
10
11
cfu/g，例如2
×
10
11 cfu/g、3
×
10
11 cfu/g、4
×
10
11 cfu/g、5
×
10
11 cfu/g等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
36.优选地，步骤（3）所述嗜热链球菌冻干菌粉和保加利亚乳杆菌冻干菌粉的质量比为(1-100):1，其中(1-100)中的具体点值均可选择1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
37.优选地，步骤（3）还包括与麦芽糊精、益生元或甜味剂中的任意一种或至少两种混合。
38.优选地，所述益生元包括低聚果糖、菊粉、低聚半乳糖或聚葡萄糖中的任意一种或至少两种的组合。
39.优选地，所述甜味剂包括葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖、甜菊糖苷或罗汉果甜苷中的任意一种或至少两种的组合。
40.第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法制备得到的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂。
41.第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂在酸奶生产中的应用。
42.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明依据嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌互利共生的关系，在前期菌体高密度培养阶段创造性地采用混菌培养方式，即在嗜热链球菌发酵培养时添加少量的保加利亚乳杆菌共同培养，而在保加利亚乳杆菌培养时添加少量的嗜热链球菌共同培养，同时结合高密度发酵培养技术大大提高发酵培养过程中菌液的od，嗜热链球菌发酵od达到20以上，保加利亚乳杆菌发酵od达到15以上。菌粉产量相较于单菌培养工艺提升30%，吨发酵液产量＞1.5kg，冻干菌粉水分含量＜3%，水分活度＜0.05，各单菌冻干制品嗜热链球菌5000亿cfu/g以上，保加利亚乳杆菌2000亿cfu/g以上。与单菌发酵相比产量、活菌数、发酵活性显著提升。此外只在发酵培养阶段采用混菌培养工艺，避免多次传代培养，造成生产批次间的差异，可以提高生产批次间的稳定性。
附图说明
43.图1是根据实施例1所述直投式酸奶发酵剂制备方法制备的不同批次直投式酸奶发酵剂发酵活力曲线。
44.图2是根据对比例1所述直投式酸奶发酵剂制备方法制备的不同批次直投式酸奶发酵剂发酵活力曲线。
45.图3是根据实施例4所述直投式酸奶发酵剂制备方法制备的不同批次直投式酸奶发酵剂发酵活力曲线。
46.图4是根据对比例3所述直投式酸奶发酵剂制备方法制备的不同批次直投式酸奶
发酵剂发酵活力曲线。
具体实施方式
47.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
48.下述内容中涉及的嗜热链球菌种子培养基以质量分数计包括葡萄糖2%、牛肉浸粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母膏0.8%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、硫酸镁0.02%、吐温80 0.05%和水余量，118℃灭菌20分钟，初始ph调节为6.5。
49.下述内容中涉及的嗜热链球菌发酵培养基以质量分数计包括蔗糖6%、牛肉浸粉1%、酵母膏1.5%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸氢二铵0.5%、硫酸镁0.02%、吐温80 0.05%和水余量，118℃灭菌15分钟，初始ph调节为6.5。
50.下述内容中涉及的保加利亚乳杆菌种子培养基以质量分数计包括乳糖3%、牛肉浸粉1%、蛋白胨0.5%、酵母膏1%、磷酸氢二钾0.4%、柠檬酸氢二铵0.4%、无水乙酸钠0.2%、硫酸镁0.05%、吐温80 0.05%和水余量，118℃灭菌20分钟，初始ph调节为6.5。
51.下述内容中涉及的保加利亚乳杆菌发酵培养基以质量分数计包括葡萄糖5%、牛肉浸粉0.5%、酵母膏1.5%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸氢二铵0.4%、硫酸镁0.05%、一水硫酸锰0.005%、吐温80 0.05%和水余量，葡萄糖单独灭菌，其他培养基混合后灭菌，灭菌温度118℃，时长30分钟，灭菌后葡萄糖与其他培养基混合。培养基初始ph调节为6.8。
52.下述内容中涉及的嗜热链球菌的保护剂以质量百分含量计包括海藻糖15%、甘油0.5%、菊粉5%、山梨糖醇1%、半胱氨酸0.1%、浓缩牛奶蛋白5%和水余量，充分溶解后使用氢氧化钠、稀盐酸将ph调节为6.5，在105℃下灭菌20 min，冷却至30℃以下备用。
53.下述内容中涉及的保加利亚乳杆菌的保护剂以质量百分含量计包括海藻糖25%，甘油1%，菊粉5%，山梨糖醇6%，半胱氨酸0.5%，其余为水，充分溶解后使用氢氧化钠、稀盐酸将ph调节为5.5，在118℃下灭菌15min，冷却至30℃以下备用。
54.下述内容中涉及的发酵培养基以质量百分含量计包括麦芽糖3%、葡萄糖4%、乳糖6%、脱脂乳粉5%、乳清粉5%、硫酸镁0.6%、硫酸锰0.5%、吐温80 0.6%、生物素0.6%和水余量，115℃灭菌30分钟，待温度冷却至37℃以下备用。
制备例1
55.本制备例提供一种嗜热链球菌冻干菌粉的制备方法，所述制备方法如下：（1）将嗜热链球菌atcc19258甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养12 h，即得到嗜热链球菌atcc19258种子活化培养液。然后将活化后的嗜热链球菌atcc19258按照2%接入嗜热链球菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为7。活化后种子转接2代，即得到嗜热链球菌atcc19258种子液；将保加利亚乳杆菌atcc11842甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养16 h，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子活化培养液。然后将活化后的保加利亚乳杆菌atcc11842按照2%接入保加利亚乳杆菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为8，活化后种子转接2代，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子液；（2）将嗜热链球菌atcc19258种子液按照3%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，同时
接入0.3%保加利亚乳杆菌atcc11842种子液，发酵控制ph为5.5，于38℃温度下培养，从发酵第5h开始，每0.5 h取样，od增加值每0.5h小于1即为发酵终点；（3）发酵结束后进行离心，碟式离心机转速为20000 rpm，收集菌泥，按照菌泥与保护剂重量比为1:1.5的比例充分混合后得到乳化液，进入冻干机进行冻干，冻干曲线如表1所示；表1
56.（4）将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终得到嗜热链球菌冻干菌粉。
制备例2
57.本制备例提供一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法，所述制备方法如下：（1）将嗜热链球菌atcc19258甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养12 h，即得到嗜热链球菌atcc19258种子活化培养液。然后将活化后的嗜热链球菌atcc19258按照2%接入嗜热链球菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为7。活化后种子转接2代，即得到嗜热链球菌atcc19258种子液；将保加利亚乳杆菌atcc11842甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养16 h，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子活化培养液。然后将活化后的保加利亚乳杆菌atcc11842按照2%接入保加利亚乳杆菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为8，活化后种子转接2代，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子液；（2）将保加利亚乳杆菌atcc11842种子液按照3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度为38℃，4h后接入0.3%的嗜热链球菌atcc19258种子培养液继续培养，从发酵第5h开始，每0.5小时取样，od增加值每0.5小时小于1即为发酵终点；（3）发酵结束后进行离心，碟式离心机转速为20000 rpm，收集菌泥，按照菌泥与保护剂重量比以1:0.7的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干曲线如表2所示；表2
58.（4）将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终得到保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
制备例3
59.本制备例提供一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其与制备例2的区别仅在于，步骤（2）为“将保加利亚乳杆菌atcc11842种子液3%和嗜热链球菌atcc19258种子培养液0.3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度38℃，从发酵第5h开始，每0.5小时取样，od增加值每0.5小时小于1即为发酵终点”。
60.其他操作保持不变。
实施例1
61.本实施例提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述的直投式酸奶发酵剂的制备方法包括：（1）将嗜热链球菌atcc19258甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养12 h，即得到嗜热链球菌atcc19258种子活化培养液。然后将活化后的嗜热链球菌atcc19258按照2%接入嗜热链球菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为7。活化后种子转接2代，即得到嗜热链球菌atcc19258种子液；将保加利亚乳杆菌atcc11842甘油管融化后按照5%接入10%脱脂乳中，于38℃下培养16 h，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子活化培养液。然后将活化后的保加利亚乳杆菌atcc11842按照2%接入保加利亚乳杆菌种子培养基中进行扩培，于38℃培养至od
600
为8，活化后种子转接2代，即得到保加利亚乳杆菌atcc11842种子液；（2）嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵培养：嗜热链球菌发酵培养：将嗜热链球菌atcc19258种子液按照3%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，同时接入0.3%保加利亚乳杆菌atcc11842种子液，发酵控制ph为5.5，于38℃温度下培养6 h；保加利亚乳杆菌发酵培养：将保加利亚乳杆菌atcc11842种子液按照3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度38℃，4 h后接入0.3%的嗜热链球
菌atcc19258种子培养液继续培养6 h；（3）离心冻干：发酵结束后，针对得到的嗜热链球菌atcc19258培养液和保加利亚乳杆菌atcc11842培养液分别离心，离心条件为采用碟式离心机转速为20000 rpm，收集菌泥，嗜热链球菌atcc19258按照菌泥与保护剂重量比以1:1.5的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例1表1，保加利亚乳杆菌atcc11842按照菌泥与保护剂重量比以1:0.7的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例2表2；（4）粉碎：将嗜热链球菌atcc19258和保加利亚乳杆菌atcc11842冻干菌体分别放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得嗜热链球菌atcc19258和保加利亚乳杆菌atcc11842冻干菌粉；（5）复配：取各自制备好的嗜热链球菌atcc19258冻干菌粉和保加利亚乳杆菌atcc11842冻干菌粉按照重量比50:1进行混合，即得到工业用的直投式酸奶发酵剂。
实施例2
62.本实施例提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述的直投式酸奶发酵剂的制备方法包括：（1）将嗜热链球菌atcc27603甘油管融化后按照1%接入10%脱脂乳中，于35℃下培养16 h，即得到嗜热链球菌atcc27603种子活化培养液。然后将活化后的嗜热链球菌atcc27603按照2%接入嗜热链球菌种子培养基中进行扩培，于35℃培养至od
600
为6。活化后种子转接2代，即得到嗜热链球菌atcc27603种子液；将保加利亚乳杆菌accc10638甘油管融化后按照1%接入10%脱脂乳中，于35℃下培养20 h，即得到保加利亚乳杆菌accc10638种子活化培养液。然后将活化后的保加利亚乳杆菌accc10638按照2%接入保加利亚乳杆菌种子培养基中进行扩培，于35℃培养至od
600
为7，活化后种子转接2代，即得到保加利亚乳杆菌accc10638种子液；（2）嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵培养：嗜热链球菌发酵培养：将嗜热链球菌atcc27603种子液按照2%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，同时接入0.1%保加利亚乳杆菌accc10638种子液，发酵控制ph为5.5，于35℃温度下培养8 h；保加利亚乳杆菌发酵培养：将保加利亚乳杆菌accc10638种子液按照2%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度35℃，5h后接入0.1%的嗜热链球菌atcc27603种子培养液继续培养8 h；（3）离心冻干：发酵结束后，针对得到的嗜热链球菌atcc27603培养液和保加利亚乳杆菌accc10638培养液分别离心，离心条件为采用碟式离心机转速为20000 rpm，收集菌泥，嗜热链球菌atcc27603按照菌泥与保护剂重量比以1:1.5的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例1表1，保加利亚乳杆菌accc10638按照菌泥与保护剂重量比以1:0.7的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例2表2；（4）粉碎：将嗜热链球菌atcc27603和保加利亚乳杆菌accc10638冻干菌体分别放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得嗜热链球菌atcc27603和保加利亚
乳杆菌accc10638冻干菌粉；（5）复配：取各自制备好的嗜热链球菌atcc27603冻干菌粉和保加利亚乳杆菌accc10638冻干菌粉按照重量比10:1进行混合，即得到工业用的直投式酸奶发酵剂。
实施例3
63.本实施例提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述的直投式酸奶发酵剂的制备方法包括：（1）将嗜热链球菌atcc14485甘油管融化后按照10%接入10%脱脂乳中，于42℃下培养8 h，即得到嗜热链球菌atcc14485种子活化培养液。然后将活化后的嗜热链球菌atcc14485按照2%接入嗜热链球菌种子培养基中进行扩培，于42℃培养至od
600
为8。活化后种子转接2代，即得到嗜热链球菌atcc14485种子液；将保加利亚乳杆菌cicc6098甘油管融化后按照10%接入10%脱脂乳中，于42℃下培养10 h，即得到保加利亚乳杆菌cicc6098种子活化培养液。然后将活化后的保加利亚乳杆菌cicc6098按照2%接入保加利亚乳杆菌种子培养基中进行扩培，于42℃培养至od
600
为10，活化后种子转接2代，即得到保加利亚乳杆菌cicc6098种子液；（2）嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵培养：嗜热链球菌发酵培养：将嗜热链球菌atcc14485种子液按照4%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，同时接入0.5%保加利亚乳杆菌cicc6098种子液，发酵控制ph为5.5，于42℃温度下培养5 h；保加利亚乳杆菌发酵培养：将保加利亚乳杆菌cicc6098种子液按照4%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度42℃，3h后接入0.5%的嗜热链球菌atcc14485种子培养液继续培养5 h；（3）离心冻干：发酵结束后，针对得到的嗜热链球菌atcc14485培养液和保加利亚乳杆菌cicc6098培养液分别离心，离心条件为采用碟式离心机转速为20000 rpm，收集菌泥，嗜热链球菌atcc14485按照菌泥与保护剂重量比以1:1.5的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例1表1，保加利亚乳杆菌cicc6098按照菌泥与保护剂重量比以1:0.7的比例充分混合后得到乳化液进入冻干机进行冻干，冻干条件同制备例2表2；（4）粉碎：将嗜热链球菌atcc14485和保加利亚乳杆菌cicc6098冻干菌体分别放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得嗜热链球菌atcc14485和保加利亚乳杆菌cicc6098冻干菌粉；（5）复配：取各自制备好的嗜热链球菌atcc14485冻干菌粉和保加利亚乳杆菌cicc6098冻干菌粉按照重量比100:1进行混合，即得到工业用的直投式酸奶发酵剂。
实施例4
64.本实施例提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述的直投式酸奶发酵剂的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤（5）为“取各自制备好的嗜热链球菌atcc19258冻干菌粉和保加利亚乳杆菌atcc11842冻干菌粉按照重量比50:1进行混合，再加入88%的麦芽糊精，制成规格1g/条的发酵剂，即得到适用于餐饮/家庭用的高活性直投
式酸奶发酵剂”。
65.其他操作保持不变。
实施例5
66.本实施例提供一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，所述的直投式酸奶发酵剂的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中保加利亚乳杆菌发酵培养的方法为“将保加利亚乳杆菌atcc11842种子液3%和嗜热链球菌atcc19258种子培养液0.3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度38℃，培养10 h”。
67.其他操作保持不变。
对比制备例1
68.本对比制备例提供一种嗜热链球菌冻干菌粉的制备方法，其与制备例1的区别仅在于，步骤（2）为“将嗜热链球菌atcc19258种子液按照3.3%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃温度下培养，从发酵第5h开始，每0.5 h取样，od增加值每0.5h小于1即为发酵终点”。
69.其他操作保持不变。
对比制备例2
70.本对比制备例提供一种保加利亚乳杆菌的制备方法，其与制备例2的区别仅在于，步骤（2）为“将保加利亚乳杆菌atcc11842种子液按照3.3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，培养温度为38℃，从发酵第5h开始，每0.5小时取样，od增加值每0.5小时小于1即为发酵终点”。
71.其他操作保持不变。
对比例1
72.本对比例提供一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中嗜热链球菌发酵培养方法为“将嗜热链球菌种子液按照3.3%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃下，培养6 h”。保加利亚乳杆菌发酵培养方法为“将保加利亚乳杆菌种子液按照3.3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃温度下，培养10 h”。
73.其他操作保持不变。
对比例2
74.本对比例提供一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤（2）为“将嗜热链球菌种子液按照3.3%、保加利亚乳杆菌种子液按照3.3%接种于发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃温度下，培养10 h”。
75.其他操作保持不变。
对比例3
76.本对比例提供一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，其与实施例4的区别仅在于，步骤（2）中嗜热链球菌发酵培养方法为“将嗜热链球菌种子液按照3.3%接种至嗜热链球菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃下，培养6 h”。保加利亚乳杆菌发酵培养方法为“将保加利亚乳杆菌种子液按照3.3%接种至保加利亚乳杆菌发酵培养基中，发酵控制ph为5.5，于38℃下，培养10 h”。
77.其他操作保持不变。
测试例1
78.原菌粉发酵活力、水分、水活、活菌数以及菌粉产量对比分析针对制备例1-3和对比制备例1-2提供的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌冻干菌粉进行发酵活力，水分、水活和活菌数的检测，并统计两种不同培养方式的菌粉产量，具体测试方法如下：活菌数检测方法为gb 4789.35-2016所规定检测方法。
79.发酵活力测试：脱脂乳培养基：10%脱脂乳，其余为纯水，99℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。上述菌粉以30g/t接种量接入脱脂乳培养基中，43℃发酵6小时测定ph和滴定酸度。
80.水分测定依据gb 5009.3烘干恒重法。
81.水活测定采用快速水活测定仪测定。
82.结果如表3所示。
83.表3
84.由表3可以看出相较于单独发酵工艺，采用混合发酵培养工艺可以显著提升缩短发酵时间，并且可以明显提高终点od，大大提高菌粉产量，而且制备菌粉的活菌数和活力明显提升，这主要是因为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌之间是一种协同共生关系，二者共同培养式可以促进彼此快速的生长。
测试例2
85.原菌粉储藏稳定性对比分析
针对制备例1-3和对比制备例1-2提供的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌冻干菌粉放置于37℃环境，跟踪测定0、14、28天的活菌数，活菌数测试方法同测试例1，具体结果如表4所示：表4
86.由表4可以看出，相较于单独发酵工艺，采用混合发酵培养工艺也可以显著提升菌粉的稳定性。
测试例3
87.直投式酸奶发酵剂发酵特性测试分析针对实施例1-5和对比例1-3提供的工业用直投式酸奶发酵剂和餐饮/家庭用直投式酸奶发酵剂进行发酵活力、后酸跟踪测试，同时利用制备的直投式酸奶发酵剂制备酸奶进行感官品评分析，测试方法如下：发酵活力测试：脱脂乳培养基：10%脱脂乳，其余为纯水，99℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。工业用直投式酸奶发酵剂按照30g/t接种，餐饮/家庭用直投式酸奶发酵剂按照1g/l接种，接入脱脂乳培养基中，43℃发酵6小时测定ph和滴定酸度。
88.后酸跟踪测试：将发酵至70ot的酸奶终止后置于10℃环境中，采用酸碱滴定法跟踪测定第1、7、14和21天的酸度变化。
89.感官品评测试：94%生牛乳+6%白砂糖，95℃灭菌5min，冷却后接种，发酵至70ot终止，冷却后熟后，选取志愿者20名组成评价小组，该小组成员都经过专业的食品感官分析和评价培训，对实施例1-5对比例1-3提供的直投式酸奶发酵剂发酵制备的酸奶进行感官评价并打分。评价指标如表5所示，评价结果如表6所示。
90.表5
91.表6
92.结果显示，与对比例1相比，实施例1-3制备的工业用直投式酸奶发酵剂产酸速度更快，而后酸跟踪结果显示，三者在货架期内的后酸变化以及制备酸奶感官评分结果基本比较接近，同样实施例4和对比例3相比，实施例4制备的餐饮/家用直投式酸奶发酵剂产酸速度也明显更好，货架期内后酸变化以及制备酸奶感官评分结果基本比较接近，说明由于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌之间的协同共生关系，采用混合发酵培养工艺效果较传统工艺（单独发酵）更好，利用此工艺制备的直投式酸奶发酵剂可以显著提高发酵产酸速度，同时对菌种的后酸以及感官特性没有影响。与实施例5、对比例2相比，实施例1-3制备的工业用直投式酸奶发酵剂的效果更好，说明嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合发酵方式与保加利亚乳杆菌的发酵方法同样会影响发酵剂的发酵效果。
测试例4
93.直投式酸奶发酵剂储存稳定性对比分析针对实施例1-5和对比例1-3提供的工业用直投式酸奶发酵剂和餐饮/家庭用直投式酸奶发酵剂进行储存稳定性跟踪测试，测试方法如下：将直投式酸奶发酵剂放置于37℃环境中，跟踪测定0，14，28天的活菌数和发酵活力，活菌数测定同测试例1，发酵活力测试同测试例3。
94.具体结果如表7所示：表7
95.结果显示，与对比例1相比，实施例1-3制备的工业用直投式酸奶发酵剂在货架期内活菌数和发酵活力衰减更慢，同样实施例4和对比例3相比，实施例4制备的餐饮/家用直投式酸奶发酵剂在货架期内活菌数和发酵活力衰减更慢，说明采用混合发酵培养工艺也可以显著提升菌粉的稳定性，进而提升直投式酸奶发酵剂产品的储存稳定性。与实施例5、对比例2相比，实施例1-3制备的工业用直投式酸奶发酵剂在货架期内活菌数和发酵活力衰减更慢，说明嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合发酵方式与保加利亚乳杆菌的发酵方法同样会影响发酵剂的发酵效果。
测试例5
96.直投式酸奶发酵剂批次稳定性对比分析参照实施例1、对比例1、实施例4和对比例3的直投式酸奶发酵剂的制备工艺分别进行4批次的中试生产测试，分别对比测定这4批次直投式酸奶发酵剂的活菌数、发酵活力曲线的差异，活菌数的测试方法参照测试例1，发酵活力曲线测定方法：脱脂乳培养基：10%脱脂乳，其余为纯水，99℃灭菌30分钟，冷却至室温备用，接种后采用多参数分析仪（雷磁）监测发酵过程中ph的变化，活菌数的结果如表8所示，发酵活力曲线如图1-4所示。
97.表8
98.由表8和图1-4的结果可以看出，实施例1、实施例4和对比例1、对比例3制备的直投式酸奶发酵剂不同批次之间活菌数非常接近，发酵活力曲线重合性较好，波动性均比较少，说明采用混菌发酵培养工艺制备的直投式酸奶发酵剂与单菌发酵培养相比，批次之间的稳
定性依然较好，即本发明所述的发酵培养工艺制备的直投式酸奶发酵剂可以保证批次之间的稳定性。
99.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
100.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
101.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：（1）发酵培养：将嗜热链球菌种子液、嗜热链球菌发酵培养基与保加利亚乳杆菌种子液混合培养，得到嗜热链球菌发酵液；将保加利亚乳杆菌种子液、保加利亚乳杆菌发酵培养基与嗜热链球菌种子液混合培养，得到保加利亚乳杆菌发酵液；（2）离心冻干：将嗜热链球菌发酵液与保加利亚乳杆菌发酵液分别离心，收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，乳化，冷冻干燥，得到以嗜热链球菌为主冻干菌粉和以保加利亚乳杆菌为主冻干菌粉；（3）复配：将嗜热链球菌冻干菌粉和保加利亚乳杆菌冻干菌粉混合，即得。2.根据权利要求1所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备方法具体包括将保加利亚乳杆菌种子液与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养，再与嗜热链球菌种子液混合培养。3.根据权利要求1所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述嗜热链球菌发酵液的制备中，嗜热链球菌种子液的接种量为2-4%，保加利亚乳杆菌种子液的接种量为0.1-0.5%。4.根据权利要求1所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述嗜热链球菌发酵液的制备中，培养温度为35-45℃，培养时间为5-8 h。5.根据权利要求1所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌发酵液的制备中，保加利亚乳杆菌种子液的接种量为2-4%，嗜热链球菌种子液的接种量为0.1-0.5%。6.根据权利要求2所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，保加利亚乳杆菌种子液与保加利亚乳杆菌发酵培养基混合培养的温度为35-45℃，时间为3-5 h。7.根据权利要求2所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，所述与嗜热链球菌种子液混合培养的温度为35-45℃，时间为5-8 h。8.根据权利要求1所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述嗜热链球菌冻干菌粉和保加利亚乳杆菌冻干菌粉的质量比为(1-100):1。9.根据权利要求1-8中任一项所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法制备得到的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂。10.根据权利要求9所述的高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂在酸奶生产中的应用。

技术总结
本发明涉及一种高活性、高稳定性的直投式酸奶发酵剂的制备方法及其应用，所述制备方法包括：将嗜热链球菌种子液、嗜热链球菌发酵培养基与保加利亚乳杆菌种子液混合培养，得到嗜热链球菌发酵液；将保加利亚乳杆菌种子液、保加利亚乳杆菌发酵培养基与嗜热链球菌种子液混合培养，得到保加利亚乳杆菌发酵液；将发酵液分别离心，收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，乳化，冷冻干燥，得到以嗜热链球菌为主冻干菌粉和以保加利亚乳杆菌为主冻干菌粉；将冻干菌粉混合，即得。本发明依据嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌互利共生的关系，在前期菌体高密度培养阶段创造性地采用混菌培养方式，与单菌发酵相比产量、活菌数、发酵活性显著提升。发酵活性显著提升。发酵活性显著提升。


技术研发人员：方曙光 郭晓娟 王涛 汪欣 朱建国
受保护的技术使用者：微康益生菌（苏州）股份有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/7/20