一种防治HPV感染及菌群失调的阴道凝胶及其制备方法与流程

一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶及其制备方法
技术领域
1.本发明属于合成生物医学材料技术领域，具体涉及一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(hpv)长时间持续感染，尤其是hpv16、hpv18等黏膜高危致癌性的病毒，一定程度上增加了宫颈上皮的瘤变，也提高了宫颈癌症的发生率，hpv16和hpv18与世界上70％~76％的宫颈癌相关。
3.同时，加德纳菌等引起宫颈炎症，也是常见妇科宫颈病变疾病之一。且研究显示，加德纳菌等条件致病菌所引起的黏液脓性宫颈炎会增加hpv的感染风险，进一步提高了宫颈癌症的发生风险。
4.hpv感染和加德纳菌等菌群失调都是造成宫颈癌症发生的重要因素，且临床中两者同时感染的情况大有所在，病况及机理情况更为复杂。而目前的药物多是分别关注抑制hpv感染，或抑菌和调节菌群失调，对两者共同感染发展为宫颈癌的防治药物报道较少。
5.乳铁蛋白，是一个80kda的铁结合糖蛋白，不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能。研究表明，乳铁蛋白是动物初乳中的天然蛋白质，是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。目前针对乳铁蛋白防治hpv感染的研究越来越多，但其功能较为单一，需要进一步改善。


技术实现要素：

6.本发明提供一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，该凝胶对hpv感染和加德纳菌感染具有预防和治疗的作用，联合两种感染途径的防治，能够大大降低癌变的可能性，为女性私处提供健康的环境。
7.一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶系由乳铁蛋白与多聚唾液酸、泊洛沙姆混合而成的凝胶。
8.所述乳铁蛋白包括但不限于乳铁蛋白、乳铁蛋白的修饰产物、乳贴蛋白的衍生物中的一种或组合。其中，乳铁蛋白来源包括但不限于哺乳动物源、及通过生物发酵的方式获得的人工乳铁蛋白；所述乳铁蛋白、乳铁蛋白的修饰产物、乳贴蛋白的衍生物中，包括至少一个色氨酸。
9.所述多聚唾液酸(polysialic acid，psa)是一类线性、均一多聚α2,8连接唾液酸的独特碳水化合物，它主要通过典型的n-连接糖苷键附着在脊椎动物神经系统神经黏附分子上。其水解产物为唾液酸，唾液酸是含9个碳的α-酮酸，唾液酸根据存在位置和形式不同，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、促进神经的发育。
10.正常情况下，阴道里可以存活大量的病原微生物，相互依存相互制约，彼此之间保
持一定的量，所以不会引起发病。但如果机体免疫力低下，导致阴道生态平衡被破坏，使优势病原菌大量繁殖就会引起阴道炎症。唾液酸苷酶含量是评价阴道环境的一项指标，系由加德纳菌和厌氧菌产生，如果数值超过7iu/ml可以确诊细菌性阴道炎。因此在患有炎症的阴道中唾液酸苷酶含量大大提高。唾液酸苷酶能够将多聚唾液酸水解成单个唾液酸分子。
11.多聚唾液酸带有大量负电荷，能够与带正电的乳铁蛋白通过静电结合；进一步的，多聚唾液酸在唾液酸苷酶的作用下水解成单个唾液酸分子，水解后同时释放乳铁蛋白和唾液酸，乳铁蛋白起到抗菌抗癌作用，唾液酸起到抗肿瘤、抗炎、抗病毒的作用。
12.由于多聚唾液酸与乳铁蛋白均具有较高的水溶性，在水中难以形成凝胶，故加入泊洛沙姆。所述的泊洛沙姆是由聚氧乙烯（peo）和聚氧丙烯（ppo）组成的嵌段共聚物，为白色颗粒，其15％或更高浓度的水溶液具有可逆热敏凝胶化的性质，在低温时为液体，当加热到凝胶化温度以上时，则形成半固体状的透明凝胶；本发明选用的泊洛沙姆组合物在常温及以下为流动的液体，在人体温度下为半固态凝胶。
13.进一步的，所述凝胶还可以加入保湿剂如甘油，防腐剂如尼泊金酯、苯甲酸钠、苯甲酸中的一种或组合。
14.有益效果：
15.本发明提供的阴道凝胶对由hpv感染或/和菌群失调引起的宫颈炎症、病变、癌变均具有预防和治疗的作用；具体为对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用；对人宫颈癌细胞具有抑制增值作用的同时对正常细胞的影响较低。
附图说明
16.附图1为电泳结果，m为dna marker,500bp，1为阴道凝胶iv在ph=6含酶溶液中孵育4h，2为对比例2（不含乳铁蛋白）阴道凝胶在ph=6含酶溶液中孵育4h，3为阴道凝胶iv在ph=6不含酶溶液中孵育4h，4为对比例1（不含多聚唾液酸）阴道凝胶在ph=6含酶溶液中孵育4h。
17.附图2为阴道凝胶iv或对比例1阴道凝胶在有酶或无酶的缓冲液中孵育若干时间的电泳结果换算的荧光强度值趋势图。
18.附图3为阴道凝胶iv在不同ph值的酶缓冲液中孵育4h后的电泳结果换算的荧光强度值趋势图及唾液酸浓度趋势图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
20.本发明的阴道凝胶通过以下方法制备得到：配置ph=7~7.5的tris-hcl缓冲液；以缓冲液分别溶解乳铁蛋白、多聚唾液酸，所述乳铁蛋白的浓度为150mg/ml，多聚唾液酸浓度为100~200mg/ml；根据处方量混合乳铁蛋白缓冲液和多聚唾液酸缓冲液，搅拌均匀后，加入泊洛沙姆，搅拌均匀后，继续加入保湿剂和防腐剂，搅拌均匀后即得到阴道凝胶泊洛沙姆选用407和188两个系列，407的添加比例为18~20%，188的添加比例为0.5
~2%。
21.乳铁蛋白的添加比例为2~10%，多聚唾液酸的添加比例为5~15%，保湿剂的添加比例为0~2%，防腐剂的添加比例为0~0.2%，其余为水。
22.乳铁蛋白（来源于牛乳），购于上海源叶生物科技有限公司。
23.泊洛沙姆、多聚唾液酸购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
24.实施例1
25.阴道凝胶i组分：泊洛沙姆407
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18%；泊洛沙姆108
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1.5%；乳铁蛋白
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2%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；余量为水。
26.凝胶温度为：35℃。
27.实施例2
28.阴道凝胶ii组分：泊洛沙姆407
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19.2%；泊洛沙姆108
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1.2%；乳铁蛋白
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5%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；余量为水。
29.凝胶温度为：34℃。
30.实施例3
31.阴道凝胶iii组分：泊洛沙姆407
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19.5%；泊洛沙姆108
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0.8%；乳铁蛋白
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8%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；余量为水。
32.凝胶温度为：34℃。
33.实施例4
34.阴道凝胶iv组分：泊洛沙姆407
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19.5%；泊洛沙姆108
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0.5%；乳铁蛋白
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10%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；
余量为水。
35.凝胶温度为：33℃。
36.实施例5
37.阴道凝胶v组分：泊洛沙姆407
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18.7%；泊洛沙姆108
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0.5%；乳铁蛋白
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10%；多聚唾液酸
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5%；甘油
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2%；余量为水。
38.凝胶温度为：35℃。
39.实施例6
40.阴道凝胶vi组分：泊洛沙姆407
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18.5%；泊洛沙姆108
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1.2%；乳铁蛋白
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10%；多聚唾液酸
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15%；甘油
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2%；余量为水。
41.凝胶温度为：34℃。
42.实施例7
43.阴道凝胶vii组分：泊洛沙姆407
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19.5%；泊洛沙姆108
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0.5%；乳铁蛋白
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10%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；尼泊金酯
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0.2%;余量为水。
44.凝胶温度为：33℃。
45.对比例1阴道凝胶组分：泊洛沙姆407
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18.5%；泊洛沙姆108
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0.5%；乳铁蛋白
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10%；甘油
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2%；余量为水。
46.凝胶温度为：35℃。
47.对比例2
阴道凝胶组分：泊洛沙姆407
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18.7%；泊洛沙姆108
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0.8%；多聚唾液酸
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8%；甘油
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2%；余量为水。
48.凝胶温度为：35℃。
49.测试例1测试阴道凝胶体外唾液酸和乳铁蛋白的释放量。
50.唾液酸苷酶(从clostridium perfringens提取)购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
51.dl500 bp dna marker购于takara公司；fam-dna购于上海生工生物工程有限公司。
52.使用ph 4
−
7范围内的不同ph值的缓冲液体系稀释唾液酸苷酶溶液（200u），不同缓冲液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph3.0
−
6.0)、磷酸盐缓冲液(ph 6.0
−
8.0)。得到酶活为8.5mu的ph=4、ph=5、ph=6（磷酸盐缓冲液）、ph=7的酶液，置于40℃恒温环境备用。
53.将1g阴道凝胶在40℃下凝胶后，注入1ml酶液中，恒温震荡反应若干时间（0、1、2、4、8h）。
54.测定唾液酸含量：吸取20μl反应后的上层清液于100℃下煮沸5 min使酶和乳铁蛋白灭活。用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，tba)法检测释放的唾液酸。
55.测试乳铁蛋白含量：吸取2.5μl反应后的上层清液，加入5μl fam-dna（退火处理，1μmol/l，pbs溶液），加1
×
pbs缓冲液至终体积为20μl，混匀在37℃下孵育20min，然后进行凝胶电泳（bio-rad垂直电泳仪）。在待测样品中加入6
×
loading buffer（含溴酚蓝）3μl，电泳参数为电压100v时间35min，电泳缓冲液为1
×
tbe，胶浓度为10%，根据建立的标准曲线可测算蛋白的浓度（y=298.1592x+4730.3143，r2=0.9936）。
56.采用以上方法测定实施例1制备的阴道凝胶4和对比例1制备的不含多聚唾液酸的阴道凝胶在有或无唾液酸苷酶的情况下的体外释放情况。
57.附图1为电泳结果，m为dna marker,500bp，1为阴道凝胶iv在ph=6含酶溶液中孵育4h，2为对比例2（不含乳铁蛋白）阴道凝胶在ph=6含酶溶液中孵育4h，3为阴道凝胶iv在ph=6不含酶溶液中孵育4h，4为对比例1（不含多聚唾液酸）阴道凝胶在ph=6含酶溶液中孵育4h。
58.附图2为阴道凝胶iv或对比例1阴道凝胶在有酶或无酶的缓冲液中孵育若干时间的电泳结果换算的荧光强度值趋势图（根据凝胶成像系统配套的分析软件 image lab 进行分析，选择alexa488通道），果干时间提取样品后要补充等量的含酶或不含酶的缓冲液，ph=6。
59.附图3为阴道凝胶iv在不同ph值的酶缓冲液中孵育4h后的电泳结果换算的荧光强度值趋势图及唾液酸浓度趋势图。
60.测试例2抑菌活性测试：以加德纳菌和白色念珠菌作为测试菌种，使用抑菌圈法测定凝胶的抑菌性。具体如下：菌液为用pbs缓冲溶液分别稀释到1
×
107cfu/ml，均匀涂布在无菌的
lb固体琼脂培养基上，1g阴道凝胶在40℃下凝固完全后，加入1ml唾液酸苷酶缓冲液（8.5mu ph=4）混合后恒温震荡反应4h后，取上层清液置于培养基中央，将需氧菌于电热恒温培养箱内37℃培养24h，厌氧菌先放入厌氧罐后置于同一培养箱内37℃培养48h，待培养好后，用scan-1200微生物技术仪拍照并测量抑菌圈直径。对照组1为阴道凝胶1加入不含唾液酸苷酶的缓冲液。
61.白色念珠菌（10231）和加德纳菌（14018）购于atcc。
62.各阴道凝胶样品的抑菌圈直径列于表1。
63.表1
64.测试例3阴道凝胶体外抗宫颈癌细胞活性测试。
65.采用mtt法测试阴道凝胶对宫颈癌细胞的抑制增值作用，具体方法如下：将100μl细胞浓度为1
×
104个/ml的人宫颈癌细胞hela或人宫颈上皮细胞h8接种于96孔板，培养过夜；将1g阴道凝胶在40℃下凝固完全后，加入1ml唾液酸苷酶缓冲液（8.5mu ph=6）混合后恒温震荡反应4h后，取上层清液按测试例1的方法测定乳铁蛋白和唾液酸的浓度后用于处理细胞，对照组加入等量细胞培养液，西多福韦作为阳性对照组（浓度为80mg/g），每个剂量接种5个复孔，置于37℃，5%co2培养48h后进行检测。
66.检测步骤：往培养板中每孔加入10μl 5mg/ml mtt试剂，继续培养4h后加入100μldmso，震荡混匀10min后用酶标仪（λ=490nm）测试od值，抑制率按公式计算：抑制率=1-加药组od值/对照组od值
×
100%。
67.阴道凝胶对癌细胞和正常细胞的抑制率如表2所示。
68.表2
69.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述阴道凝胶包括乳铁蛋白与多聚唾液酸、泊洛沙姆；所述阴道凝胶的凝胶温度在33~35℃范围内，低于凝胶温度时阴道凝胶为液体。2.根据权利要求1所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述阴道凝胶包括乳铁蛋白与多聚唾液酸、泊洛沙姆、保湿剂及防腐剂。3.根据权利要求2所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述泊洛沙姆选用407和188，其中407的添加比例为18~20wt%，188的添加比例为0.5~2wt%。4.根据权利要求3所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述阴道凝胶按质量百分比计算包括如下组分：所述泊洛沙姆407的添加比例为18~20%，泊洛沙姆188的添加比例为0.5~2%，乳铁蛋白的添加比例为2~10%，多聚唾液酸的添加比例为5~15%，甘油的添加比例为0~2%，防腐剂的添加比例为0~0.2%，其余为水。5.根据权利要求2所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述阴道凝胶制备方法如下：配置ph=7~7.5的tris-hcl缓冲液；以缓冲液分别溶解乳铁蛋白、多聚唾液酸，所述乳铁蛋白的浓度为150mg/ml，多聚唾液酸浓度为100~200mg/ml；根据处方量混合乳铁蛋白缓冲液和多聚唾液酸缓冲液，搅拌均匀后，加入泊洛沙姆，搅拌均匀后，继续加入保湿剂和防腐剂，搅拌均匀后即得到阴道凝胶。6.根据权利要求4所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述阴道凝胶按质量百分比计算包括如下组分：所述泊洛沙姆407的添加比例为18~20%，泊洛沙姆188的添加比例为0.5~2%，乳铁蛋白的添加比例为10%，多聚唾液酸的添加比例为8%，甘油的添加比例为2%，防腐剂的添加比例为0~0.2%，其余为水。7.根据权利要求1~6任一所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶，其特征在于，所述防腐剂为尼泊金酯、苯甲酸钠、苯甲酸中的一种或组合。8.根据权利要求1~6任一所述的一种防治hpv感染及菌群失调的阴道凝胶的应用，其特征在于，所述阴道凝胶的应用ph环境为4~7。

技术总结
本发明公开了一种防治HPV感染及菌群失调的阴道凝胶及其制备方法，该凝胶系由乳铁蛋白与多聚唾液酸、泊洛沙姆混合而成，阴道凝胶对由HPV感染或/和菌群失调引起的宫颈炎症、病变、癌变均具有预防和治疗的作用；具体为对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用；对人宫颈癌细胞具有抑制增值作用的同时对正常细胞的影响较低。作用的同时对正常细胞的影响较低。作用的同时对正常细胞的影响较低。


技术研发人员：张进 李树莲 奎书毅
受保护的技术使用者：普迪特（泰州）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/20