miR-146a-5p和/或miR-486-5p在诊断先兆流产中的应用

mir-146a-5p和/或mir-486-5p在诊断先兆流产中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体来说，是关于mir-146a-5p和/或mir-486-5p作为先兆流产诊断标志物的应用。


背景技术：

2.胚胎或者胎儿尚未具有生存能力而妊娠终止者称为流产(abortion,miscarriage)。自然流产按照病情发展的不同阶段可以分为先兆流产、难免流产、不全流产和完全流产。先兆流产是自然流产发生的初始阶段，往往经过休息及相关治疗后，症状消失，可继续妊娠；若阴道出血增多或者腹疼加剧，则发展为难免流产。自然流产尤其是反复自然流产的病因复杂，除了最常见的胚胎染色体异常因素外，妊娠女性的感染、免疫紊乱及血栓前状态是这几年在临床病因筛查中检出率较高的胚胎致死因素。不同于胚胎染色体异常，妊娠女性的感染免疫等因素完全是可以通过针对性治疗来控制病情发展而获得成功活产的。因此，如何精准识别妊娠女性潜在的感染、免疫紊乱及血栓问题目前已经成为自然流产及复发性流产临床诊治的瓶颈。
3.微小rna(micrornas，mirnas)是一类由21～25个核苷酸组成的小分子非编码rna，其主要是通过与靶基因转录产物mrna的3
′
或5
′
非翻译区(utr)特异性位点互补结合而抑制靶基因的表达，调节众多细胞生物学进程，如细胞增殖、生长、分化、细胞凋亡、细胞周期等，是表观遗传调控的重要机制之一。妊娠妇女血浆中mirnas水平比未妊娠妇女显著升高，而这些mirnas被认为来源于胎盘滋养层细胞所释放的外泌体，有可能成为预测妊娠结局的特异性标志物。
4.mir-146a-5p是近年来mirnas研究的热点,在人体中序列为ugagaacugaauuccauggguu。研究表明mir-146a-5p在不同物种中高度保守,并参与了各种类型疾病的发生与发展,如炎症、自身免疫性疾病、癌症与肥胖症等,其机制主要通过tlr4、myd88、nf-κb和akt等信号通路来发挥作用(朱嘉豪,陈婷,习欠云.mir-146a参与不同疾病的研究进展[j].中国生物工程杂志,2021,41(9):64-70)。
[0005]
mir-486-5p是目前发现的一种mirnas，在人体中序列为uccuguacugagcugccccgag。研究发现其在结肠癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤中异常表达，并且与肿瘤的增殖、侵袭等生物学功能密切相关，它主要通过靶向不同基因影响肿瘤发生、发展，参与细胞周期、上皮间质转化等过程(王倩倩,任传利.mir-486-5p在肿瘤发生与发展及其他疾病中的最新研究进展[j].国际检验医学杂志,2020,41(22):2801-2804+2816)。


技术实现要素：

[0006]
血浆mir-486-5p与mir-146a-5p水平可能与个体的整体炎症反应状态有关。复发性流产(rm)患者鉴于既往自然流产的痛苦经历，一般于妊娠初始阶段即强烈要求保胎治疗，但约50-60％的早期自然流产是由胚胎染色体异常所致，并不适于保胎干预。因此，为了能够寻找可用于指导临床保胎方向的检测指标，在本发明前期研究中，将rm患者分为胚胎
染色体正常组和胚胎染色体异常组，检测外周血浆中mir-486-5p及mir-146a-5p含量，结果显示：外周血浆中mir-486-5p和mir-146a-5p的表达量，在胚胎染色体正常的rm患者与胚胎染色体异常的rm患者中具有显著差异，且胚胎染色体正常的rm患者中mir-486-5p和mir-146a-5p的表达量较低，提示外周血浆mir-486-5p及mir-146a-5p含量可能成为判断是否需要对先兆流产孕妇进行病因筛查和保胎治疗的重要参考指标。
[0007]
基于前期的研究成果，本发明通过招募不同妊娠情况的女性并采集其外周血样本，采用实时荧光定量pcr法检测其外周血样本中mir-146a-5p和mir-486-5p表达水平，发现与对照组相比，胚胎染色体正常的自然流产女性外周血样本中mir-146a-5p和mir-486-5p的表达水平均显著降低，而复发性流产女性外周血样本中mir-486-5p的表达水平显著降低；此外，本发明还发现随着孕周增加，正常妊娠女性外周血中mir-146a-5p表达水平呈先上升后下降的趋势。此外，经roc分析发现mir-146a-5p和mir-486-5p均具有作为诊断先兆流产潜在标志物的应用价值。
[0008]
基于以上发现，本发明将mir-146a-5p和/或mir-486-5p用于非胚胎因素的先兆流产的早期识别指标，提供了可作为预测或诊断先兆流产的生物标记物——mir-146a-5p和/或mir-486-5p及其用途。
[0009]
因此，本发明的第一个目的在于，提供mir-146a-5p的应用，用于作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测标志物。
[0010]
根据本发明，所述作为检测标志物是检测mir-146a-5p是否低表达。
[0011]
本发明的第二个目的在于，提供mir-486-5p的应用，用于作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测标志物。
[0012]
根据本发明，所述作为检测标志物是检测mir-146a-5p是否低表达。
[0013]
本发明的第三个目的在于，提供一种用于预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒是以mir-146a-5p和/或mir-486-5p作为检测标志物。
[0014]
根据本发明，所述试剂或试剂盒是检测mir-146a-5p和/或mir-486-5p是否低表达。
[0015]
本发明的有益效果是：发明建立的两种mirnas——mir-486-5p以及mir-146a-5p可单独或联合应用作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测指标，为临床检测提供了新的生物标志物，并据此指导后续保胎治疗方案，改善母婴不良妊娠结局；此外，外周血浆mir-146a-5p和/或mir-486-5p水平可能作为判断先兆流产女性中胚胎染色体正常与否的一个指标，为临床保胎治疗提供依据。
附图说明
[0016]
图1为实施例3的自然流产与人工流产女性外周血中mir-146a-5p表达量的结果图。
[0017]
图2为实施例3的自然流产与人工流产女性外周血中mir-146a-5p表达量的roc分析结果图。
[0018]
图3为实施例4的不同妊娠时期女性外周血中mir-146a-5p表达量的结果图。
[0019]
图4为实施例4的不同妊娠时期女性外周血中mir-146a-5p的平均表达水平变化情况图。
[0020]
图5为实施例5的自然流产与人工流产女性外周血中mir-486-5p表达量的结果图。
[0021]
图6为实施例5的自然流产与人工流产女性外周血中mir-486-5p表达量的roc分析结果图。
[0022]
图7为实施例6的复发性流产与正常早孕期女性外周血中mir-486-5p表达量的结果图。
[0023]
图8为实施例6的复发性流产与正常早孕期女性外周血中mir-486-5p表达量的roc分析结果图。
具体实施方式
[0024]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。以下实施例中，除另有说明外，内参mir-146a-5p和mir-486-5p的逆转录和定量pcr引物来源为广州市锐博生物科技有限公司。
[0025]
实施例1、研究对象的招募和外周血样本的收集
[0026]
1、研究对象的招募
[0027]
招募2020年9月至2021年9月期间在天津医科大学第二医院计划生育科门诊就诊的妊娠妇女，按照孕周分为8-14周，15-19周，20-27周三组；对于8-14周早孕女性，进一步按照既往有无胚胎停育病史及本次妊娠情况分为对照组(自愿要求人工流产终止妊娠的健康早孕女性)和自然流产组(就诊时超声提示空囊或胚胎停育的早孕女性)。
[0028]
2、研究对象的纳入标准
[0029]
1)对照组：年龄18-40岁；非孕期bmi为18-25kg/m2，孕期体重增长≤10kg，平素月经规律，超声检查提示胎芽或者胎儿大小与妊娠时间相符，胎心正常。
[0030]
2)自然流产组：年龄18-40岁；bmi为18-25kg/m2，平素月经规律，无分娩史；本次妊娠超声提示胚胎停育，胎芽≤33mm，同意行胚胎绒毛染色体检查。
[0031]
3)复发性流产组(rm)：年龄18-40岁；bmi为18-25kg/m2，平素月经规律，无分娩史；既往发生至少两次早期自然流产(超声提示胚胎停育或枯萎孕囊，不包括生化妊娠)或者1次晚期自然流产(胎死宫内，不包括28周之前特发性早产)；本次妊娠超声提示胚胎停育，胎芽≤33mm，同意行绒毛染色体检查。
[0032]
3、研究对象的排除标准
[0033]
既往有不孕症；本次妊娠为ivf治疗后；既往有确诊的高血压、糖尿病、自身免疫性疾病及深静脉血栓等慢性病史；前次妊娠有确诊的妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病及深静脉血栓等；存在家族遗传病史。
[0034]
4、外周血样本的收集和处理
[0035]
在终止妊娠手术前采集研究对象的外周静脉血5ml，edta抗凝，室温放置2小时后，于4℃下1000g离心15分钟，留取上清液，分装后置于超低温冰箱(-80℃)保存待用。
[0036]
以下实施例中，所有研究对象样本的采集均采用本实施例的标准和方法。
[0037]
实施例2、实时荧光定量pcr(qpcr)法检测外周血样本
[0038]
1、mirna的抽提
[0039]
取300μl外周血样本至1.5ml离心管，于4℃以1000g离心5min后，吸取250μl上层血
浆，加入750μl tri ls(ts120，mrc公司)，室温静置5min后短暂离心；加入200μl氯仿后，剧烈震荡15s，室温静置15min，而后于4℃以12000g离心15min；吸取上清(400μl)至另一无酶离心管，加入400μl异丙醇和0.5μl糖原后，震荡混匀15s，室温静置15～30min，于4℃以12000g转速离心15min后，弃上清；加入1ml 75％乙醇小心洗涤沉淀，并于4℃以7500g转速离心5min后弃上清；重复一次75％乙醇洗涤过程，然后室温下晾干2～5min，加入25μl预热至65℃的rnase-free水溶解rna。
[0040]
2、cdna的合成
[0041]
用first strand cdna synthesis kit(fsk-101，toyoba公司)，以及反转录引物loop_rt_mir-486-5p和mir-146a-5p和u6-r1合成cdna，制备得到的cdna用于后续qpcr实验。
[0042]
3、实时荧光定量pcr
[0043]
用2x master mix(ry_pcr0011，上海仁统公司)配制反应液，实时定量pcr仪(roche)进行pcr反应：聚合酶激活/变性，96℃，5min；(96℃，15s，72℃，20s)
×
5个循环；(96℃，15s，61℃，45s)
×
45个循环；收集荧光。
[0044]
4、数据分析和处理
[0045]
采用δδct方法进行数据分析和处理，包括如下步骤。
[0046]
1)计算每个处理组中的每个基因的δct
[0047]
δct(group 1)＝average ct
–
average of hk genes’ct for group 1array；
[0048]
δct(group 2)＝average ct
–
average of hk genes’ct for group 2array。
[0049]
2)计算2个pcr array(或两组)中每个基因的δδct
[0050]
δδct＝δct(对照组)-δct(实验组)，通过2-δδct
计算组2与组1对应基因的表达差异。
[0051]
以下实施例中，所有用于检测mir-146a-5p或mir-486-5p表达量的方法均采用本实施例的方法。
[0052]
实施例3、qpcr法检测自然流产女性外周血mir-146a-5p表达情况
[0053]
首先通过胚胎绒毛染色体检测，将早孕期自然流产女性(ab，n＝21例)的外周血样本分为胚胎染色正常(ab-n，n＝8例)和异常(ab-a，n＝13例)的两组。采集自然流产女性(ab)，以及孕周相同的人工流产女性(col，n＝20例)的外周血浆，采用qpcr方法检测其外周血中mir-486-5p的表达水平，结果如图1所示。对获得的数据进行roc分析，结果如图2所示。
[0054]
图1中，col表示对照组(n＝20例)，ab-a表示胚染异常流产组(n＝13例)，ab-n表示胚染正常流产组(n＝8例)；*：p《0.05，p《0.05显示有统计学差异。
[0055]
图1的结果显示，与人工流产女性对照组(col)相比，外周血中mir-486-5p的表达量在胚胎染色体正常的自然流产患者(ab-n)中显著降低(p《0.05)，而在胚胎染色体异常自然流产患者(ab-a)中则无显著差异(p》0.05)。
[0056]
图2与roc分析结果显示，mir-146a-5p作为流产的预测指标，取截断值为0.9401，预测敏感度为75％，特异性为75％。
[0057]
实验结论：在胚胎染色体正常的自然流产患者外周血中mir-146a-5p呈显著低表达，且mir-146a-5p可作为胚胎染色体正常的自然流产的预测指标。
[0058]
实施例4、qpcr法检测不同妊娠时期女性外周血mir-146a-5p表达变化情况随机采
集妊娠时期分别为8周(n＝8例)，12周(n＝8例)，15周(n＝8例)，18周(n＝8例)，以及22周(n＝8例)女性的外周血浆，采用qpcr方法检测其mir-146a-5p的表达水平，结果如图3和图4所示。其中，图3显示了不同妊娠时期的女性外周血中mir-146a-5p的表达量，图4显示了不同妊娠时期的女性外周血中mir-146a-5p的平均表达水平的变化情况。
[0059]
图3的结果显示，妊娠时期为18周的女性外周血中mir-146a-5p的表达量显著升高。
[0060]
图4的结果显示，妊娠时期为8周～18周的女性外周血中mir-146a-5p的平均表达量逐渐升高，其中15周～18周升高趋势较明显；而妊娠时期为18周～22周的女性外周血中mir-146a-5p的平均表达量开始降低，且降低趋势较明显。
[0061]
实验结论：随着孕周增加，妊娠女性外周血中mir-146a-5p表达水平呈先上升后下降的趋势。
[0062]
实施例5、qpcr法检测自然流产女性患者外周血mir-486-5p表达情况
[0063]
首先通过胚胎绒毛染色体检测，将早孕期自然流产女性(ab，n＝22例)的外周血样本分为胚胎染色正常(ab-n，n＝9例)和异常(ab-a，n＝13例)的两组。采集上述自然流产女性(ab)，以及孕周相同的人工流产女性(col，n＝20例)的外周血浆，采用qpcr的方法检测其外周血中mir-486-5p的表达水平，结果如图5所示。对获得的数据进行roc分析，结果如图6所示。
[0064]
图5中，col表示对照组(n＝20例)，ab-a表示胚染异常流产组(n＝13例)，ab-n表示胚染正常流产组(n＝9例)；*：p《0.05，**：p《0.01，p《0.01显示有统计学差异。
[0065]
图5的结果显示，与col组相比，ab-n组外周血浆mir-486-5p含量显著下降(p《0.01)，而ab-a组无显著差异(p》0.05)；与ab-a组相比，ab-n组外周血浆mir-486-5p含量也显著下降(p《0.01)。
[0066]
图6与roc分析结果显示，mir-486-5p作为胚胎染色体正常的自然流产的预测指标，其auc值为84.6％(95％置信区间：0.682-1.000，p＝0.007)，取截断值为0.6442，敏感度84.6％，特异性62.4％。
[0067]
实验结论：在胚胎染色体正常的自然流产患者外周血中mir-486-5p显著降低，且mir-146a-5p可作为胚胎染色体正常的自然流产的预测指标。
[0068]
实施例6、qpcr法检测复发性流产女性患者外周血mir-486-5p表达情况
[0069]
为了验证前期研究结果的重复性，本实施例重新采集了胚胎染色体正常的复发性流产女性患者(rm，n＝15例)，和孕周相匹配的自愿行人工流产的正常早孕期女性(col，n＝21例)外周血样本的外周血浆，采用qpcr的方法检测其外周血中mir-486-5p的表达水平，结果如图7所示。对获得的数据进行roc分析，结果如图8所示。
[0070]
图7中，col表示对照组(n＝21例)，rm表示胚胎染色体正常的复发性流产女性患者组(n＝15例)；*：p《0.05，p《0.05显示有统计学差异。
[0071]
图7的结果显示，与正常早孕期女性对照组相比，胚胎染色体正常的的rm患者外周血中mir-486-5p的表达量显著降低。
[0072]
图8与roc分析结果显示，mir-486-5p作为rm的预测指标，其auc值为76.0％(95％置信区间：0.598-0.923，p＝0.009)，取截断值为0.9274，预测敏感度76.2％，特异性73.3％。
[0073]
实验结论：在胚胎染色体正常的复发性流产患者外周血中mir-486-5p表达量显著降低，且mir-486-5p可作为复发性流产的预测指标。
[0074]
综上所述，mir-146a-5p和mir-486-5p的表达水平在胚胎染色体正常的自然流产女性中均显著降低，且mir-146a-5p的表达水平在正常妊娠女性中随着孕周增加呈先升后降的趋势，此外，mir-486-5p的表达水平在复发性流产女性中显著降低。因此，可将mir-486-5p和/或mir-146a-5p应用作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测指标，例如作为检测试剂或试剂盒的生物标志物，应用于临床检测中，并据此指导后续保胎治疗方案，改善母婴不良妊娠结局；此外，外周血浆中mir-146a-5p和/或mir-486-5p水平可能作为判断先兆流产女性中胚胎染色体正常与否的一个指标，为临床保胎治疗提供依据。由此可知，本发明新的mirna标志物——mir-146a-5p和/或mir-486-5p在作为诊断先兆流产疾病的生物标志物，以及作为判断胚胎染色体是否正常的指标方面都具有良好的开发和应用价值。
[0075]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

技术特征：
1.mir-146a-5p的应用，其特征在于，用于作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测标志物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述作为检测标志物是检测mir-146a-5p是否低表达。3.mir-486-5p的应用，其特征在于，用于作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测标志物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述作为检测标志物是检测mir-146a-5p是否低表达。5.一种用于预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒是以mir-146a-5p和/或mir-486-5p作为检测标志物。6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒是检测mir-146a-5p和/或mir-486-5p是否低表达。

技术总结
本发明公开了miR-146a-5p和/或miR-486-5p在作为预测或诊断非胚胎因素的先兆流产的检测标志物方面的应用。本发明为先兆流产的临床检测提供了新的生物标志物，并据此指导后续保胎治疗方案，改善母婴不良妊娠结局；此外，外周血浆miR-146a-5p和miR-486-5p水平可能作为判断自然流产风险女性中胚胎染色体是否正常的一个指标，为临床保胎治疗提供依据。因此，miR-146a-5p和/或miR-486-5p在先兆流产疾病中具有良好的临床应用价值。中具有良好的临床应用价值。


技术研发人员：张璇 顾艳 顾文文 杨龙 石燕 辛亚维 王健
受保护的技术使用者：天津医科大学第二医院
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/20