β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用

1.本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用。


背景技术：

2.兰花是世界知名的高档花卉，我国是兰花栽培历史最悠久，原生种数量最多的国家。种苗工厂化生产是我国优势种业领域，也是兰花产业的核心技术之一，直接影响兰花育种以及种苗生产的效益。兰花种苗工厂化繁殖始于大花蕙兰，且早在20世纪60年代就形成了“兰花工业”。但是，以墨兰为代表的国兰仍然是目前最难工厂化繁殖的兰花种类之一，迄今未能从根本上解决国兰根状茎芽分化难的问题，国兰根国兰种苗生产仍以分株繁殖为主，这严重制约了国兰产业化发展。
3.根状茎芽分化是国兰组织培养的关键环节，直接影响其组培快繁的效率和试管苗的质量。墨兰等国兰根状茎不仅增殖缓慢，芽、根分化效率也很低，并且根芽生长不协调。兰花根状茎上顶芽可不经中间的类原球茎或愈伤组织的阶段而直接形成轮廓分明的分生组织，并进一步形成具有叶原基和圆顶状的顶芽，同时节上产生不定根。根状茎的分化能力远低于类原球茎，通过较高的细胞分裂素与生长素比例可有效促进其芽分化。较高浓度的细胞分裂素能够有效提高墨兰等国兰根状茎的分化效率，但是细胞分裂素浓度过高会导致根发育异常，根芽生长不协调。
4.细胞分裂素和生长素是影响兰花根状茎组培快繁特性的重要因素之一。很多植物激素，如赤霉素、脱落酸、独脚金内酯和玉米素等属于萜类化合物。在自然界中，萜类化合物可经2-c-甲基-d-赤鲜糖醇-4-磷酸(mep)和甲羟戊酸(mva)途径合成。生物体可利用这两个途径合成萜类化合物的前体物质异戊烯焦磷酸(ipp)和烯丙基焦磷酸(dmapp)，随后形成不同链长的异戊二烯单元，后者进一步合成不同类型的萜类化合物。然而，根状茎离体培养过程中，内源激素的生物合成受阻，影响了根状茎的生长发育。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用。
6.本发明是通过以下技术方案实现：β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，将墨兰根状茎培养在含有β-金合欢烯(cas号为18794-84-8)分化培养基进行芽分化培养。
7.所述的根状茎芽分化培养基每升含有β-金合欢烯5-10微摩尔、6-苄氨基嘌呤(6-ba)0.5-1.0毫克、1-萘乙酸(naa)0.1-0.5毫克、蔗糖20-30克、琼脂粉5-7克，余量为ms培养基，ph值为5.4-6.0。
8.所述的β-金合欢烯的灭菌方法是：采用过滤灭菌方式对β-金合欢烯进行除菌处理，且最好是现用现配。
9.所述分化培养基除β-金合欢烯以外的成分经灭菌后于无菌操作台中添加经过滤灭菌的β-金合欢烯。在一个实施例中，所述的β-金合欢烯添加方法是：分化培养基其余成分经高温蒸汽灭菌，即121℃灭菌20分钟，待培养至冷却至50℃以下后于无菌操作台中添加经过滤灭菌的β-金合欢烯。
10.所述的分化培养方式为：将墨兰根状茎接种在分化培养基中后，首先在培养温度为8～10℃低温条件进行黑暗培养5-10天，然后转至培养温度为25℃，光照强度为1500-2000lx，光照长度为12小时/天，培养条件下培养30-40天。
11.所述的墨兰根状茎是指墨兰品种
‘
企剑白墨墨兰’长度为1-1.5厘米、具有茎尖的根状茎。
12.本发明将墨兰根状茎培养在含有β-金合欢烯成分的分化培养基中，有效提高墨兰根状茎的芽化分率，初步解决制约墨兰组织培养的瓶颈问题。
具体实施方式
13.下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
14.所述的ms为国际通用的培养基，其成分和配制方法可参考文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991)。
15.实施例1
16.将长度为1-1.5厘米、有茎尖的墨兰品种
‘
企剑白墨墨兰’根状茎分别培养在分化培养基1～3组别中，首先在培养温度为8℃进行黑暗培养5天，然后转至培养温度为25℃，光照强度为1500lx培养条件下培养30天后，在分化培养基1～3组别中培养的
‘
企剑白墨墨兰’根状茎芽分化率分别为59.4％、2.68％和30.7％。其中，分化培养基1的培养基成分为ms+5μmol/lβ-金合欢烯+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+20g/l蔗糖+5g/l琼脂，ph值为5.4；分化培养基2的培养基成分为ms+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+20g/l蔗糖+5g/l琼脂，ph值为5.4；分化培养基3的培养基成分为ms+3μmol/lβ-金合欢烯+0.5mg/l 6-ba +0.1mg/l naa+20g/l蔗糖+5g/l琼脂，ph值为5.4。
17.实施例2
18.将长度为1-1.5厘米、有茎尖的墨兰品种
‘
企剑白墨墨兰’根状茎分别培养在分化培养基4～5组别中，首先在培养温度为9℃进行黑暗培养7天，然后转至培养温度为25℃，光照强度为1700lx培养条件下培养35天后，在分化培养基4～5组别中培养的
‘
企剑白墨墨兰’根状茎芽分化率分别为62.7％和2.55％。其中，分化培养基4的培养基成分为ms+8μmol/lβ-金合欢烯+0.8mg/l 6-ba+0.3mg/l naa+25g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph值为5.8；分化培养基5的培养基成分为ms+0.8mg/l 6-ba+0.3mg/l naa+25g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph值为5.8。
19.实施例3
20.将长度为1-1.5厘米、有茎尖的墨兰品种
‘
企剑白墨墨兰’根状茎分别培养在分化培养基6～8组别中，首先在培养温度为10℃进行黑暗培养10天，然后转至培养温度为25℃，光照强度为2000lx培养条件下培养40天后，在分化培养基6～8组别中培养的
‘
企剑白墨墨兰’根状茎芽分化率分别为62.8％、4.04％和48.9％。其中，分化培养基6的培养基成分为ms+10μmol/lβ-金合欢烯+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为6.0；分
化培养基7的培养基成分为ms+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为6.0；分化培养基8的培养基成分为ms+15μmol/lβ-金合欢烯+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为6.0。
21.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，将墨兰中间繁殖体根状茎培养分化培养基进行芽分化培养，其特征在于，所述的分化培养基含有β-金合欢烯。2.根据权利要求1所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述的分化培养基每升含有β-金合欢烯5-10微摩尔、6-苄氨基嘌呤0.5-1.0毫克、1-萘乙酸0.1-0.5毫克、蔗糖20-30克、琼脂粉5-7克，余量为ms培养基，ph值为5.4-6.0。3.根据权利要求1所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述的β-金合欢烯灭菌方法是：采用过滤灭菌方式对β-金合欢烯进行除菌处理，且最好是现用现配。4.根据权利要求1所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述分化培养基中除β-金合欢烯以外的成分经高温灭菌后于无菌操作台中添加已过滤灭菌的β-金合欢烯。5.根据权利要求4所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述灭菌采用高温灭菌，即在121℃灭菌20分钟，此时待所述分化培养基冷却至50℃以下再于无菌操作台中添加经过滤灭菌的β-金合欢烯。6.根据权利要求1所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述的分化培养方式为：将墨兰根状茎接种在分化培养基中后，首先在培养温度为8～10℃低温条件进行黑暗培养5-10天，然后转至培养温度为25℃，光照强度为1500-2000lx，光照长度为12小时/天，培养条件下培养30-40天。7.根据权利要求1所述的β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用，其特征在于，所述的墨兰根状茎是指墨兰品种
‘
企剑白墨墨兰’长度为1-1.5厘米、具有茎尖的根状茎。

技术总结
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地说，涉及β-金合欢烯在墨兰根状茎芽分化培养中的应用。墨兰组织培养的中间繁殖体为根状茎，存在生长缓慢、不分化或难分化的问题，这严重制约了墨兰种苗工厂化生产。β-金合欢烯也称β-法尼烯，是倍半萜和三萜化合生物合成的前体，同时也是植物激素如细胞分裂素、玉米素、赤霉素和油菜素甾醇类激素生物合成的前体。根状茎离体培养过程中，内源激素的生物合成受阻，影响了根状茎的生长发育。本发明将墨兰根状茎培养在含有β-金合欢烯成分的分化培养基中，有效提高墨兰根状茎的芽化分率，初步解决制约墨兰组织培养的瓶颈问题。制约墨兰组织培养的瓶颈问题。


技术研发人员：赵仕花 杨业容 韦敏 潘洁明 方振名
受保护的技术使用者：玉林师范学院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/20