一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法及其应用

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.硝酸盐天然存在于植源性食物中，已有报道显示各类蔬菜受不同程度的硝酸盐污染，尤其是叶类蔬菜。硝酸盐本身无害或危害性较小，但是在发酵过程或在人体内均可被还原为对人体有害的亚硝酸盐，从而造成亚硝酸盐“二次危害”。利用硝酸盐还原酶降解硝酸盐具有专一高效等优点。目前已报道的硝酸盐还原酶主要来源于植物和细菌，在极端条件下应用受限。嗜盐古菌是一类通常栖息在晒盐场、天然盐湖、腌制品等高盐环境中的微生物，由于其栖息环境的特殊性，嗜盐古菌来源的酶类通常具有耐盐碱、耐高温、耐有机溶剂等特征。嗜盐古菌为寻找广盐性硝酸盐还原酶提供了很好的菌株资源。3.硝酸盐还原酶催化硝酸根还原为亚硝酸根。目前已发表的嗜盐古菌硝酸盐还原酶根据生理功能可分为同化型硝酸盐还原酶(nas)、异化型硝酸盐还原酶(nap)和呼吸型硝酸盐还原酶(nar)。nas位于细胞质内，便于收集纯化，成为应用领域关注的重点。nas可分为铁氧还蛋白或黄氧还蛋白依赖性nas和nadh依赖性nas。铁氧还蛋白依赖性nas主要为75～85kda的单聚体，nadh依赖性nas主要为异二聚体。4.嗜盐古菌来源的同化型硝酸盐还原酶仅在菌株haloferaxalexandrinus和haloferaxmediterranei中有报道，但是使用的纯化步骤繁琐、得率低。技术实现要素：5.本发明目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种简便的嗜盐古菌(halorariuslitoreus)硝酸盐还原酶(nas)制备方法及其在腌制蔬菜和污水处理中的应用，本发明所用的嗜盐古菌记为halorariuslitoreusbnd22t。本发明涉及的嗜盐古菌硝酸盐还原酶在高温、高盐、碱性等环境下均具有良好的稳定性；nas的纯化及性能检测为嗜盐古菌硝酸盐还原酶的应用提供基础，为降解腌制蔬菜和污水中的硝酸盐提供新型酶制剂。6.本发明的嗜盐古菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc1.18780；本发明基于嗜盐古菌(halorariuslitoreusbnd22t)的基因组获得一条新型的嗜盐古菌硝酸盐还原酶的基因命名为nashor，基于nashor编码的新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶命名为nashor，其核苷酸序列如seqidno.2所示，其氨基酸序列如seqidno.1所示。7.本发明涉及嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，具体包括以下步骤：8.(1)构建重组质粒pta04-nashor；9.基于嗜盐古菌(halorariuslitoreusbnd22t)的全基因组序列进行功能比对，获得一条嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因nashor；然后利用pcr技术扩增目的基因片段nashor；再通过分子克隆技术将nashor与pta04载体相连接，构建得到重组质粒pta04-nashor；10.0下均具有较好的ph稳定性。该酶对fe3+和k+具有良好的耐受性；乙醇、甘油和异丙醇对该酶活性具有不同程度的促进作用。当nano3为底物时，nashor的最大反应速率vmax为30.94μg/min/mg，动力学常数km为1.64mm。28.本发明的优点和技术效果：29.(1)本发明发现了一条新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因，表达出一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶，提出了一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法。相比已报道的嗜盐古菌硝酸盐还原酶制备方法，该方法纯化步骤更简单，获得的硝酸盐还原酶纯度更高。30.(2)nashor具有良好的酶学特性，对温度、盐度和ph均具有较优的广适性，对fe3+、k+、乙醇、甘油和异丙醇具有不同程度的耐受性。具有优良性状的新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶nashor可应用于腌制蔬菜、污水等硝酸盐的降解。附图说明31.图1为重组质粒双酶切验证图。32.图2为镍柱纯化后nashor的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。33.图3为温度对nashor催化活性的影响图。34.图4为nacl浓度对nashor催化活性的影响图。35.图5为ph对nashor催化活性的影响图。36.图6为nashor在不同温度下的稳定性。37.图7为nashor在不同nacl浓度下的稳定性。38.图8为nashor在不同ph下的稳定性。39.图9为不同有机溶剂对nashor催化活性的影响图。40.图10为不同金属离子对nashor催化活性的影响图。41.图11为nashor以硝酸盐为底物的酶动力学曲线图。具体实施方式42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。45.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。46.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。47.本发明的嗜盐古菌(halorariuslitoreusbnd22t)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cgmcc1.18780。48.原核生物宿主为haloferaxvolcanii，购买于日本微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为jcm8879。基于菌株haloferaxvolcanii，进行突变株的构建，最终获得尿嘧啶胸苷营养缺陷型突变株，记为haloferaxvolcaniih1424；其构建方法为公知，具体参考自：allerst,ngohp,mevarechm,etal.developmentofadditionalselectablemarkersforthehalophilicarchaeonhaloferaxvolcaniibasedontheleubandtrpagenes[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70(2):943-953.[0049]实施例1：[0050]嗜盐古菌硝酸盐还原酶nashor基因的克隆；[0051](1)目的基因的获取[0052]接种环蘸取菌体于30μlddh2o中，100℃下煮沸10min，获得dna模板，扩增目的基因，对琼脂糖凝胶电泳检测后的pcr产物进行切胶回收，并用dna凝胶回收试剂盒进行纯化。[0053]引物bnd22_2751-f-ecori：5’‑cgcgaattctccgagcgcacgaacgag-3’；[0054]bnd22_2751-r-bamhi：5’‑ataggatccgttgtcggcggcggcgac-3’。[0055]pcr扩增体系(25μl)：[0056][0057]pcr扩增程序：[0058][0059](2)目的基因和载体的酶切[0060]使用quickcuttmecori和bamhi(takara)两种限制酶对目的基因片段和pta04载体分别进行双酶切，酶切条件为37℃，30min。再次使用dna凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。[0061]酶切体系(100μl)：[0062][0063](3)构建重组质粒[0064]将步骤(2)纯化后的目的基因与pta04载体在16℃下连接1～2h。[0065]连接体系(10μl)：[0066][0067][0068](4)重组质粒转化escherichiacolidh5α[0069]将上述的10μl连接体系加入装有100μle.colidh5α感受态的1.5mlep管中，吹打均匀后置于冰水混合物中30min，再于42℃水浴锅中热激90s，取出后置于冰水混合物中2min，最后加入500μllb液体培养基并于摇床中振荡培养45min(37℃，180rpm)。培养完成后，6000rpm离心3min，弃去500μl上清液，剩余菌液吹打均匀后，涂布lb(含氨苄青霉素)琼脂平板，37℃培养箱中培养过夜(12～15h)。[0070](5)质粒的提取和验证[0071]将pcr验证正确的阳性转化子于3mllb(含氨苄青霉素)液体培养基中培养，使用质粒dna小量提取试剂盒提取质粒并酶切验证。验证体系同(1)所示，酶切条件同(2)。[0072]酶切体系(10μl)：[0073][0074]酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，为重组质粒双酶切验证图；图中泳道1、2表示示质粒双酶切结果，泳道m.代表dnamarker，构建成功的质粒于-20℃保存，用于后续实验。[0075]实施例2：[0076]嗜盐古菌硝酸盐还原酶nashor的异源表达；[0077]将菌株haloferaxvolcaniih1424接种于hv-ypc液体培养基(添加浓度为40μg/ml的胸腺嘧啶)，待生长至指数期将其制成原生质体，用peg介导转化法将重组质粒转入haloferaxvocaniih1424中培养一周左右，挑取淡红色转化子，并进行pcr验证。[0078]将pcr验证正确的阳性转化子接种于3mlhv-ypc液体培养基中，于37℃，180rpm培养3天，再以1％(v/v)接种量接种至200mlhv-ypc液体培养基中扩大培养，上述条件培养至稳定期后离心收集菌体，于-20℃保存。[0079]实施例3：[0080]嗜盐古菌硝酸盐还原酶nashor的纯化；[0081](1)在20ml细胞裂解液中重悬菌体后，超声破碎直至菌体透亮，离心收集上清用于后续纯化。[0082](2)流尽镍柱中的保存液体(20％乙醇)后依次用10倍柱床体积的ddh2o洗柱、10倍柱床体积的细胞裂解液平衡柱子。[0083](3)上清液过两遍层析柱(每次柱中停留10min)。[0084](4)用25ml缓冲液i洗去杂蛋白。[0085](5)用10ml缓冲液ii洗柱，每1ml洗脱液收集一管，于4℃保存；[0086]洗脱液进行sds-page分析和酶活测定。[0087]图2中泳道分别为泳道m.：蛋白预染marker；lane1：离心后的上清液；lane2：过完镍柱后的流出液；lane3：在40mm咪唑下洗脱的第5管；lanes4～9：在缓冲液ii下洗脱的第1、3、5、6、7、9管。[0088](6)依次分别用10倍柱床体积的缓冲液(1m咪唑，2mnacl，20mmtris-hcl，ph8.0)、10倍柱床体积的ddh2o清洗柱；最后将柱子浸泡在20％乙醇中，于4℃保存。[0089]实施例4：[0090]超滤浓缩；[0091]使用分子截留量为10kda的超滤管浓缩实施例3中得到的洗脱液至1ml，获得高纯度的嗜盐古菌硝酸盐还原酶，记为nashor。[0092]实施例5[0093]酶活测定；[0094](1)测定蛋白浓度[0095]使用bradford蛋白浓度测定试剂盒按照说明书测定蛋白浓度。[0096](2)测定酶活[0097]250μl反应体系中包括1mnacl、4mm甲基紫精(mv)、35mmnano3、17mmna2s2o4(溶于0.1mnahco3)、7μg酶和120mmna2co3/nahco3溶液(ph9.0)。实验组与对照组各设置三组，实验组加酶液(nashor)，对照组加等量的缓冲液，60℃水浴锅中反应20min后振荡器震荡1min终止反应。在反应体系中加入200μl10g/l磺胺，混匀反应4min；再加入200μl1g/l盐酸萘乙二胺，混匀避光条件下反应30min；540nm下测定od值。通过以下公式可计算出硝酸盐还原酶的酶活。[0098][0099]y：酶活力(u)[0100]x：酶反应后亚硝酸盐含量(mm)[0101]酶活力(u)定义为每分钟生成1μg亚硝酸盐所需酶量(μg/min)。[0102]比酶活(u/mg)定义为单位重量(mg)蛋白质具有的酶活力单位数(μg/min/mg)。[0103]结果显示，在60℃、1mnacl和ph9.0条件下测得的比酶活为25.14μg/min/mg。[0104]实施例6[0105]最适反应条件分析；[0106](1)最适反应温度在50～90℃范围中测定；[0107]设置反应温度为50、55、60、65、70、75、80、85、90℃，其余条件同实施例5，测定硝酸盐还原酶的酶活。结果显示，该酶最适反应温度为70℃(图3)。[0108](2)最适反应nacl浓度在0～4m范围中测定；[0109]反应体系中nacl终浓度为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0m，在最适温度、ph9.0下进行反应。测定硝酸盐还原酶在不同nacl浓度下的酶活。结果显示，该酶最适反应nacl浓度为2.0m(图4)。[0110](3)最适反应ph在6.0～10.5范围中测定；[0111]反应体系中分别加入ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5的0.1mna2hpo4/nah2po4缓冲液；ph7.5、ph8.0、ph8.5、ph9.0的50mmtris-hcl缓冲液；ph9.0、ph9.5、ph10.0、ph10.5的120mmna2co3/nahco3缓冲液，在最适反应温度和最适nacl浓度下进行反应。测定硝酸盐还原酶在不同ph下的酶活。结果显示，该酶最适反应ph为9.0(图5)。[0112]nashor的最适反应条件为70℃、2.0mnacl和ph9.0。[0113]实施例7：[0114]稳定性分析；[0115](1)nashor的热稳定性分析具体操作为：将酶液分别在30、50、70、90℃水浴锅中孵育0、30、60、90min。在最适反应温度、最适nacl浓度和最适ph下测定酶活。结果显示，该酶在30、50、70和90℃下，孵育90min，酶活基本无明显变化；并且发现该酶在70和90℃下孵育不同时长后，相对酶活有轻微增加的趋势，表明该酶有着良好的热稳定性(图6)。[0116](2)nashor的nacl稳定性分析具体操作为：将酶液分别加入到含0、2、4mnacl浓度的缓冲液中(缓冲液中ph为最适)，在室温下孵育0、30、60、90min。在最适反应温度下测定酶活。结果显示，该酶在2mnacl浓度下孵育0、30、60、90min仍能够保持较好的酶活；在0和4.0mnacl浓度下孵育时，该酶的相对酶活随时间的增长而表现出下降趋势。总得来说，该酶在0、2.0、4.0mnacl孵育0～90min，其相对酶活均保持在70％及以上，具有较好的nacl稳定性(图7)。[0117](3)nashor的ph稳定性分析具体操作为：将酶液加入至ph6.0(na2hpo4/nah2po4缓冲液)、ph8.0(tris-hcl缓冲液)、ph10.0(na2co3/nahco3缓冲液)的缓冲液中，在室温下孵育0、30、60、90min。在最适反应温度和最适nacl浓度下测定酶活。结果显示，该酶在ph8.0、10.0的缓冲液中孵育时，保持了较佳的酶活；在ph6.0的缓冲液孵育时，随着孵育时间的延长，相对酶活表现出下降趋势，最低值约为60％。相较于在ph6.0的条件下孵育，该酶在ph8.0和10.0的条件下孵育表现出更佳的稳定性(图8)。[0118]实施例8：[0119]对有机溶剂及金属离子的耐受性分析；[0120](1)有机溶剂耐受性分析具体操作为：在反应体系中分别添加15％(v/v)的有机溶剂：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甘油、异丙醇、dmso(二甲基亚砜)、dmf(n,n-二甲基甲酰胺)；表面活性剂：吐温20、吐温80、tritonx-100。[0121]在最适反应温度、nacl浓度、ph下测定酶活。结果显示，乙醇、甘油和异丙醇对该酶具有不同程度的促进作用，乙醇和甘油的促进作用最为突出；甲醇、乙腈、丙酮、dmso、dmf、吐温20、吐温80和tritonx-100对该酶表现出不同程度的抑制作用，其中dmf、吐温20、吐温80和tritonx-100对该酶的抑制率达到了80％以上，丙酮的抑制率最低，约为20％(图9)。[0122](2)金属离子耐受性分析具体操作为：在反应体系中加入终浓度为5mm的ca2+、sr2+、zn2+、fe3+、k+、cu2+、ni+、mg2+、ba2+。在最适反应温度、nacl浓度、ph下测定酶活。[0123]图10为不同金属离子对nashor催化活性的影响图；[0124]结果显示，fe3+和k+对该酶具有促进作用；其余7种金属离子对该酶有着不同程度的抑制作用；其中ni2+和ba2+的抑制作用最强，抑制率约为60％左右，ca2+、sr2+和zn2+的抑制率约为40％。这些表明该酶在一定程度上对金属离子有着较优的耐受性。[0125]实施例9：[0126]酶动力学参数；[0127]在反应体系中以nano3为底物，浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40mm，在最适反应温度、nacl浓度、ph下测定酶活。[0128]图11为nashor以硝酸盐为底物的酶动力学曲线图；[0129]利用origin2015软件构建酶动力学曲线，从中可知该酶的vmax值为30.94μg/min/mg，km值为1.64mm(图11)。[0130]说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。[0131]nashor氨基酸序列：seqidno.1[0132]msertnepresvcpfcgvgcgltydaergkgvgwrgavntrgelcpkgvaafehvdhadrlrtpliredgalreatwdealdrietafgeaiarhgpdaafffasskctneanyvvqklaralgtnnvdncarlchastvaamaerfgagamtnslrdlteadvflvaganpavnhpvifrsyllpalkagtelihldpratattdaathhlpvrpgfdipllnamaavvveeglvdeafvrerttgfealrafldevdvdaaaeqtgvdaetlrtaarsygsadraaiftgmglsqhhcgtdnvhallnlalltgnvgtrgagvnplrgqnnvqgagdvgalpdrlpggriddpathercatewgfdvpttpglteveathrfgedvrvayvfgenpavtepnvsrvreklasldclvvhdvvrsetvefadvvlpggtwaetdgtvtntdrqvqrmramadppgdarrdldvlgavaerlvgegfacdgpeavfeeltrvsatyagmsydgigtgsqrwpfpegategtavlhegtfasgsttadlrivehvdpvdpvgddelvlttgrilehynsgaltrrsgtlvrlrgtdalqihpgdaarrgiedgdrvrvandrgmvelaaevtpgvrsgtvfctfhfadplvntltgdtldpvakippfkhsavrvtvaaadn[0133]nashor核苷酸序列：seqidno.2[0134]atgtccgagcgcacgaacgagccacgggagagcgtctgtccgttctgcggcgtggggtgtgggttgacgtacgacgccgagcgcgggaaaggcgtgggctggcggggtgcggtcaacacccgcggcgaactctgtccgaagggggtcgccgccttcgaacacgtcgaccacgccgaccggctgaggacgcccctgatccgcgaggacggtgcgttgcgcgaggcgacgtgggacgaggcgctcgaccgcatcgagaccgcgttcggcgaggctatcgctcggcacggcccggatgcggcgttcttcttcgcctcctcgaagtgcacgaacgaggcgaactacgtcgtacagaagctcgcgcgggcgctcgggacgaacaacgtcgacaactgcgcacggctctgtcacgcctcgacggtggcggcgatggccgagcggttcggcgcgggagcgatgacgaactcgctgcgcgacctcaccgaggccgacgtgttcctcgtcgccggggcgaaccccgcggtgaaccacccggtgatcttccggtcgtatctgttacctgcgttgaaagcgggcaccgagttgattcacctcgatccgcgggcgaccgcgacgaccgacgccgcgacccaccacctcccggtgcgcccagggttcgacatccccctgctcaacgcgatggctgccgtcgtggtcgaggaggggctcgttgacgaagcgttcgtccgcgagcgaacgaccgggttcgaggcgctacgtgcgttcctcgatgaggtggacgtggatgccgcagccgagcagacaggcgtcgacgccgagacgcttcggacagccgcgcgcagctacggttcggccgaccgcgcggctatcttcacggggatgggcctctcgcagcaccactgcggcaccgacaacgtccacgccctgctcaacctcgcgttgttgaccggcaacgtcgggacgcgcggagctggcgtgaacccacttcggggacagaacaacgtgcagggcgccggtgacgtgggagcgctccccgaccgactcccgggtgggcgcatcgacgacccggctacgcacgaacgctgcgcgacggagtgggggttcgacgtgcccacgaccccagggctgacggaggtggaggcgacccaccgcttcggtgaggacgtgcgcgtggcgtacgtgttcggggagaacccagccgtcaccgagccgaacgtctctcgcgtgcgagagaagttggcgagtctggactgtctcgtcgtccacgacgtggtgcgctcggagacggtcgagtttgcggacgtcgtcctgccgggaggcacgtgggcggagacggacgggacggtgaccaacaccgaccgacaggtccagcggatgcgggcgatggccgacccgcccggcgacgcccggcgcgacctcgacgtactgggtgcagtcgccgagcgactcgtgggcgagggatttgcgtgcgacggccccgaggcagtgttcgaggagctgacccgagtgtccgcgacgtacgccgggatgagctacgacggcatcgggaccgggagccagcggtggccgtttcccgagggtgccaccgaggggacggccgtgctccacgagggcacgttcgcttcggggtcgaccacggcggacctccgcatcgtcgagcacgtcgacccggtcgaccccgtcggcgacgacgaactcgtgctcaccaccggtcggatactcgaacactacaacagcggggcgctcacccgccggtcggggacgctcgtccggcttcggggcacagacgcgctccagatacacccgggggatgcggcacgacgaggtatcgaggacggcgaccgcgtccgggtggcaaacgaccggggcatggtcgaactggcggccgaggtgacgccgggggtccgctcaggcaccgtcttctgcacgttccacttcgccgacccgctggtgaacacgctcacgggcgacacgctcgacccggtggcgaagattcccccgttcaaacacagcgcggtccgggtgaccgtcgccgccgccgacaac当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建重组质粒pta04-nas
hor
；基于嗜盐古菌(halorarius litoreus bnd22
t
)的全基因组序列进行功能比对，获得一条嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因nas
hor
；然后利用pcr技术扩增目的基因片段nas
hor
；再通过分子克隆技术将nas
hor
与pta04载体相连接，构建得到重组质粒pta04-nas
hor
；(2)重组质粒pta04-nas
hor
转化原核生物宿主并表达；将步骤(1)构建的重组质粒pta04-nas
hor
转化原核生物宿主，得到重组细胞接种于hv-ypc液体培养基中，培养至生长稳定期后进一步离心收集菌体，保存备用；(3)嗜盐古菌硝酸盐还原酶的纯化；收集步骤(2)的菌体于细胞裂解液中重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，使用镍柱亲和层析进行纯化，随后通过超滤浓缩酶液，获得高纯度的嗜盐古菌硝酸盐还原酶，记为nas
hor
；其核苷酸序列为seq id no.2所示，其氨基酸序列为seq id no.1。2.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的嗜盐古菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cgmcc 1.18780。3.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述原核生物宿主是基于菌株haloferax volcanii，进行突变株的构建，最终获得尿嘧啶胸苷营养缺陷型突变株，记为haloferax volcanii h1424；所述haloferax volcanii，购自日本微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为jcm 8879。4.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述hv-ypc培养基成分为，以每升计算：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，kcl 4.2g，mgso4·
7h2o 33.0g，mgcl2·
6h2o 30.0g，nacl 144.0g，1m、ph 8.0tris-hcl 12.0ml，cacl
2 0.33g，上述组分用蒸馏水定容至1l，调节ph至7.5，115℃灭菌30min。5.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养的条件为37℃，200rpm，培养3～4天。6.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的保存为低温保存，温度为-20℃。7.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞裂解液成分为2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0。8.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述镍柱亲和层析纯化的步骤为：将保存于镍柱中的体积分数为20％的乙醇流尽，用10倍柱床体积ddh2o洗柱，再用10倍柱床体积的细胞裂解液平衡柱子；将离心收集的上清液流进镍柱，静置10min；用10倍柱床体积的缓冲液i洗脱杂蛋白；用5倍柱床体积的缓冲液ⅱ洗脱目的蛋白；所述缓冲液i的成分为40mm咪唑，2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0；所述缓冲液ii的成分为100mm咪唑，2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0。9.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中超滤是使用截留分子量为10kda的超滤离心管浓缩。10.根据权利要求1～9任意一项所述方法制备的新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶应用于腌
制蔬菜及污水中硝酸盐降解的用途。

技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法及其应用；步骤为：将构建的重组质粒pTA04-nas


技术研发人员：崔恒林 伍章萍 侯靖
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/7/20