一种双靶向/载药肿瘤还原敏感型纳米载体及其应用

1.本发明属于生物医药和纳米医学技术领域，特别是一种双靶向低毒性的多功能响应纳米载体。


背景技术：

2.乳腺癌是全球公认的公共卫生问题之一，严重威胁着全球女性的身心健康。与人乳腺癌类似，犬作为人类的伴侣动物，由于与人类生活在同一环境下，能接触到相同的致癌因素，犬乳腺癌也是母犬最为常见的恶性肿瘤，是犬类中诊断率第二高的癌症，平均发病率可高达25%~42%，在未绝育的母犬中发病率甚至可高达50%至70%，是人类乳腺肿瘤恶性率的3倍，并且这一比例随着年龄的增长而增加。
3.与人乳腺癌类似，犬乳腺癌发病率极高，并且治愈率不高。耐药是其治疗失败的主要原因之一。因为治疗产生的获得性耐药是化疗耐药的主要类型，这导致后续给药的效果下降，双药联合被认为可以减少因为获得性耐药导致的敏感性下降。此外，以肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, cafs）为代表的肿瘤相关基质细胞，通过分泌丙氨酸作为肿瘤细胞三羧酸循环的营养供给等多种机制促进肿瘤细胞存活，导致化疗敏感性下降，并且促进肿瘤的生长和转移。因此，开发cafs和肿瘤细胞双靶向，双载化疗药物的纳米载体对于克服耐药有重要意义。
4.本发明针对目前临床中肿瘤耐药的问题，合成制备一种双靶向/载药的肿瘤还原敏感型纳米载体，应用于乳腺癌，特别是犬乳腺癌的治疗。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：针对目前临床中乳腺肿瘤耐药的问题，提供一种有治疗潜力的双靶向/载药的还原敏感型纳米载体。
6.本发明基于现有背景，创造性地合成了一种未报道的聚合物长链，首先选择具有亲水端聚乙二醇和疏水端聚己内酯的聚合物胶束作为药物载体来改善药物水溶性差的问题；再利用血管紧张素ii型受体(at1r)配体替米沙坦(tel)同时靶向过表达at1r的cafs和肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞和cafs以克服cafs诱导的耐药性；同时以二硫键来响应肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽(gsh)以实现药物在细胞内的精准控制释放。该材料实现了难溶性药物增溶、肿瘤和cafs双靶向及逆转肿瘤细胞因cafs导致的耐药的治疗效果，该材料可以同时实现良好的生物相容性和肿瘤靶向，表现出对肿瘤细胞较高的靶向性以及杀伤作用。同时本发明从细胞和动物两个水平，体外体内两个层面验证其抗肿瘤作用，以期为犬乳腺癌的治疗提供理论依据，也为人乳腺癌的治疗提供新的思路。
7.为了实现该方案，本发明的技术方案为：一种靶向配体，对肿瘤组织具有双靶向的还原响应型载体，其结构式如式所示 （图1）：其中n≥2，m≥2；式所述的化合物为tel-peg-ss-pcl（tpsp），所述的嵌段聚合物，其中n≥2，m≥2，
进一步优选为m在30-70、n在50-80范围内。将tpsp粉末和药物共同溶解四氢呋喃 (thf) 中，在高速搅拌下将其加入thf溶液中，加毕后，减慢搅拌速度。待thf 完全挥发完之后，即获得载药胶束溶液。将其全部转移到透析袋中(截留分子量为 1000)，用蒸馏水透析48 小时，去除未载入的药物后，经冷冻干燥获得一种双靶向/载药的肿瘤还原敏感型纳米载体。tpsp胶束粒径分布范围为100-140 nm，分散较为均一，为类球形结构的胶束。该胶束为核壳结构，亲水端为带有靶向基团tel的peg，疏水端为pcl，可实现肿瘤细胞和cafs靶向，并快速响应肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽(gsh)以实现药物在细胞内的精准控制释放。
8.本发明创造性地利用at1r配体替米沙坦与过表达at1r的肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤细胞的高亲和力，实现聚合物胶束的靶向性，当药物进入肿瘤细胞后，载体又可以利用二硫键来响应肿瘤细胞内高浓度gsh以实现药物在细胞内的精准控制释放，从而加强化疗药物的治疗效果。
9.本发明载体可以将化疗药物如dox等、天然抗肿瘤化合物乌头碱亚油酸酯等包裹于纳米载体中，尤其适合于水溶性较差、副作用大的药物，载体将抗肿瘤药物包载于聚合物的疏水内核中，增加药物的水溶性和生物利用度。当药物在血液循环中，不容易泄露，同时对肿瘤细胞有良好的靶向作用，可减少了抗肿瘤药物的毒副作用。
10.所述的双靶向低毒性肿瘤微环境响应型纳米载体的制备方法，包括如下步骤：1）单保护1，3-丙二胺的合成 (boc-nh-nh2)取10-100份1,3-丙二胺溶于甲醇中，冰浴条件下，滴入1-10份boc2o的甲醇溶液中，室温反应12-36 h。反应结束后，减压浓缩回收溶剂，产物用乙酸乙酯溶解后，减压回收溶剂，残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用 (石油醚：乙酸乙酯=1：2) 进行萃取除掉双保护产物，萃取后分离出水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取出单保护1,3-丙二胺 （图2）。
11.2） 单保护丙二胺-替米沙坦的合成 (tel-nh-boc)取1-5份替米沙坦、3-15份 edci、1-6份nhs及适量三乙胺，溶于二氯甲烷中，于冰浴下加入1-5份 boc-丙二胺二氯甲烷溶液，缓慢升温至30-50 ℃反应24-60 h。反应完毕后，分离有机相并减压回收溶剂，产物经快速硅胶色谱纯化，真空干燥得单保护丙二胺-替米沙坦 （图3）。
12.3）单保护胱胺的合成 (boc-nh-ss-nh2)取1-5份胱胺二盐酸盐和3-15份三乙胺溶于甲醇中，冰浴条件下，将1-5份boc酸酐的甲醇溶液滴入其中，室温反应12-36 h。反应完毕后，减压回收溶剂后，产物用乙酸乙酯溶解后，回收溶剂，于残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用 (石油醚：乙酸乙酯=1：1) 进行萃取，除去双保护产物后，收集水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂后，真空干燥得单保护胱胺 （图4）。
13.4）单保护胱胺-聚己内酯的合成(boc-ss-nh
2-pcl)取1-5份boc-ss-nh2，30-300份ε-己内酯，催化量辛酸亚锡，氮气保护下，100-150 ℃反应3-10 h。反应终止后，加入少量二氯甲烷溶解产物至糊状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤干燥得到单保护胱胺-聚己内酯 (图5)。
14.其中n≥2。
15.5）双边羧基化聚乙二醇的合成(cooh-peg-cooh)
将1-5份peg
2000
和4-20份琥珀酸酐溶于干燥二氯甲烷中，于50-80℃下回流反应。反应完毕后，减压回收有机相，用少量二氯甲烷溶解产物至粘稠状，将其滴入大量冰乙醚中沉淀，过滤干燥得双边羧基化聚乙二醇（图6）。
16.其中m≥2。
17.6）聚乙二醇-胱胺-己内酯的合成 (cooh-peg-ss-pcl，psp)取1-5份boc-ss-nh-pcl溶于dcm:tfa (v:v , 10 : 1)中室温下搅拌反应，直至boc完全脱下，减压回收溶剂，残余物溶于二氯甲烷，加入适量三乙胺；同时1-5份cooh-peg-cooh、1-5份edci、1-5份nhs溶于干燥二氯甲烷中，加入适量三乙胺；于冰浴下混合上述两种溶液，于至25-40 ℃反应。反应结束后，分离出有机相，减压回收有机溶剂，用少量二氯甲烷溶解至粘稠状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，反复溶解、沉淀至cooh-peg-cooh除尽，真空干燥得聚乙二醇-胱胺-己内酯(psp)（图7）。
18.其中n≥2，m≥2。
19.7）tel-peg-ss-pcl的合成取1-5份cooh-peg-ss-pcl、 3-15份edci、10-15份nhs、适量三乙胺，溶于二氯甲烷中备用。另取1-5份tel-nh
2-boc溶于dcm:tfa=(v:v , 10 : 1)，室温下反应至boc完全脱除以暴露氨基后，减压回收有机溶剂后，用二氯甲烷重新溶解。将其加入上述cooh-peg-ss-pcl溶液，升温至20-40 ℃反应，反应完毕后，分离出有机相，减压回收溶剂，并用少量二氯甲烷溶解至粘稠状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤，真空干燥得聚合物tel-peg-ss-pcl(tpsp)（如图1）。
20.作为上述技术方案的进一步改进，所述的合成步骤优选条件如下：所述步骤1）中所述的1,3-丙二胺：boc2o的投料比是10:1，反应温度为25℃，反应时间为24h。
21.所述步骤2）中替米沙坦：edci：nhs：boc 的投料比 1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度30 ℃，反应时间为48 h。
22.所述步骤3）中胱胺二盐酸盐：三乙胺：boc酸酐的投料量为1:3:1，反应温度为25℃，反应时间为24h。
23.所述步骤4）中boc-ss-nh2：ε-己内酯的投料量为1:65，辛酸亚锡加入量为反应体系的千分之五，反应温度为140 ℃，反应时间为6 h。
24.所述步骤5）中peg
2000
：琥珀酸酐的投料量为1:5，反应温度为50 ℃，反应时间为24 h。
25.所述步骤6）中boc-ss-nh-pcl：cooh-peg-cooh：edci：tel-nh
2-boc的投料量为1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度为30 ℃，反应时间为48 h。
26.所述步骤7）中cooh-peg-ss-pcl：edci：edci：nhs的投料量为1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度为30 ℃，反应时间为72h。
27.tel-peg-ss-pcl合成路线见图8：本发明的工作机理：药物与嵌段聚合物tel-peg-ss-pcl制备成胶束，在该胶束包裹疏水性药物形成胶束的疏水性内核。当载药胶束进入肿瘤后，利用peg端链接的at1r配体替米沙坦与过表达at1r的cafs和肿瘤细胞的高亲和力，实现靶向性，增强肿瘤细胞和cafs对纳米载体的内吞
作用。载药纳米载体进入肿瘤细胞后，以二硫键来响应肿瘤细胞内高浓度gsh以实现药物在细胞内的精准控制释放，以增强抗肿瘤药物的治疗效果。
28.有益效果：该抗肿瘤双靶向纳米载体，实现了难溶性药物增溶作用；双载药，同时实现肿瘤细胞和cafs的双靶向，逆转肿瘤细胞耐药；载药系统具有响应性释放能力，在还原条件下可实现刺激响应释放，在细胞和动物两个水平均有较好的靶向作用以及杀伤作用。
29.通过本专利采用较少的合成步骤，较温和的反应条件制备了聚合物长链，合成的聚合物长链可以容易地制备胶束，制备工艺简单。制备的聚合物胶束具有较好的肿瘤靶向性和肿瘤微环境响应性精准控制释放。
30.附图说明
31.图1双靶向聚合物tel-peg-ss-pcl结构。
32.图2单保护1，3-丙二胺结构。
33.图3单保护丙二胺-替米沙坦结构。
34.图4单保护胱胺结构。
35.图5单保护胱胺-聚己内酯结构。
36.图6双边羧基化聚乙二醇结构。
37.图7聚乙二醇-胱胺-己内酯结构。
38.图8tel-peg-ss-pcl合成路线图。
39.图9聚乙二醇-胱胺-己内酯的1hnmr(cdcl3)。
40.图10tel-peg-ss-pcl的1hnmr(cdcl3)。
41.图11合成材料及其中间体红外图谱。
42.图12合成材料及中间体紫外图谱。
43.图13合成材料及中间体gpc图谱。
44.图14聚合物分子量及分布。
45.图15载药胶束透射电镜结果图。
46.图16载药胶束dox+l29@tpsp在pbs和dmem(10%fbs)中的粒径变化。
47.图17dox+l29@tpsp胶束的体外累积释放曲线a)dox累积释放曲线b)l29累积释放曲线。
48.图18dox以及不同载dox胶束与cafs细胞培养1h后的荧光半定量分析。
49.图19dox以及不同载dox胶束与cmt-7364细胞培养1h后的荧光半定量分析。
50.图20dox以及不同载dox胶束与adr/mcf-7细胞培养1h后的荧光半定量分析。
51.图21双药胶束dox+l29@psp和dox+l29@tpsp对a)nih/3t3细胞和b)cafs的细胞毒性。
52.图22共培养前,裸药单/双药以及双药胶束对cmt-7364细胞和adr/mcf-7细胞的ic
50
和药物协同指数ci。
53.图23共培养后,裸药单/双药以及双药胶束对cmt-7364细胞和adr/mcf-7细胞的ic
50
和药物协同指数ci。
54.图24 裸双药dox+l29以及双药胶束dox+l29@psp和dox+l29@tpsp对a) cmt-7364细胞和b) adr/mcf-7的细胞毒性。
55.图25 各治疗组小鼠21 day y肿瘤的体积变化。
56.图26 各治疗组小鼠第 21 day解剖后离体肿瘤的重量。
57.图27 各治疗组小鼠肿瘤生长抑制率( tgi )。
58.图28 各治疗组小鼠0-21day体重变化。
59.具体实施方案：为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
60.实施例1：1）单保护1，3-丙二胺的合成取10份1,3-丙二胺溶于甲醇中，冰浴条件下，滴入1份boc2o的甲醇溶液中，25℃反应24 h。反应结束后，减压浓缩回收溶剂，产物用乙酸乙酯溶解后，减压回收溶剂，残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用 (石油醚：乙酸乙酯=1：2) 进行萃取除掉双保护产物，萃取后分离出水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取出单保护1,3-丙二胺。
61.2） 单保护丙二胺-替米沙坦的合成 (tel-nh-boc)取1份替米沙坦、3份 edci、1份nhs及1%三乙胺，溶于二氯甲烷中，于冰浴下加入1份 boc-丙二胺二氯甲烷溶液，缓慢升温至30 ℃反应48 h。反应完毕后，分离有机相并减压回收溶剂，产物经快速硅胶色谱纯化，真空干燥得单保护丙二胺-替米沙坦。
62.3）单保护胱胺的合成 (boc-nh-ss-nh2)取1份胱胺二盐酸盐和3份三乙胺溶于甲醇中，冰浴条件下，将1份boc酸酐的甲醇溶液滴入其中，25 ℃反应24 h。反应完毕后，减压回收溶剂后，产物用乙酸乙酯溶解后，回收溶剂，于残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用 (石油醚：乙酸乙酯=1：1) 进行萃取，除去双保护产物后，收集水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂后，真空干燥得单保护胱胺。
63.4）单保护胱胺-聚己内酯的合成(boc-ss-nh
2-pcl)取1份boc-ss-nh2，65份ε-己内酯，千分之五辛酸亚锡，氮气保护下，140 ℃反应6 h。反应终止后，加入少量二氯甲烷溶解产物至糊状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤干燥得到单保护胱胺-聚己内酯。
64.5）双边羧基化聚乙二醇的合成(cooh-peg-cooh)将1份peg
2000
和5份琥珀酸酐溶于干燥二氯甲烷中，于50℃下回流反应24h。反应完毕后，减压回收有机相，用少量二氯甲烷溶解产物至粘稠状，将其滴入大量冰乙醚中沉淀，过滤干燥得双边羧基化聚乙二醇。
65.6）聚乙二醇-胱胺-己内酯的合成 (cooh-peg-ss-pcl，psp)取1份boc-ss-nh-pcl溶于dcm:tfa (v:v , 10 : 1)中室温下搅拌反应，直至boc完全脱下，减压回收溶剂，残余物溶于二氯甲烷，加入适量三乙胺；同时3份cooh-peg-cooh、1份edci、1份nhs溶于干燥二氯甲烷中，加入1%三乙胺；于冰浴下混合上述两种溶液，于至30 ℃反应48h。反应结束后，分离出有机相，减压回收有机溶剂，用少量二氯甲烷溶解至粘稠
状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，反复溶解、沉淀至cooh-peg-cooh除尽，真空干燥得聚乙二醇-胱胺-己内酯(psp)。
66.7）tel-peg-ss-pcl的合成取1份cooh-peg-ss-pcl、 3份edci、1份nhs、1%三乙胺，溶于二氯甲烷中备用。另取1份tel-nh
2-boc溶于dcm:tfa=(v:v , 10 : 1)，室温下反应至boc完全脱除以暴露氨基后，减压回收有机溶剂后，用二氯甲烷重新溶解。将其加入上述cooh-peg-ss-pcl溶液，升温至30 ℃反应 72h，反应完毕后，分离出有机相，减压回收溶剂，并用少量二氯甲烷溶解至粘稠状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤，真空干燥得聚合物tel-peg-ss-pcl(tpsp)，结构式如图1所示。
67.本实施例中m=50, n=68。m和n的大小及比例会影响聚合物的溶解度和聚合物胶束的载药能力，本发明实例中亲疏水端比例约为1：3。
68.8）合成材料的表征a.合成材料及中间体的核磁氢谱解析 聚乙二醇-胱胺-己内酯图9为聚乙二醇-胱胺-己内酯(cooh-peg-ss-pcl) 的核磁氢谱1h nmr (600 mhz, cdcl3): δ 4.24(m, ha)，δ4.06(t, j= 6.6 hz, hj)，δ3.64 (m, hb, hc)，δ3.56 (m, h
l
)，δ3.52 (m, hf)，δ2.82 (m, hg)，δ2.62 (m, h
e,
hd)，δ2.30 (t, j= 7.2 hz, hh)，δ1.64 (m, hk)，δ1.39 (m, hi)。羧基化peg以及二硫键周围的质子峰出现，提示cooh-peg-ss-pcl的成功合成。
[0069] tel-peg-ss-pcl图10为tel-peg-ss-pcl的核磁氢谱。
[0070]1h nmr (600 mhz, cdcl3): δ 7.60-6.50 (m, tel-ar-h), δ4.06(t, j= 6.6 hz, hj)，δ3.65 (m, hc)，δ2.31 (t, j= 7.2 hz, hh)，δ1.65 (m, hk)，δ1.39 (m, hi)。化学位移为δ4.06、δ2.31、δ1.65、δ1.39为pcl的代表峰，δ3.65为peg的代表峰，低场中δ(7.60-6.50) 范围内存在tel上的氢质子峰，证明了tel的成功连接。
[0071]
b. 合成材料及中间体红外图谱解析cooh-peg-cooh、boc-nh-ss-nh-pcl以及tel-peg-ss-pcl的红外光谱如图11所示，羧基化peg的cooh中o-h伸缩振动峰在3500 cm-1
， ch2伸缩振动峰在2865cm-1
，羰基伸缩振动峰在1725 cm-1
，c-o-c伸缩振动峰在1107 cm-1
。
[0072]
boc-nh-ss-pcl中则出现了n-h伸缩振动峰3300 cm-1
，羰基伸缩振动峰1725 cm-1
，酰胺峰1541 cm-1
， pcl特征的c-h伸缩振动峰2945 cm-1
、2865 cm-1
，以及c-s峰732 cm-1
。
[0073]
tel-peg-ss-pcl中同时具有上述两个中间体的特征峰，包括cooh中o-h伸缩振动峰在3400 cm-1
，ch2伸缩振动峰在2945 cm-1
、2865 cm-1
，羰基伸缩振动峰1725 cm-1
，酰胺峰1541 cm-1
，以及c-s峰732 cm-1
。由于tel在整个分子中占比较低，其芳香骨架信号未观察到。
[0074]
c. 合成材料及中间体紫外图谱解析图12为聚合物peg-ss-pcl和tel-peg-ss-pcl的紫外吸收图谱，其中250nm-340nm波段为tel结构中苯环的特征紫外吸收峰，也证明tel被成功连接至聚合物材料上。
[0075]
d. 合成材料及中间体gpc图谱解析
gpc测试结果如图13-14显示，tel-peg-ss-pcl数均分子量mn为4799，重均分子量mw为8566。
[0076]
实施例2：合成载体材料制备胶束使用溶剂挥发法制备胶束，首先称取 10 mg 的peg-ss-pcl或 tel-peg-ss-pcl 共聚物粉末，将其全部溶解于 5 ml 的四氢呋喃 (thf) 中，作为油相。再用一次性注射器将材料混合溶液逐滴滴入 10ml 蒸馏水中，并伴随高速搅拌。待 thf 完全挥干后，即可获得空白胶束psp和tpsp。此外，载阿霉素（dox）和乌头碱亚油酸酯(l29)的双药胶束的制备过程与上述空白胶束的制备过程相似。不同的是，首先将盐酸阿霉素dox
·
hcl溶解在thf溶液中，然后向其中加入几滴三乙胺，避光搅拌30 min，随后吸取上清液向其中加入l29以及共聚物，搅拌溶解后，在高速搅拌下将其加入thf溶液中，加毕后，减慢搅拌速度。 待thf 完全挥发完之后，即获得的载药胶束溶液。将其全部转移到透析袋中(截留分子量为 1000)，用蒸馏水透析48 小时，去除未载入的 dox以及l29后，经冷冻干燥获得载药胶束dox+l29@psp，dox+l29@tpsp。
[0077]
图15为溶剂挥发法制备的胶束，由纳米激光粒度仪测定结果可知，制备的胶束有较为合适的大小尺寸以及均一性，能通过epr效应富集在肿瘤组织周围。当在接枝tel基团后，载药胶束电位由-34.83mv上升为-23.47 mv，这是因为该基团能中和peg末端负电荷，同时在包载进两种药物后，胶束的粒径均有一定程度增加，也说明了药物可能成功装载。dox+l29@psp胶束的粒径大约在130 nm左右，dox+l29@tpsp胶束的粒径大约在140 nm左右，粒径分散良好，可以直观的看见该胶束呈类球形，与dls数据基本符合。
[0078]
经hplc测定可知，dox在psp和tpsp胶束的载药量分别为1.12
ꢀ±ꢀ
0.01%和1.05
ꢀ±ꢀ
0.01%，对应的包封率分别为9.7
ꢀ±ꢀ
0.07%和9.15
ꢀ±ꢀ
0.05%。而l29在psp和tpsp胶束的载药量分别为12.1
ꢀ±ꢀ
0.18%和13.93
ꢀ±ꢀ
0.04%，对应的包封率分别为75
ꢀ±ꢀ
1.09%和86.36
ꢀ±ꢀ
0.27%。
[0079]
为考察载药胶束稳定性，将载药胶束 dox+l29@tpsp在pbs和含有 10% fbs 的dmem中，在 0 h、24 h、48 h 和 72 h 四个时间点通过 dls 检测其粒径发现均没有明显的变化，粒径仍保持在140 nm左右，表明载药胶束dox+l29@tpsp能保持良好的稳定性 (图16)。
[0080]
为确定两种药物的体外释放情况，分别测试其在ph 7.4 10 μm gsh (模拟正常血管内血液环境)和ph 6.810 μm gsh、ph 6.8 10 mm gsh (模拟肿瘤细胞内外微环境)中的药物释放曲线 （图17）。谷胱甘肽的巯基基团会进攻二硫键使得其断裂，从而释放出药物。从图17中可以看到，当谷胱甘肽浓度较高时 (10 mm)，载药胶束在前 12 h内有明显的突释(p《0.01)，48 h的累计释放量已超过70%。而与此同时，当谷胱甘肽浓度较低时 (10 μm) ，载药胶束累计释放量只有21.1%和16.6%，说明载药胶束在体内循环中不会将药物提前释放出来，其在血液循环过程中较为稳定。 综上可知，dox+l29@tpsp 载药胶束的还原响应性敏感，在肿瘤细胞中能够起到快速释放的效果。
[0081]
实例3 载药胶束的细胞摄取实验为评价载药纳米胶束的细胞摄取，将具有荧光的药物dox包封在不同材料中 (浓度10 μg/ml)，分别与肿瘤相关成纤维细胞 (cafs)，犬乳腺癌细胞(cmt-7364)以及耐阿霉
素人乳腺癌细胞系(adr/mcf-7)作用时间1 h，然后分别通过荧光显微镜以及流式细胞仪评价，并通过imagej 荧光半定量分析以及流式结果分析dox的荧光强度 (图18,19,20)。结果表明靶向材料组 (dox@tpsp) 在三种细胞中均达到了高摄取量，在cafs，cmt-7364和adr/mcf-7细胞中，dox@tpsp组相较于dox@psp组摄取能力分别提高了1.5倍、0.84倍和0.67倍，可见tel靶向基团可以增加细胞对胶束的摄取，尤其是肿瘤相关成纤维细胞，证明了合成的聚合物胶束具有良好的靶向肿瘤相关成纤维细胞的能力。
[0082]
实例4：药物协同指数考察及载药胶束体外细胞毒性测定采用mts法，考察dox+l29@psp和dox+l29@tpsp对nih/3t3细胞和cafs的细胞毒性，如图21 (a)所示，当nih/3t3细胞未被刺激成cafs时，dox+l29@psp和dox+l29@tpsp组的细胞毒性无显著差异，且当dox浓度为2 μm，l29浓度为16 μm时，nih/3t3细胞存活率仍超过60 % ；如图21 (b)所示，当nih/3t3细胞被刺激成cafs时，cafs存活率整体均较nih/3t3细胞有下降，并且研究发现dox+l29@tpsp组的细胞存活率较dox+l29@psp组也有一定程度的下降，当dox浓度为2 μm ，l29浓度为16 μm 时，dox+l29@psp和dox+l29@tpsp组的细胞毒性差异显著 (p《0.05)，以上结果表明nih/3t3细胞被刺激成cafs后，对药物敏感性增加，特别是dox+l29@tpsp组，也说明cafs对dox+l29@tpsp组可能具有更好的摄取能力。
[0083]
为了考察dox和l29联合使用能否对肿瘤细胞产生更好的细胞毒性，在体外不同浓度下考察其单药及联合用药分别对cmt-7364和adr/mcf-7的细胞毒性，并计算其ci值（图22）。研究结果显示dox和l29通过共同包封在胶束中，各自的ic
50
相比于裸药组均有较为明显的下降：对cmt-7364细胞来说，dox+l29@psp组dox 的ic
50
由4.34 μm降低至1.32 μm，dox+l29@tpsp组降低至1.09 μm；dox+l29@psp组l29的ic
50
由15.23 μm降低至9.21 μm，dox+l29@tpsp组降低至8.78 μm。
[0084]
对adr/mcf-7细胞来说，dox+l29@psp组dox 的ic
50
由86.44 μm降低至1.33 μm，dox+l29@tpsp组降低至0.92μm ；dox+l29@psp组l29的ic
50
由14.30 μm降低至9.34 μm，dox+l29@tpsp组降低至7.34 μm。
[0085]
实例5 肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞（cafs）共培养后细胞毒性测定本研究首先将肿瘤相关成纤维细胞cafs与两种肿瘤细胞分别共培养，测试共培养后，两种肿瘤细胞是否会对dox和l29产生耐药性 (图23)。结果表明，与肿瘤相关成纤维细胞cafs共培养后的两种肿瘤细胞，对两种药物的ic
50
都有一定程度的提高，共培养后，cmt-7364细胞对于dox的ic
50
为14.81 μm，是共培养前ic
50
值的3.41倍；对于l29的ic
50
为21.53 μm，是共培养前ic
50
值的1.41倍。而adr/mcf-7细胞对于dox的ic
50
为96.59 μm，是共培养前ic
50
值的1.12倍；对于l29的ic
50
为53.16 μm，是共培养前ic
50
值的3.72倍。提示肿瘤相关成纤维细胞诱导了肿瘤细胞耐药性的产生。
[0086]
接着测试了裸双药dox+l29以及双药胶束dox+l29@psp和dox+l29@tpsp对与肿瘤相关成纤维细胞cafs共培养后的cmt-7364和adr/mcf-7的细胞毒性(图23，图24)。结果发现，裸双药组能够显著降低两种药物对两种细胞的ic
50
(p《0.05)，其ci值也说明双药联合能够起到协同作用。值得注意的是，靶向组双药ic
50
值均低于非靶向组和裸双药组，其ci值最低。提示靶向组药物对于上层的肿瘤相关成纤维细胞cafs有更强的靶向性，能够更好的杀伤或者改变cafs的特性，间接促进了肿瘤细胞的凋亡，减少cafs诱导肿瘤细胞产生的耐药
性。
[0087]
实例6 载药胶束体内抗肿瘤研究将犬乳腺癌细胞cmt-7364和肿瘤相关成纤维细胞cafs混合后接种于spf 级雌性nod-scid小鼠腹部乳垫处，建立混合肿瘤模型，以模拟肿瘤耐药环境。
[0088]
接种后，监测肿瘤体积，直到体积达到50 mm3时，荷瘤小鼠被随机分为5组，并定义为治疗 0 天。各组的治疗剂量为dox 0.4mg/kg + l29 5 mg/kg 。图25显示了在21天内的肿瘤体积测量结果，tpsp、dox+l29、dox+l29@psp、dox+l29@tpsp组小鼠肿瘤的体积分别为生理盐水组的96.63%、68.23%、47.33%、24.71%。图26显示了在21天内的肿瘤重量测量结果，tpsp、dox+l29、dox+l29@psp、dox+l29@tpsp组小鼠肿瘤的重量分别为生理盐水组的102.53%、71.01%、45.86%、19.49%。图27显示了各治疗组的抑瘤率 (tgi), tpsp、dox+l29、dox+l29@psp、dox+l29@tpsp组分别为3.57%、31.76%、53.25%、76.70%，dox+l29@tpsp组显示出最佳的治疗效果。而图28显示了各组小鼠21天治疗期内的体重变化，由于 dox 对机体具有毒副作用，因此由裸药dox+l29组小鼠体重相较于其他各组，有明显的下降，而dox+l29@psp组和dox+l29@tpsp组的小鼠体重与空白组相比没有显著的变化，也提示了胶束治疗的安全性。
[0089]
通过对比各组小鼠脏器的h&e染色结果并结合小鼠体重变化可知，裸药dox+l29对心脏、肾脏具有毒性，可以观察到dox+l29组心脏有中性粒细胞堆积，并且肾脏出现肾小球肿胀，肾小球结构不清晰，中性粒细胞聚集的现象。其余各组和载药胶束组的脏器未产生明显病变，说明通过胶束包载，能够减少裸药对机体的毒性，提高体内安全性。
[0090]
通过对各组小鼠肿瘤组织切片进行h&e、ki67、tunel染色分析，可知生理盐水与tpsp组，细胞致密，结构完整，细胞质核清晰。治疗组肿瘤细胞出现不同程度坏死区域，细胞核出现固缩、碎裂、溶解，细胞轮廓模糊。同时ki67染色和tunel染色结果分别显示dox+l29@tpsp组与其余各组相比具有最低的阳性增殖信号和最高的阳性凋亡信号，说明了dox+l29@tpsp组具有更好的抗肿瘤效果。

技术特征：
1.一种双靶向/载药的肿瘤还原敏感型纳米载体，其特征在于，所述纳米载体为嵌段聚合物经溶剂挥发法制备形成的胶束，所述嵌段聚合物为tel-peg-ss-pcl，其亲水端为带有靶向基团tel的peg，疏水端为pcl，为核壳结构，核为疏水端pcl，壳是带靶向基团tel的亲水性嵌段。2.根据权利要求1所述的一种双靶向/载药的肿瘤还原敏感型纳米载体，其特征在于，所述靶向基团为血管紧张素ii型受体(at1r)配体替米沙坦(tel)。3.根据权利要求1所述的一种双靶向/载药的肿瘤敏感型纳米载体，其特征在于，所述纳米载体为式所述结构聚合物，其中n≥2，m≥2。4.根据权利要求3所述的一种双靶向低毒性肿瘤微环境响应型纳米载体，其特征在于，所述的嵌段聚合物中重复单元m在30-70、n在50-80范围内。5.根据权利要求1-5所述的一种双靶向低毒性肿瘤微环境响应型纳米载体，其特征在于包括以下制备步骤：1）单保护1，3-丙二胺的合成(boc-nh-nh2)取10-100份1,3-丙二胺溶于甲醇中，冰浴条件下，滴入1-10份boc2o的甲醇溶液中，室温反应12-36h，反应结束后，减压浓缩回收溶剂，产物用乙酸乙酯溶解后，减压回收溶剂，残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用(石油醚：乙酸乙酯=1：2)进行萃取除掉双保护产物，萃取后分离出水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取出单保护1,3-丙二胺；2）单保护丙二胺-替米沙坦的合成(tel-nh-boc)取1-5份替米沙坦、3-15份edci、1-6份nhs及适量三乙胺，溶于二氯甲烷中，于冰浴下加入1-5份boc-丙二胺二氯甲烷溶液，缓慢升温至30-50℃反应24-60h，反应完毕后，分离有机相并减压回收溶剂，产物经快速硅胶色谱纯化，真空干燥得单保护丙二胺-替米沙坦；
3）单保护胱胺的合成 (boc-nh-ss-nh2)取1-5份胱胺二盐酸盐和3-15份三乙胺溶于甲醇中，冰浴条件下，将1-5份boc酸酐的甲醇溶液滴入其中，室温反应12-36 h，反应完毕后，减压回收溶剂后，产物用乙酸乙酯溶解后，回收溶剂，于残留物中加入nah2po4溶液调ph至5，并用 (石油醚：乙酸乙酯=1：1) 进行萃取，除去双保护产物后，收集水相，加入naoh溶液调ph至12，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂后，真空干燥得单保护胱胺；4）单保护胱胺-聚己内酯的合成(boc-ss-nh
2-pcl)取1-5份boc-ss-nh2，30-300份ε-己内酯，催化量辛酸亚锡，氮气保护下，100-150 ℃反应3-10 h，反应终止后，加入少量二氯甲烷溶解产物至糊状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤干燥得到单保护胱胺-聚己内酯；其中n≥2；5）双边羧基化聚乙二醇的合成(cooh-peg-cooh)将1-5份peg
2000
和4-20份琥珀酸酐溶于干燥二氯甲烷中，于50-80℃下回流反应，反应完毕后，减压回收有机相，用少量二氯甲烷溶解产物至粘稠状，将其滴入大量冰乙醚中沉淀，过滤干燥得双边羧基化聚乙二醇；其中m≥2；6）聚乙二醇-胱胺-己内酯的合成 (cooh-peg-ss-pcl，psp)取1-5份boc-ss-nh-pcl溶于dcm:tfa (v:v , 10 : 1)中室温下搅拌反应，直至boc完全脱下，减压回收溶剂，残余物溶于二氯甲烷，加入适量三乙胺；同时1-5份cooh-peg-cooh、
1-5份edci、1-5份nhs溶于干燥二氯甲烷中，加入适量三乙胺；于冰浴下混合上述两种溶液，于至25-40 ℃反应，反应结束后，分离出有机相，减压回收有机溶剂，用少量二氯甲烷溶解至粘稠状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，反复溶解、沉淀至cooh-peg-cooh除尽，真空干燥得聚乙二醇-胱胺-己内酯(psp)；其中n≥2，m≥2；7）tel-peg-ss-pcl的合成取1-5份cooh-peg-ss-pcl、 3-15份edci、10-15份nhs、适量三乙胺，溶于二氯甲烷中备用，另取1-5份tel-nh
2-boc溶于dcm:tfa=(v:v , 10 : 1)，室温下反应至boc完全脱除以暴露氨基后，减压回收有机溶剂后，用二氯甲烷重新溶解；将其加入上述cooh-peg-ss-pcl溶液，升温至20-40 ℃反应，反应完毕后，分离出有机相，减压回收溶剂，并用少量二氯甲烷溶解至粘稠状，将其滴入大量冰乙醇中沉淀，过滤，真空干燥得聚合物tel-peg-ss-pcl(tpsp)。6.权利要求5所述的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中所述的1,3-丙二胺：boc2o的投料比是10:1，反应温度为25℃，反应时间为24h；所述步骤2）中替米沙坦：edci：nhs：boc 的投料比 1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度30 ℃，反应时间为48 h；所述步骤3）中胱胺二盐酸盐：三乙胺：boc酸酐的投料量为1:3:1，反应温度为25℃，反应时间为24h；所述步骤4）中boc-ss-nh2：ε-己内酯的投料量为1:65，辛酸亚锡加入量为反应体系的千分之五，反应温度为140 ℃，反应时间为6 h；所述步骤5）中peg
2000
：琥珀酸酐的投料量为1:5，反应温度为50 ℃，反应时间为24 h；所述步骤6）中boc-ss-nh-pcl：cooh-peg-cooh：edci：tel-nh
2-boc的投料量为1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度为30 ℃，反应时间为48 h；所述步骤7）中cooh-peg-ss-pcl：edci：edci：nhs的投料量为1:3:1:1，三乙胺加入量为1%，反应温度为30 ℃，反应时间为72h。7.根据权利要求1-6任意一项所述纳米载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。8.权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗肿瘤药物是治疗乳腺癌的抗肿瘤药物。9.权利7所述的应用，其特征在于，所述治疗抗乳腺癌药物是治疗犬乳腺癌药物。

技术总结
本发明公开了一种双靶向/载药的还原敏感型纳米载体，为粒径范围是100-140nm的胶束，所述的胶束是由嵌段聚合物经溶剂挥发法制备形成的胶束组成，所述多嵌段聚合物为Tel-PEG-ss-PCL，其亲水端为带有靶向基团Tel的PEG，疏水端为PCL，为核壳结构，核为疏水端PCL，壳是带靶向基团Tel的亲水性嵌段。该纳米载体选择具有亲水端聚乙二醇和疏水端聚己内酯的聚合物胶束作为药物载体来改善药物水溶性差的问题；再利用血管紧张素II型受体(AT1R)配体替米沙坦(Tel)同时靶向过表达AT1R的CAFs和肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞和CAFs以及双载药以克服耐药性；同时以二硫键来响应肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽(GSH)以实现药物在细胞内的精准控制释放。该纳米载体实现了难溶性药物增溶、肿瘤和CAFs双靶向及逆转耐药的治疗效果，在体内体外均表现出良好的抗肿瘤效果。均表现出良好的抗肿瘤效果。均表现出良好的抗肿瘤效果。


技术研发人员：梁晓霞 谢昀宇 徐傅能
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/7/20