一株鞘氨醇胶高产菌株及其发酵生产方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其是一株鞘氨醇胶高产菌株及其发酵生产方法。


背景技术：

2.鞘氨醇单胞菌属是α-变形杆菌纲，鞘氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科的一个属，该菌属的很多菌株都能合成微生物多糖，它们的主链结构相似，被统称为鞘氨醇胶，包括三赞胶、结冷胶与韦兰胶等，这些鞘氨醇胶的多糖主链结构都由葡萄糖，葡萄糖醛酸，鼠李糖和(或)甘露糖组成，但侧链基团的种类和位置多样，使每一种鞘氨醇胶都具有独特的物理性质，广泛应用于食品、化工和医学组织工程等领域。但目前鞘氨醇胶的发酵生产普遍存在菌株繁殖速度慢，发酵转化率较低的问题。
3.原生质体融合是微生物育种的一种重要技术，可以改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物的合成量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物。通过融合把来自于不同微生物的细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传及生物特性。鞘氨醇胶合成菌会向细胞外分泌多糖产物，从而阻碍原生质体的制备过程，高效地去除鞘氨醇胶合成菌的细胞壁，并最大程度地保护微生物的活性，是原生质体融合育种的关键。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于利用原生质体融合育种技术，提供一株鞘氨醇胶高产菌株及其发酵生产的方法。
5.本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
6.提供一株鞘氨醇胶高产菌株r0102及其发酵生产的方法。
7.而且，所述鞘氨醇胶高产菌株r0102是由三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌通过原生质体融合育种得到的。
8.而且，所述鞘氨醇胶高产菌株r0102的特征为：革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.5-0.6um
×
1.6-2.3um，在活化培养基平板上形成黄色、边缘整齐的菌落，接触酶和硝酸盐还原阳性，甲基红和v-p试验阴性。
9.利用如上所述的鞘氨醇胶高产菌株r0102发酵生产的方法，步骤如下：
10.(1)菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/l)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，ph 6.5；将保藏菌株r0102划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养30-36h。
11.(2)种子制备：种子培养基(g/l)：蔗糖8-15，蛋白胨0.6-2.5，磷酸二氢铵0.5-1.5，硫酸镁0.1-1.0，ph 6-7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5ml无菌水，混合制成菌液，按5-10％的接种量接入摇瓶种子培养基中，30℃摇床振荡培养30-36h。
12.按5-10％的接种量接入种子培养基中，30℃培养30-36h，使菌量达到108cfu/ml以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-36h，接种量
为2-5％，通气量0.2-0.6vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-0.6kg/cm2，温度30℃。
13.(3)发酵生产：将种子液以5-10％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基(g/l)：糖蜜20-30，蔗糖10-20，硝酸钠3-6，豆饼粉0.5-1，磷酸二氢钾0.5-2，硫酸镁0.1-1.0，ph 6-7.5；通气量0.2-0.6vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-0.6kg/cm2。
14.(4)发酵产物的提取：发酵液升温至60-75℃维持10-15min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为70-90％的乙醇，压滤后50-55℃烘干，粉碎后得鞘氨醇胶产物。
15.本发明取得的优点和积极效果是：
16.本发明提供的鞘氨醇胶高产菌株r0102是由三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌通过原生质体融合育种得到的，该菌株具有比原始菌株更快的繁殖速度和更高的发酵液粘度。
附图说明
17.图1为本发明中菌株r0102的菌落特征图。
具体实施方式
18.下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
19.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
20.实施例1
21.一株鞘氨醇胶高产菌株r0102，由三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌通过原生质体融合育种得到的。
22.相关步骤如下：
23.原始菌种活化，将保藏在-80℃冰箱的三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌取出，在菌种活化固体平板培养基上划线接种，30℃的恒温培养箱中培养3d左右；菌种活化固体平板培养基(g/l)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，琼脂1.5，ph 6.5；按照此方法转接培养三代。
24.液体培养原始菌种，提前配置好液体的活化培养基，根据菌量需求，用接种针从固体平板上挑取2～4环菌种，接种到装有液体培养基的摇瓶中，放至30℃、180r/min的摇床中培养8～12h，至菌液600nm吸光度值0.1-0.2之间。
25.原生质体的制备，原始菌种的菌液在8000r/min离心5min，弃上清，加入1ml磷酸缓冲液，8000r/min下离心5min，反复两次后将菌体悬浮于1ml的smm缓冲液中，加入100μl edta溶液，放至30℃、150r/min的摇床20min后8000r/min离心5min，弃上清，加入溶菌酶，将菌体悬浮与酶充分接触，放至30℃、150r/min的摇床进行酶解，30min后在4000r/min离心10min弃上清，加入1ml高渗缓冲液洗酶一次，最后将制得的原生质体悬浮在1ml高渗缓冲液中。
26.原生质体的融合，将两管原生质体液各取0.5ml，混合均匀后，3000r/min离心10min，弃上清，加入1ml peg促融剂和200μl smm缓冲液，放至摇床2min，使它们充分融合，最后3000r/min离心10min，弃上清，悬浮于1ml smm缓冲液中。
27.融合子的筛选，取融合后的原生质体液0.1ml，用smm缓冲液进行倍比稀释，将稀释
好梯度的菌液加到提前制好的底层补充培养基的中央，晃匀放置一会，再倒入上层补充培养基，混匀，放至30℃培养箱中培养4～10d，对比它们的菌落特征、镜检细胞形态，检出融合子，对比相同条件下的生长情况以及发酵液粘度，筛选出氨醇胶高产菌株r0102。
28.实施例2
29.鞘氨醇胶高产菌株r0102的特征为：革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.5-0.6um
×
1.6-2.3um，在活化培养基平板上形成黄色、边缘整齐的菌落，与原始菌株中的三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌均不同，生理生化指标中接触酶和硝酸盐还原阳性，甲基红和v-p试验阴性，为菌株sphingomonas sp.。
30.实施例3
31.鞘氨醇胶高产菌株r0102发酵生产的方法，步骤如下：
32.(1)菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/l)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，ph 6.5；将保藏菌种菌株r0102划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养36h，得到比原始菌株更大的菌落。
33.(2)种子制备：种子培养基(g/l)：蔗糖8，蛋白胨1.0，磷酸二氢铵0.5，硫酸镁0.3，ph 7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5ml无菌水，混合制成菌液，按5％的接种量接入摇瓶种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h。
34.(3)发酵生产：将种子液以5％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基(g/l)：糖蜜30，蔗糖10，硝酸钠3，豆饼粉1，磷酸二氢钾0.6，硫酸镁0.3，ph 7.5；通气量0.2vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-0.3kg/cm2。发酵45h后，发酵液粘度达到43600mpa.s。
35.尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一株鞘氨醇胶高产菌株r0102，其特征在于：分类名称为sphingomonas sp.，由三赞胶合成菌和韦兰胶合成菌通过原生质体融合育种得到，革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.5-0.6um
×
1.6-2.3um，在活化培养基平板上形成黄色、边缘整齐的菌落，接触酶和硝酸盐还原阳性，甲基红和v-p试验阴性。2.根据权利要求1所述的鞘氨醇胶高产菌株r0102，其发酵方法的步骤如下：(1)菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/l)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，ph 6.5；将保藏菌株r0102划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养30-36h。(2)种子制备：种子培养基(g/l)：蔗糖8-15，蛋白胨0.6-2.5，磷酸二氢铵0.5-1.5，硫酸镁0.1-1.0，ph 6-7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5ml无菌水，混合制成菌液，按5-10％的接种量接入摇瓶种子培养基中，30℃摇床振荡培养30-36h。按5-10％的接种量接入种子培养基中，30℃培养30-36h，使菌量达到108cfu/ml以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-36h，接种量为2-5％，通气量0.2-0.6vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-0.6kg/cm2，温度30℃。(3)发酵生产：将种子液以5-10％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基(g/l)：糖蜜20-30，蔗糖10-20，硝酸钠3-6，豆饼粉0.5-1，磷酸二氢钾0.5-2，硫酸镁0.1-1.0，ph 6-7.5；通气量0.2-0.6vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-0.6kg/cm2。(4)发酵产物的提取：发酵液升温至60-75℃维持10-15min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为70-90％的乙醇，压滤后50-55℃烘干，粉碎后得鞘氨醇胶产物。

技术总结
本发明涉及一株鞘氨醇胶高产菌株，名称为R0102，分类名称为Sphingomonas sp.。鞘氨醇胶合成菌具有相似的多糖合成基因簇和较高的基因组同源性，通过优化鞘氨醇胶合成菌的原生质体制备条件，减少胞外分泌多糖产物对溶菌酶作用的阻碍，高效去除鞘氨醇胶合成菌的细胞壁，并最大程度地保护微生物的活性，得到的融合菌株R0102具有比原始菌株更快的繁殖速度和更高的发酵液粘度，为鞘氨醇胶的发酵提供了新的菌株资源。株资源。株资源。


技术研发人员：黄海东 章阳 李晓雁 苗金军 游鹏智
受保护的技术使用者：天津农学院
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/7/20