抑制核盘菌的水稻OsGLP3-6及其应用

抑制核盘菌的水稻osglp3-6及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及抑制核盘菌的osglp3-6及其应用。


背景技术：

2.核盘菌(s.sclerotiorum)是一种致病范围广泛的腐生型丝状真菌。核盘菌能够感染500多种植物(liang et al.,2018)，包括双子叶植物油菜、白菜、甘蓝等，给我们农业生产带来了严重损失(boland et al.,2009)。核盘菌分泌的植物细胞壁降解酶分泌蛋白通过降解植物细胞壁帮助病原菌突破屏障，促进菌丝的入侵。对核盘菌而言，多种禾本科植物，特别是水稻在很早就被鉴定为核盘菌的非寄主植物(purdy,1979)，利用水稻相关基因的非寄主抗性机制，为油菜等寄主植物的核盘菌抗性改良提供了全新的抗病基因资源。
3.近年来，植物类萌发蛋白(germin-like proteins，glps)的研究在拟南芥(arabidopsis thaliana)、水稻(oryza sativa)、大豆(glycine max)等植物中进行了报道。有研究表明，部分atglps、osglps(li et al.,2016)以及zmglps(fan et al.,2005)在种子萌发和幼嫩组织中高度表达，可能参与了植物的生长发育。而更多的研究表明了植物受到病原菌的侵染和食草昆虫的咬食，植物体内的glps基因表达量增加，glp家族成员的酶活性(sod和oxo)也随之增强。在应对病原菌感染和一些非生物胁迫中发挥了重要的作用(zhang et al.,2017；pei et al.,2019；banergee et al.,2017)。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供水稻osglp3-6及其编码的蛋白与应用。
5.首先，本发明提供水稻osglp3-6蛋白，其为：
6.1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
7.2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
8.本发明还提供编码所述蛋白的基因。优选的，所述基因的序列如seq id no.1所示。
9.本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。
10.本发明还提供所述基因在调控核盘菌寄主植物菌核病抗性中的用途。
11.在本发明一个实施方案中，将所述基因转入寄主植物基因中，并在转基因植物中超量表达，提高植物菌核病抗性。
12.本发明还提供一种提高核盘菌寄主植物对菌核病抗性的方法，其特征在于，将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。
13.本发明在通过分析对水稻接种核盘菌的rna-seq进行分析，并结合甘蓝等寄主植物的转录组数据，挑选出候选基因osglp3-6。在拟南芥中异源超表达osglp3-6基因，利用荧光定量手段鉴定阳性植株后，培养至t3代，然后对阳性株系进行叶片的核盘菌接种。结果表明，拟南芥过表达系oe_osglp3-6的平均菌斑面积(65.2mm2)相较于野生型wt的菌斑面积
(79.9mm2)减少22.4％，极显著(p《0.01)提高了拟南芥对于核盘菌的抗性。
附图说明
14.图1所示为水稻叶片创伤与未创伤接种后表型观察。-w：未创伤处理；+w：创伤处理。
15.图2所示为样品差异表达基因情况。
16.图3所示为水稻接种12h的go富集(a)和kegg富集结果(b)以及水稻接种24h的go富集(c)和kegg富集结果(d)。
17.图4所示为水稻、甘蓝接种前后glp家族基因的表达情况。
18.图5所示为osglp3-6基因的克隆。
19.图6所示为融合载体构建示意图。
20.图7所示为大肠杆菌中目的片段的鉴定。(m＝marker 2000；lane1-6为阳性克隆)。
21.图8所示为农杆菌中目的片段的鉴定。(m＝marker 2000；lane1-6为阳性克隆)。
22.图9所示为转基因拟南芥中osglp3-6表达量鉴定。
23.图10所示为转基因拟南芥菌核病抗性鉴定。
24.图11所示为瞬时转化烟草的抗性鉴定。
具体实施方式
25.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
26.酶及试剂盒：基因克隆高保真酶(apexhf hs dna polymerase fs master mix)、dna凝胶回收试剂盒购于湖南艾科瑞生物工程有限公司；限制性内切酶均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；dna marker(bm5000/bm2000)购于博迈德生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；rna提取试剂盒、总rna反转录试剂盒购于tiangen公司。核酸染料super gelredtm购于苏州宇恒生物有限公司；其他药品：琼脂糖购买于全式金生物公司，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素、利福平、和乙酰丁香酮等抗生素粉剂购于北京索莱宝科技有限公司。
27.溶液的配制：本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。
28.lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。
29.供试菌株：核盘菌野生型菌株“1980”由实验室保存，核盘菌“tl”，菌株在pda培养基上培养，培养温度为22℃
30.主要仪器：pcr扩增仪(bio-rad)、高速离心机(hettich mikro 200r)、电泳设备(bio-rad)、凝胶成像系统(bio-rad)、荧光定量pcr仪(abi7500)。
31.实施例1水稻对核盘菌的抗病分子网络分析
32.供试植物材料：
33.水稻材料为缙恢10，种植于西南大学水稻试验基地，核盘菌野生型菌株“1980”，在pda培养基上培养，培养温度为22℃。
34.水稻接种核盘菌方法：
35.核盘菌接种水稻接种：于水稻实验田内剪取水稻倒二叶进行核盘菌的接种。将水稻叶片切口处覆上湿润的棉花，在选择打孔区域时，优先选择菌丝生长均匀且旺盛的核盘菌菌丝块，直径为6mm。接种时镊子夹取菌丝块使菌丝面接触水稻叶片正面，避开叶脉进行接种。对照组采用无菌丝的空白pda琼脂块进行接种，方法同上。22℃保湿培养接种1～4d(图1)。
36.转录组测序及分析
37.将创伤后的水稻叶片分别接种空白pda琼脂块(不接种对照)、两种核盘菌菌株(1980和tl)，于接种后12和24h移除琼脂块和菌丝块后，共8个样，送百迈克生物技术公司进行转录组测序(rna-seq)。测序数据经质量评估后与水稻参考基因组(参考基因来源：oryza sativa；参考基因组版本：irgsp-1.0；参考基因组来源：http://plants.ensembl.org/oryza_sativa/info/index；)比对分析，分析基因表达水平和差异表达基因(degs)(图2)，最后对degs进行kegg富集分析。如图3所示，与未接种对照相比，接种的水稻在ndole-containing compound biosynthetic process、tryptophan biosynthetic process等生物学过程，以及glutathione metabolism和phenylalanine biosynthesis等途径被促进。进一步与甘蓝接种核盘菌前后的转录组数据比较，如图4所示，水稻中glp家族基因(植物类萌发蛋白)受菌诱导上调表达，然而该家族基因在甘蓝等寄主植物接种后没有显著上调，推测osglp对核盘菌的抗性有重要一定贡献，osglp3-6作为候选基因进行后续的功能验证。
38.实施例2水稻中osglp3-6基因的克隆
39.(1)试验材料缙恢10种植于西南大学水稻试验基地，按一般大田管理。所取部位有根、茎、叶、花以及不同发育时期的种子，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。植物dna提取采用改良的ctab法，植物总rna提取采用tiangen公司试剂盒。
40.(2)将200ng rna反转录为cdna，将反转录产物cdna溶液稀释4倍作为pcr反应模板。
41.以提取的各组织的水稻总rna为模板，利用的是takara的反转录试剂盒将其反转录为cdna，反应体系见表1。
42.表1反应体系
43.[0044][0045]
备注：反应过程在pcr仪器内先37℃温育15min，然后85℃5s最后-20℃保存备用
[0046]
(3)进行pcr反应扩增目的基因
[0047]
采用oligo6软件设计osglp3-6的引物。以反转录所得到的混合cdna为模板对水稻osglp3-6基因进行pcr扩增。反应体系如表2表2目的基因扩增体系
[0048][0049]
pcr反应所需条件设置为：
[0050][0051]
引物序列：
[0052]
osglp3-6-f:5
′‑
atggagcacagcttcaaaac-3
′
[0053]
osglp3-6-r:5
′‑
ttagtacccgccggtgaatt-3
′
[0054]
(4)反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果(图5)。
[0055]
(5)对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收。
[0056]
(6)将上述胶回收的产物连接pbin35sred载体并转化大肠杆菌。
[0057]
(7)37℃过夜培养从抗性lb培养基上挑取单克隆到含有kan的600μl lb培养基中37℃摇菌培养4h。
[0058]
(8)菌液pcr验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。
[0059]
将拟南芥的atglp1(at1g72610.1)基因在水稻数据库中进行同源比对和鉴定，找到相应目的序列后，采用oligo 6软件设计引物，采用pcr(polymerase chain reaction)技术从缙恢10中扩增出完整cds序列690bp(seq id no.1)，其中开放阅读框orf为690bp，编码229个氨基酸残基(seq id no.2)。
[0060]
实施例3pbin35sred::osglp3-6过表达载体的构建
[0061]
1)质粒提取及酶切
[0062]
质粒提取采用tiangen公司质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为210ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用xba i-sma i进行双酶切。
[0063]
2)pbin35sred::osglp3-6过表达载体的构建
[0064]
目的基因orf序列扩增：根据终载体pbin35sred的图谱设计xba i-sma i为插入位点并合成引物，引物序列如下：
[0065]
in-osglp3-6-f:5
′‑
atttggagaggacacgaattcatggagc acagcttcaaaac-3
′
(含酶切位点xba i)
[0066]
in-osglp3-6-r:5
′‑
ccgcctcgagcccgggtctagattagtac ccgccggtgaatt-3
′
(含酶切位点sma i)
[0067]
使用高保真酶扩增得到目的片段。
[0068]
表3目的基因扩增体系
[0069][0070][0071]
(1)pcr反应程序：
[0072]
98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min。
[0073]
(2)电泳检测与回收：
[0074]
pcr产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90v，电泳1h，在紫外灯下观察结果，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。
[0075]
(3)融合表达载体构建：
[0076]
将xba i-sma i酶切的质粒pbin35sred与目的基因osglp3-6的连接，融合表达载体构建示意图如图6所示。连接体系见表4。
[0077]
表4目的基因与pbin35sred重组质粒连接体系
[0078][0079]
a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；
[0080]
b.16℃连接2h；
[0081]
c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。
[0082]
连接产物转化大肠杆菌
[0083]
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μl大肠杆菌的感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
[0084]
b.然后加入10μl的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
[0085]
c.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
[0086]
d.吸500μl lb液体培养液到ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
[0087]
e.取出摇床结束的ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μl，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含kan的lb固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
[0088]
f.37℃恒温培养箱中培养16～20h。
[0089]
g.随机挑取单克隆进行鉴定，结果如图7所示。
[0090]
所用引物序列为：
[0091]
pbin35sred-f引物：5'-cgcacaatcccactatcctt-3’[0092]
pbin35sred-r引物：5'-aaaagacaaaagtggggtag-3'
[0093]
h.对鉴定正确单克隆在含有kan的lb培养基进行扩繁，37℃条件下190rmp的摇床过夜，提取质粒送擎科公司进行测序后于4℃保存。
[0094]
连接产物转化农杆菌
[0095]
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μlgv3101农杆菌的感受态细胞，放于冰上；
[0096]
b.等待感受态半融化后，向ep管中加入100ng的重组质粒，后冰浴10min；
[0097]
c.紧接着液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min；
[0098]
d.吸取500μl lb液体培养液到ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，28℃培养2h；
[0099]
e.取出摇床结束的ep管，取200μl菌液，吸打在含kan/rif的lb固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
[0100]
f.28℃恒温培养箱中培养24-36h。
[0101]
g.随机挑取单克隆进行鉴定，结果如图8所示。
[0102]
实施例4转基因拟南芥的获取
[0103]
等待野生型拟南芥种(22℃，16h光照/8h黑暗)培养进入盛花期后，采用浸花法进
行转化，在转化前一天对拟南芥适当浇水。实施例3制备的阳性的农杆菌液在kan、rif双抗性的液体lb培养基中过夜大摇，通过转化介质将注射液浓度调至od600≈0.8左右，黑暗静置4h左右。野生型拟南芥的转化采用了蘸花法，用枪头吸取少许含有农杆菌转化介质中，滴落在拟南芥花絮上，黑暗避光培养24h。避光培养后取出后，按照正常的培养条件(22℃，16h光照/8h黑暗)培养，待果荚成熟后混收t0代的种子。而后将t0代种子在含有kan的ms培养基上进行筛选后，随机选取三个株系进一步进行qrt-pcr进行鉴定发现，拟南芥阳性株系osglp3-6的表达水平显著提高(图9)。
[0104]
引物序列：
[0105]
qrt-glp3-6-f：gagcacagcttcaaaaccatag
[0106]
qrt-glp3-6-r：tggcaatcttggaggagaag
[0107]
at-actin-f：agaaaccctcgtagattggcac
[0108]
at-actin-r：actctcccgctatgtatgtcgc
[0109]
实施例5转基因拟南芥的抗性鉴定
[0110]
将拟南芥播种于1/2ms培养基上，置于温度22℃，空气湿度70％、光照强50μmlo
·
m-2
·
s-1
、光周期为光照：黑暗＝16h：8:h的温室中培养，萌发后将幼苗移植至营养土中培养，30d后进行核盘菌接种处理。
[0111]
取长、宽均为90mm的方形培养皿，在其底部放置大小相近的滤纸，加入适量的水将滤纸浸湿，选取大小相近、表面平整的拟南芥叶片，将其平铺于滤纸上，在叶脉处放置灭菌棉条，用移液枪吸取适当的水将棉条浸湿，保持叶片湿润，取直径约为2.5mm的核盘菌菌块，置于拟南芥叶片上，放置温室中处理36h后测量病斑面积并进行拍照记录。
[0112]
在苗期对拟南芥进行叶片接种，通过对菌斑面积进行统计发现，结果如图10所示。三个oe_osglp3-6转基因株系的菌斑面积分别65.9mm2、64.6mm2和65.1mm2，过表达系的平均菌斑面积(65.2mm2)比wt(79.9mm2)减小22.4％，上述结果表明，过表达osglp3-6可显著提高拟南芥的菌核病抗性。
[0113]
实施例6瞬时转化烟草的抗性鉴定
[0114]
配制500ml烟草注射悬浮液，包括2-吗啉乙磺酸(mes，1.02g)、六水合氯化镁(0.98g)和乙酰丁香酮(as，50mm)。向离心管中加入适量烟草侵染悬浮液，悬浮实施例3制备的携带有pbin35sred::osglp3-6过表达载体的农杆菌菌体沉淀，将菌液od600调至1.0，28℃培养箱避光孵育2h。用一次性无菌注射器吸取侵染液从烟草叶片背面注射，食指轻抵注射位置的叶片正面，缓缓注入，肉眼可见水渍状圆斑自注射位置向叶片均匀扩散，用马克笔在叶片背面标注菌液侵染位置。注射后将烟草密封于湿润环境中避光培养36～48h。
[0115]
取长、宽均为90mm的方形培养皿，在其底部放置大小相近的滤纸，加入适量的水将滤纸浸湿，选取4-5周的大小相近、表面平整的烟草叶片，将其平铺于滤纸上，在叶脉处放置灭菌棉条，用移液枪吸取适当的水将棉条浸湿，保持叶片湿润，取直径约为2.5mm的核盘菌菌块，置于在注射菌液区域，36h后统计菌斑大小，取样并进行拍照记录。
[0116]
通过对烟草叶片的菌斑面积进行统计发现，结果如图11所示。三个瞬时表达35s::osglp3-6叶片的菌斑面积分别比ck减小35.45％，上述结果都表明，过表达osglp3-6可显著提高对菌核病的抗性。
[0117]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在
本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.水稻osglp3-6蛋白，其为：1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的水稻osglp3-6蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如seq id no.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7.权利要求2或3所述基因在调控核盘菌寄主植物菌核病抗性中的用途。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入寄主植物基因中，并在转基因植物中超量表达，提高植物菌核病抗性。9.一种提高核盘菌寄主植物对菌核病抗性的方法，其特征在于，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

技术总结
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个抑制核盘菌的OsGLP3-6及其应用。水稻OsGLP3-6cDNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明在拟南芥中异源超表达OsGLP3-6基因，利用荧光定量手段鉴定阳性植株后，培养至T3代，然后对阳性株系进行叶片的核盘菌接种。结果表明，拟南芥过表达系OE_OsGLP3-6的平均菌斑面积(65.2mm2)相较于野生型WT的菌斑面积(79.9mm2)减少22.4％，极显著(p<0.01)提高了拟南芥对于核盘菌的抗性。拟南芥对于核盘菌的抗性。


技术研发人员：梅家琴 杨书贤 左香君 钱伟
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/7/20