阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法与流程

1.本发明属于分析化学技术领域，特别是阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法。


背景技术：

2.阿胶为马科动物驴equusasinusl.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，是常用的补益中药，具有补血滋阴、润燥、止血的功效，被称为“补血圣药”。此外，阿胶也是药食同源的产品，常见于药品以及各类保健品和食品等商品中。阿胶的主要成分为胶原蛋白、多肽和氨基酸类成分，含量约为60～80％左右。由于驴皮资源短缺，生产过程繁琐，阿胶市场价格较高，市场上阿胶的质量参差不齐，常有马、牛、羊、猪等低价皮源掺假的现象，最终可能会影响阿胶的作用效果。因此亟需建立阿胶快速定性定量分析的方法。已有研究基于蛋白酶酶解和质谱技术建立了阿胶中马、牛、羊、猪、骆驼、鹿等来源的多肽鉴别方法，从而实现阿胶的质量控制。但现有的方法多基于液相色谱-质谱联用技术(lc-ms)，分析时间25～40min不等，分析时间较长，通量较低，分析成本高。此外，阿胶中氨基酸类成分的lc-ms分析方法也有建立。但作为阿胶中的主要成分，蛋白多肽类和氨基酸类等小分子代谢物由于化学性质的差异，较难实现同步分析，目前尚无阿胶中多肽和小分子化合物的同步分析研究的相关报道。
3.直接注射-质谱(di-ms)直接将样品引入质谱，具有分析时间短，通量高的优势，且能够实现大、中、小极性化合物同步分析。di结合三重四级杆等质谱的多反应监测(mrm)模式在代谢组学的分析中已有运用。然而，在di的条件下，由于基质效应的影响，分析物的响应通常受到抑制，信噪比较低，尤其是应用于多肽的分析时，抑制作用更明显。ms3(或mrm3)扫描是四级杆-线性离子阱(qtrap-ms)的特有扫描方式，其工作原理是母离子在第一个碰撞池(q2)中碰撞产生子离子，传输到第三个四级杆筛选指定的子离子并切换为线性离子阱(lit)工作模式，进一步裂解产生孙离子进行扫描。mrm3扫描相较于mrm能显著提升信噪比，且经过多次筛选，建立的特征离子对专属性更强，灵敏度更高。
4.目前对阿胶的成分检测的专利比较多，如现有技术(cn115015409a)一种阿胶多肽lcms特征图谱的建立方法及其质量评价方法，利用lcms技术检测了阿胶的多肽成分。现有技术(cn109293741a)一种鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽，则是利用质谱法鉴别阿胶中的多肽成分。可见，现有技术中并没有同歩检测多肽和小分子代谢物的方法，也没有使用直接注射-多级多反应监测质谱(di-mrm3)的分析手段对阿胶进行分析。而本发明通过直接注射-多级多反应监测质谱(di-mrm3)同步快速检测阿胶中的多肽和小分子代谢物，能快速有效的对阿胶进行鉴别，其方法专属性更强，灵敏度更高。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种基于直接注射-多级多反应监测质谱(di-mrm3)实现阿胶中蛋白多肽类及小分子代谢物的快速定性定量分析方法，该方法专属性更强，灵敏度
更高。
6.本发明的技术方案：
7.阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，所述方法是通过lc-mrm技术将阿胶供试品溶液进行质谱参数在线优化，在定性分析的基础上选取匹配度好、响应值高的多肽和小分子代谢物作为目标分析物，并进一步构建了7个多肽序列的14个mrm3离子对和13个小分子代谢物的13个mrm3离子对的di-mrm3检测方法。
8.前述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，所述方法包括以下步骤：
9.(1)供试品溶液制备：提取阿胶溶液并酶解，得到阿胶酶解溶液作为供试品溶液；
10.(2)在线参数优化色谱条件：色谱柱为watersacquityuplchsst3色谱柱，100
×
2.1mm，1.8μm；进样体积2μl，流速0.25ml/min；以0.1％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱；柱温为40℃；
11.(3)在线参数优化离子源参数设置条件：正离子模式采集，雾化器、加热器、气帘气或碰撞气体均为n2；雾化器气体gs1为55psi；加热器气体gs2为55psi；帘式气体为30psi；离子喷雾针电压为5500v；碰撞激活解离cad气体为high；离子化温度tem为550℃；射入电压ep为10v，碰撞室射出电压cxp为13v；脱簇电压dp为45v，采用srm-ida-epi扫描模式；对于epi扫描，ida阈值为2000cps，ce为30ev，ces为15ev；
12.(4)阿胶多肽色谱条件：色谱柱为easy-spray
tmc18
，100
×
0.75mm，3μm；进样体积2μl，流速300nl/min；以0.1％甲酸水为流动相a，0.1％甲酸乙腈为流动相b进行梯度洗脱；图谱采集时间为85min；
13.(5)阿胶多肽离子源参数设置条件：质谱检测采用esi正离子化模式，喷雾电压为4.5kv，鞘气流速为30arp，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；ms1谱图通过ftms模式获取，扫描范围设定为350～2000da，分辨率为60000fwhm；ms2谱图通过itms模式采集，分辨率为7500fwhm。
14.(6)将供试品溶液分别按照上述步骤(2)和(3)的方法进样以小分子代谢物的母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为小分子代谢物伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到小分子代谢物伪离子对的相对响应值；
15.(7)将供试品溶液分别按照上述步骤(4)和(5)的方法进样，获得其高分辨质谱信息，结合swiss-prot检索进行多肽定性分析，获得多肽氨基酸序列以及质谱ms1和ms2信息；再按照上述步骤(2)和(3)的方法进样，取双电荷准分子离子峰为母离子，以母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为多肽伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到多肽伪离子对的相对响应值；
16.(8)将步骤(6)和(7)的小分子代谢物伪离子对和多肽伪离子对的相对响应值均导入graphpadprism7.0软件中，通过gaussian曲线拟合离子对的裂解曲线，拟合曲线的顶点对应的碰撞能为最佳碰撞能oce，小分子代谢物选择响应最佳的一对离子对，多肽选择响应最佳的两对离子对，以母离子、子离子和子离子构建mrm3离子对，最终建立13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对的mrm3方法；
17.(9)选取步骤(8)中的13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对作为目标分析物，利用di的方式将供试品溶液直接引入质谱仪配备的电喷雾esi离子源中进行分离，采用mrm3扫描进行定性定量分析。
18.前述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密称取阿胶样品约0.1g，加入10ml含1％nh4hco3的水溶液，超声提取30min，提取后的样品溶液以12000rpm离心10min后，每90μl上清液加入10μl的1μg/μl的胰蛋白酶溶液，在37℃和200r/min的条件下，摇床上恒温酶解16h后，加入0.1％的甲酸，终止反应，经12000rpm离心15min后，以0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。
19.前述步骤(2)中，洗脱程序为0
–
2min，0％b；2
–
7min，0％
–
35％b；7
–
8min，35％
–
90％b；8
–
8.1min，90％
–
0％b；8.1
–
11min，0％b。
20.前述步骤(4)中，洗脱程序为0
–
65min，5％
–
30％b；65
–
75min，30％
–
50％b；75
–
85min，50％
–
95％b。
21.前述步骤(8)中，13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对为：
[0022][0023]
前述步骤(9)中，电喷雾esi离子源的参数设置如下：正离子模式下采集，雾化器气
体gs1为14psi，加热器气体gs2为0psi，帘式气体为20psi，离子喷雾针电压为5500v，碰撞激活解离cad气体为high，离子化温度tem为100℃，流速设为10μl/min。
[0024]
前述步骤(9)中，mrm3扫描参数设置为：center，窗口为
±
2da；af2能量设置为0.005v；ce为各离子对在线优化的oce值；fixedtime设置为100ms；激发时间设置为50ms；勾选q0trap。
[0025]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026]
1、本发明通过阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，di-mrm3的多肽和小分子代谢物的平均质谱响应显著提升，提高了检测的灵敏度。此外di-mrm3实现了多肽和小分子代谢物的同步分析，可以应用于同时分析小分子代谢物与多肽的靶向双组学。
[0027]
2、构建了7个多肽序列的14个mrm离子对和13个小分子代谢物的13个mrm离子对的di-mrm3检测方法，该方法专属性更强，灵敏度更高。
附图说明
[0028]
图1：lc-ms/ms获得的阿胶胰蛋白酶酶解多肽的提取离子流色谱图(a)和sgqpgtvgpagvr的ms2和结构解析图谱(b)；
[0029]
图2：sgqpgtvgpagvr六组拟离子对m/z591.82
→
910.51，m/z591.82
→
813.46，m/z591.82
→
756.44，m/z591.82
→
655.39，m/z591.82
→
556.32和m/z591.82
→
499.30的裂解曲线；
[0030]
图3：本发明实施例中针对阿胶中7个多肽和13个小分子代谢物的lc-mrm3选择离子检测色谱图；
[0031]
图4：为本发明实施例中针对阿胶中7个多肽和13个小分子代谢物的di-mrm3提取离子流色谱图(a)和平均响应质谱图(b)；
[0032]
图5：本发明实施例中针对阿胶中7个多肽和13个小分子代谢物的di-mrm提取离子流色谱图(a)和平均响应质谱图(b)。
具体实施方式
[0033]
实施例1：
[0034]
供试品溶液的制备方法：精密称取阿胶样品约0.1g，加入10ml含1％nh4hco3的水溶液，超声提取30min，提取后的样品溶液以12000rpm离心10min后，每90μl上清液加入10μl的1μg/μl的胰蛋白酶溶液，在37℃和200r/min的条件下，摇床上恒温酶解16h后，加入0.1％的甲酸，终止反应，经12000rpm离心15min后，以0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。
[0035]
实施例2：
[0036]
阿胶小分子代谢物在线参数优化方法
[0037]
在线参数优化色谱条件：色谱柱为watersacquityuplchsst3色谱柱，100
×
2.1mm，1.8μm；进样体积2μl，流速0.25ml/min；以0.1％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为0
–
2min，0％b；2
–
7min，0％
–
35％b；7
–
8min，35％
–
90％b；8
–
8.1min，90％
–
0％b；8.1
–
11min，0％b；柱温为40℃；
[0038]
在线参数优化离子源参数设置条件：正离子模式采集，雾化器、加热器、气帘气或碰撞气体均为n2；雾化器气体gs1为55psi；加热器气体gs2为55psi；帘式气体为30psi；离子喷雾针电压为5500v；碰撞激活解离cad气体为high；离子化温度tem为550℃；射入电压ep为10v，碰撞室射出电压cxp为13v；脱簇电压dp为45v，采用srm-ida-epi扫描模式；对于epi扫描，ida阈值为2000cps，ce为30ev，ces为15ev；
[0039]
将实施例1的供试品溶液分别按照上述在线参数优化色谱条件和在线参数优化离子源参数设置条件的方法进样以小分子代谢物的母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为小分子代谢物伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到小分子代谢物伪离子对的相对响应值。
[0040]
实施例3：
[0041]
阿胶多肽在线参数优化方法：
[0042]
阿胶多肽色谱条件：色谱柱为easy-spray
tmc18
，100
×
0.75mm，3μm；进样体积2μl，流速300nl/min；以0.1％甲酸水为流动相a，0.1％甲酸乙腈为流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序为0
–
65min，5％
–
30％b；65
–
75min，30％
–
50％b；75
–
85min，50％
–
95％b；图谱采集时间为85min；
[0043]
阿胶多肽离子源参数设置条件：质谱检测采用esi正离子化模式，喷雾电压为4.5kv，鞘气流速为30arp，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；ms1谱图通过ftms模式获取，扫描范围设定为350～2000da，分辨率为60000fwhm；ms2谱图通过itms模式采集，分辨率为7500fwhm。
[0044]
将供试品溶液分别按照阿胶多肽色谱条件和阿胶多肽离子源参数设置条件的方法进样，获得其高分辨质谱信息，结合swiss-prot检索进行多肽定性分析，获得多肽氨基酸序列、ms1和ms2信息；然后按照实施例2中的在线参数优化色谱条件和在线参数优化离子源参数设置条件的方法进样，取双电荷准分子离子峰为母离子，以母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为多肽伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到多肽伪离子对的相对响应值；
[0045]
实施例4：
[0046]
建立13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对的mrm3方法：
[0047]
将小分子代谢物伪离子对和多肽伪离子对的相对响应值均导入graphpadprism7.0软件中，通过gaussian曲线拟合离子对的裂解曲线，拟合曲线的顶点对应的碰撞能为最佳碰撞能oce，小分子代谢物选择响应最佳的一对离子对，多肽选择响应最佳的两对离子对，以母离子、子离子和子离子离子对进行mrm3方法构建，最终建立13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对的mrm3方法。
[0048]
13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对为：
[0049][0050][0051]
实施例5：
[0052]
阿胶小分子代谢物和多肽的定量分析：
[0053]
(1)电喷雾esi离子源的参数设置如下：正离子模式下采集，雾化器气体gs1为14psi，加热器气体gs2为0psi，帘式气体为20psi，离子喷雾针电压为5500v，碰撞激活解离cad气体为high，离子化温度tem为100℃，流速设为10μl/min。
[0054]
(2)mrm3扫描参数设置为：center，窗口为
±
2da；af2能量设置为0.005v；ce为各离子对在线优化的oce值；fixedtime设置为100ms；激发时间设置为50ms；勾选q0trap。
[0055]
(3)将13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对作为目标分析物，利用di的方式将供试品溶液直接引入质谱仪配备的电喷雾esi离子源中进行分离，采用mrm3扫描进行定性定量分析。
[0056]
发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
[0057]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0058]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买
得到的常规产品。
[0059]
上面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0060]
本发明进行了大量的实验研究，以下为本发明实验研究的过程结果：
[0061]
1实验例：
[0062]
1.1实验材料
[0063]
阿胶购自山东福牌阿胶股份有限公司。塔拉萨敏购自上海生物标准有限公司。质谱级甲醇(meoh)、乙腈(acn)和甲酸(fa)均购自美国thermofisher公司，去离子水为实验室自制milli-q超纯水(18.2mω
·
cm)。
[0064]
u-3000双三元液相色谱仪(包括两个三元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器，美国thermofisher公司)；acquityuplchsst3型色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.8μm，美国waters公司)；qtrap5500型质谱仪(美国sciex公司)；ltqorbitrapvelosproms(美国thermofisher公司)；milli-q型超纯水净化系统(美国millipore公司)；me204型电子分析天平(瑞士mettlertoledo公司，精确度为0.1mg)。
[0065]
1.2样品制备
[0066]
精密称取阿胶样品约0.1g，加入10ml含1％nh4hco3的水溶液，超声提取30min。提取后的样品溶液以12000rpm离心10min后，每90μl上清液加入10μl的1μg/μl的胰蛋白酶溶液，于200r/min的摇床上恒温酶解16h(37℃)。酶解完成后，加入0.1％的甲酸，终止反应，经12000rpm离心15min后，以0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得阿胶酶解样品。
[0067]
1.3目标化合物di-mrm3方法建立
[0068]
1.3.1阿胶多肽定性分析
[0069]
将阿胶酶解样品注入nanolc-ltq-orbitrap-ms系统，采集样品的高分辨质谱数据。液相条件如下：色谱柱为easy-spray
tmc18
(100
×
0.75mm，3μm，美国thermo-fisher公司)，进样体积2μl，流速300nl/min。以0.1％甲酸水为流动相a，0.1％甲酸乙腈为流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序为0
–
65min，5％
–
30％b；65
–
75min，30％
–
50％b；75
–
85min，50％
–
95％b；图谱采集时间为85min。质谱检测采用esi正离子化模式，喷雾电压为4.5kv，鞘气(sheathgas)流速为30arp，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；ms1谱图通过ftms模式获取，扫描范围设定为350～2000da，分辨率为60000fwhm；ms2谱图通过itms模式采集，分辨率为7500fwhm。利用proteomediscoverer(version1.4)软件分析质谱数据，并导入swiss-prot数据库进行检索，sequest算法用于多肽的鉴定，参数设定如下：酶解方式为胰蛋白酶，胰酶漏切为2，母离子偏差≤10ppm，子离子偏差≤0.8da。
[0070]
1.3.2小分子代谢物的定性分析
[0071]
文献报道阿胶中的小分子代谢物主要为氨基酸类、核苷酸类成分，从前人报道中收集离子对列表，并结合预测选择反应检测模式(srm)结果增强子离子扫描模式(epi)检测阿胶中的小分子代谢物。从已有文献报道中广泛收集离子对、ce和dp信息，构建预测srm信息采集列表，共收集代谢物质谱信息58条，相应地构建了58对离子对，具体信息见表1。
[0072]
表1：58对小分子代谢物定性离子对信息表
[0073]
[0074]
[0075][0076]
色谱条件如下：色谱柱为watersacquityuplchsst3色谱柱(100
×
2.1mm，1.8μm，美国waters公司)，进样体积2μl，流速0.25ml/min。以0.1％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序为0
–
2min，0％b；2
–
7min，0％
–
35％b；7
–
8min，35％
–
90％b；8
–
8.1min，90％
–
0％b；8.1
–
11min，0％b。柱温为40℃。
[0077]
离子源参数设置如下：正离子模式采集，雾化器、加热器、气帘气或碰撞气体均为n2；雾化器气体(gs1)：55psi；加热器气体(gs2)：55psi；帘式气体：30psi；离子喷雾针电压：5500v；碰撞激活解离(cad)气体：高；离子化温度(tem)550℃；射入电压(ep)10v，碰撞室射出电压(cxp)13v；脱簇电压(dp)45v，采用srm-ida-epi扫描模式。对于epi扫描，ida阈值为2000cps，ce为30ev，ces为15ev。
[0078]
1.3.3目标分析物的选择及质谱参数在线优化
[0079]
在定性分析的基础上，选取匹配度好、响应值高的7个多肽和13个小分子代谢物作为目标分析物。各目标多肽的准分子离子均为双电荷，分子量在393.2～765.9da之间。
[0080]
以sgqpgtvgpagvr为例，简述方法建立的过程。以其双电荷准分子离子峰([m+2h]
2+
)m/z591.82为母离子，单电荷离子碎片m/z910.51(y
10+
)、m/z813.46(y
9+
)、m/z756.44(y
8+
)、m/z655.39(y
7+
)、m/z556.32(y
6+
)和m/z499.30(y
5+
)构建6对候选离子对：m/z591.82
→
910.51，m/z591.82
→
813.46，m/z591.82
→
756.44，m/z591.82
→
655.39，m/z591.82
→
556.32和m/z591.82
→
499.30。进一步衍生6组伪离子对(pseudo-ion transitions，pits)，分别为m/z591.820
→
910.510，m/z591.820
→
910.511，m/z591.820
→
910.512，等；m/z591.820
→
813.460，m/z591.820
→
813.461，m/z591.820
→
813.462，等；m/z591.820
→
756.440，m/z591.820
→
756.441，m/z591.820
→
756.442，等；m/z591.820
→
655.390，m/z591.820
→
655.391，m/z591.820
→
655.392，等；m/z591.820
→
556.320，m/z591.820
→
556.321，m/z591.820
→
556.322，等；m/z591.820
→
499.300，m/z591.820
→
499.301，m/z591.820
→
499.302，等。对于每一组伪离子对，均对应能量在5～80ev范围内梯级变化的ce(步长为3ev)。不同碰撞能产生不同的相对响应值，将每组伪离子对的相对响应值均导入graphpadprism7.0软件中(graphpad,sandiego,ca)，通过gaussian曲线拟合离子对的裂解曲线，拟合曲线的顶点对应的碰撞能为最佳碰撞能(oce)。选择响应最佳的两对离子对m/z591.82
→
910.51和m/z591.82
→
556.32作为候选离子对构建ms3扫描方法。
[0081]
设置q3和q
lit
为相同离子，并设置较低的激发能量(af2＝0.005v)进行mrm3扫描。以sgqpgtvgpagvr为例，构建离子对m/z591.82
→
910.51
→
910.51与m/z591.82
→
556.32
→
556.32分别为定性离子对和定量离子对进行mrm3扫描。最终，建立了13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对的mrm3方法，其质谱参数见表2。
[0082]
表2：阿胶的13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对信息
[0083][0084][0085]
注：p代表羟基化修饰的脯氨酸
[0086]
1.4di-mrm3与di-mrm(对照组)测定
[0087]
阿胶酶解样品不经色谱柱分离，采用一个外置的注射泵(kds100,kdscientific,holliston,ma)通过peek管线直接引入sciexqtrap-ms质谱仪配备的esi离子源中。离子源参数如下：正离子模式采集，雾化器、加热器、气帘气或碰撞气体均为n2；雾化器气体(gs1)：14psi；加热器气体(gs2)：0psi；帘式气体：20psi；离子喷雾针电压：5500v；碰撞激活解离(cad)气体：high；离子化温度(tem)100℃。流速设为10μl/min。采集模式为ms3扫描(即mrm3)。mrm3扫描参数设置为：center，窗口为
±
2da，ce为各离子优化的oce，af2能量设置为0.005v，fixedtime设置为100ms，激发时间设置为50ms，勾选q0trap。
[0088]
相同的样品采用同样的方式引入qtrap-ms质谱仪，质谱采集模式为mrm扫描，其余参数与mrm3扫描设置相同。
[0089]
2实验结果
[0090]
2.1阿胶定性分析结果
[0091]
阿胶提取后，采用胰蛋白酶水解获得阿胶酶解样品，并采用nanolc-ltq-orbitrap-ms对阿胶进行鸟枪蛋白质组学分析，采集的多肽谱如图1a所示，结合proteomediscoverer v.1.4软件分析与donkeyswiss-protfasta数据库检索，初步发现来源于2个蛋白的47个多肽。
[0092]
通过质谱的碎片信息对多肽进行鉴定，以多肽5(tr＝20.21min)为例，其双电荷准分子离子峰([m+2h]
2+
)为m/z591.8168(图1b)，单电荷离子碎片信息为m/z1008.56、910.52、852.42、813.48、756.47、684.31、655.40、627.32、556.34、528.30、499.30、331.21、273.09、175.09，分别归属为b
12+
、y
10+
、b
10+
、y
9+
、y
8+
、b
8+
、y
7+
、b
7+
、y
6+
、b
6+
、y
5+
、y
3+
、b
3+
和y
1+
，结合数据库对比分析，推测该多肽序列为sgqpgtvgpagvr。最终从中归属了7个多肽片段，具体信息见表3并用于进一步的分析。
[0093]
表3：阿胶7个多肽保留时间、氨基酸序列、ms1、误差值及ms2碎片信息
[0094]
[0095][0096]
采用lc-srm对阿胶样品中的小分子代谢物进行检测，从中选取响应好的13个化合物作为阿胶的目标分析物，并结合质谱信息和数据库比对进行结构注释。
[0097]
2.mrm3方法建立
[0098]
为获得较好的灵敏度，采用质谱参数在线优化策略优化多肽及小分子代谢物的离子对以及ce值。多肽类成分一起双电荷准分子离子峰为母离子，单电荷离子碎片构建离子对，构建候选离子对，并优化其ce值。以sgqpgtvgpagvr为例，共构建了6对候选离子对，各离子对的裂解曲线如图2所示，最终选择响应最好的两对离子对m/z591.82
→
910.51和m/z591.82
→
556.32作为sgqpgtvgpagvr的mrm离子对进行进一步的方法构建。最终选择了7个多肽序列的14个mrm离子对和13个小分子代谢物的13个mrm离子对用于方法构建。
[0099]
尝试了采用lc-ms3模式采集多肽和小分子代谢物的ms3碎片。然而，小分子代谢物的ms2碎片较为稳定难以裂解，又或其ms3碎片m/z值不在ms3模式的扫描范围内；多肽虽然能产生ms3碎片，但其响应过低，信噪比无法达到后续实验要求。因此，为提高检测灵敏度，建立mrm3方法时，对于多肽和小分子代谢物，设置其q3和q
lit
值相同，为了减少其裂解，设置了较低的af2(0.005v)进行扫描。采集的lc-mrm3典型色谱图如图3所示，各化合物的信噪比均符合分析要求，为后续di-mrm3检测的专属性奠定了基础。
[0100]
3.di-mrm3技术与di-mrm技术对比分析结果
[0101]
di-mrm3典型总离子流图如图4a所示，对于整个分析过程，tic图可以分为三个阶段，即阶段
ⅰ‑ⅲ
。管路中的溶剂首先进入质谱产生基质范围(阶段ⅰ)，随后的爬升阶段对应混合载体溶剂和样品(阶段ⅱ)，最后在管路中完全平衡形成稳定阶段(阶段ⅲ)。选择阶段ⅲ的平均强度曲线扣除阶段ⅰ的平均强度曲线，生成数据集，其mrm3平均质谱响应如图4b所示。di-mrm的典型tic图和平均响应质谱图见图5a和b。相较于di-mrm，di-mrm3的多肽和小分子代谢物的平均质谱响应显著提升，提高了检测的灵敏度。此外di-mrm3实现了多肽和小分子代谢物的同步分析，可以应用于同时分析小分子代谢物与多肽的靶向双组学。
[0102]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述方法是通过lc-mrm技术将阿胶供试品溶液进行质谱参数在线优化，在定性分析的基础上选取匹配度好、响应值高的多肽和小分子代谢物作为目标分析物，并进一步构建了7个多肽序列的14个mrm3离子对和13个小分子代谢物的13个mrm3离子对的di-mrm3检测方法。2.根据权利要求1所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：提取阿胶溶液并酶解，得到阿胶酶解溶液作为供试品溶液；(2)在线参数优化色谱条件：色谱柱为watersacquityuplchsst3色谱柱，100
×
2.1mm，1.8μm；进样体积2μl，流速0.25ml/min；以0.1％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱；柱温为40℃；(3)在线参数优化离子源参数设置条件：正离子模式采集，雾化器、加热器、气帘气或碰撞气体均为n2；雾化器气体gs1为55psi；加热器气体gs2为55psi；帘式气体为30psi；离子喷雾针电压为5500v；碰撞激活解离cad气体为high；离子化温度tem为550℃；射入电压ep为10v，碰撞室射出电压cxp为13v；脱簇电压dp为45v，采用srm-ida-epi扫描模式；对于epi扫描，ida阈值为2000cps，ce为30ev，ces为15ev；(4)阿胶多肽色谱条件：色谱柱为easy-spray
tm
c
18
，100
×
0.75mm，3μm；进样体积2μl，流速300nl/min；以0.1％甲酸水为流动相a，0.1％甲酸乙腈为流动相b进行梯度洗脱；图谱采集时间为85min；(5)阿胶多肽离子源参数设置条件：质谱检测采用esi正离子化模式，喷雾电压为4.5kv，鞘气流速为30arp，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；ms1谱图通过ftms模式获取，扫描范围设定为350～2000da，分辨率为60000fwhm；ms2谱图通过itms模式采集，分辨率为7500fwhm。(6)将供试品溶液分别按照上述步骤(2)和(3)的方法进样以小分子代谢物的母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为小分子代谢物伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到小分子代谢物伪离子对的相对响应值；(7)将供试品溶液分别按照上述步骤(4)和(5)的方法进样，获得其高分辨质谱信息，结合swiss-prot检索进行多肽定性分析，获得多肽氨基酸序列以及质谱ms1和ms2信息；再按照上述步骤(2)和(3)的方法进样，取双电荷准分子离子峰为母离子，以母离子和子离子的离子碎片构建离子对，进而衍生为多肽伪离子对，每组伪离子对分别对应5～80ev范围内梯级变化的ce，步长为3ev，不同碰撞能产生不同的相对响应值，得到多肽伪离子对的相对响应值；(8)将步骤(6)和(7)的小分子代谢物伪离子对和多肽伪离子对的相对响应值均导入graphpadprism7.0软件中，通过gaussian曲线拟合离子对的裂解曲线，拟合曲线的顶点对应的碰撞能为最佳碰撞能oce，小分子代谢物选择响应最佳的一对离子对，多肽选择响应最佳的两对离子对，以母离子、子离子和子离子构建mrm3离子对，最终建立13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对的mrm3方法；(9)选取步骤(8)中的13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对作为目标分析物，利用di的方式将供试品溶液直接引入质谱仪配备的电喷雾esi离子源中进行分
离，采用mrm3扫描进行定性定量分析。3.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密称取阿胶样品约0.1g，加入10ml含1％nh4hco3的水溶液，超声提取30min，提取后的样品溶液以12000rpm离心10min后，每90μl上清液加入10μl的1μg/μl的胰蛋白酶溶液，在37℃和200r/min的条件下，摇床上恒温酶解16h后，加入0.1％的甲酸，终止反应，经12000rpm离心15min后，以0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。4.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，洗脱程序为0
–
2min，0％b；2
–
7min，0％
–
35％b；7
–
8min，35％
–
90％b；8
–
8.1min，90％
–
0％b；8.1
–
11min，0％b。5.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，洗脱程序为0
–
65min，5％
–
30％b；65
–
75min，30％
–
50％b；75
–
85min，50％
–
95％b。6.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(8)中，13个小分子代谢物的13个离子对和7个多肽的14个离子对为：
7.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(9)中，电喷雾esi离子源的参数设置如下：正离子模式下采集，雾化器气体gs1为14psi，加热器气体gs2为0psi，帘式气体为20psi，离子喷雾针电压为5500v，碰撞激活解离cad气体为high，离子化温度tem为100℃，流速设为10μl/min。8.根据权利要求2所述的阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法，其特征在于：所述步骤(9)中，mrm3扫描参数设置为：center，窗口为
±
2da；af2能量设置为0.005v；ce为各离子对在线优化的oce值；fixedtime设置为100ms；激发时间设置为50ms；勾选q0trap。

技术总结
本发明公开了阿胶中的特征多肽和小分子代谢物同步快速分析的方法。所述方法是通过LC-MRM技术将阿胶供试品溶液进行质谱参数在线优化，在定性分析的基础上选取匹配度好、响应值高的多肽和小分子代谢物作为目标分析物，进一步构建了7个多肽序列的14个MRM3离子对和13个小分子代谢物的13个MRM3离子对的DI-MRM3检测方法，该方法专属性更强，灵敏度更高。灵敏度更高。灵敏度更高。


技术研发人员：张仕林 李婷 刘莉 宋月林 毛松 李军 吴金华 赵云芳 熊松 郭梦秋
受保护的技术使用者：贵州汉方药业有限公司
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/7/20