非特异性过氧合酶MroUPO的表达方法及其应用

非特异性过氧合酶mroupo的表达方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种非特异性过氧合酶mroupo的表达方法及其应用。


背景技术：

2.在香料家族中麝香最受青睐，其中大环内酯类香料在麝香占关键地位，其香气温和优雅，具有良好的定香能力，因此被广泛应用于食品、日化用品、烟草等重要领域。目前大环内酯类香料的生产制备方法包括：化学合成法，提取法及生物合成法。随着人们食品安全意识的增强和对健康理念的崇尚，天然来源的香精香料比纯化学合成来源的更受消费者的青睐。但提取法受限于天然动植物中含量低，在产业化时面临诸多问题；相比化学法，酶法合成香精香料具有反应条件温和、产物对映体选择性好、纯度高等优点，是未来大环内酯香料制备一个重要的发展方向。
3.酶法合成大环内酯香料关键步骤在于脂肪酸的末端定向羟基化修饰上。现有报道中，可催化脂肪酸加羟基的酶主要集中在水合酶类和p450单加氧酶类。其中水合酶催化效率较高且产物单一，但其只能羟化不饱和脂肪酸的双键，催化底物范围较窄。而p450单加氧酶在反应过程中需要添加昂贵辅酶因子nad(p)h，或需要与辅因子再生体系联用，反应路线相对复杂。高昂的反应和设备成本极大地限制了p450单加氧酶在末端羟基脂肪酸工业化生产中的应用。因此，采用水合酶或p450单加氧酶进行酶法合成大环内酯香料的方式难以满足食品与日化工业对大环内酯香料的极大需求。
4.mroupo是一种来源于小应伞菌(marasmius rotula)的非特异性过氧合酶，是医药中间体合成、香精香料合成、农副产品生物加工和环境治理等领域重要的一类酶，但该酶的异源表达较为困难，且其表达量及酶活力依然很低。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种非特异性过氧合酶mroupo在合成大环内酯反应中的应用，该非特异性过氧合酶mroupo能够与脂肪酶构建催化脂肪酸合成大环内酯的新反应体系。
6.实现上述目的包括如下技术方案。
7.本发明第一方面提供一种非特异性过氧合酶mroupo与脂肪酶在催化脂肪酸合成大环内酯反应中的应用，所述非特异性过氧合酶mroupo的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.在其中一些实施例中，所述非特异性过氧合酶mroupo的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明第二方面提供一种脂肪酸合成大环内酯的方法，包括如下步骤：
10.步骤a、在反应体系中加入非特异性过氧合酶mroupo、过氧化氢和脂肪酸底物进行催化羟基化反应得到脂肪酸末端羟基化产物；
11.步骤b、在脂肪酸末端羟基化产物中加入脂肪酶催化合成大环内酯。
12.在其中一些实施例中，所述步骤a的反应体系中，所述脂肪酸为30μl/ml～50μl/ml，非特异性过氧合酶mroupo为200μl/ml～600μl/ml，过氧化氢为90μl/ml～110μl/ml。
13.在其中一些实施例中，所述步骤b中，包括如下步骤：
14.将所述脂肪酸末端羟基化产物用甲基叔丁基醚萃取得到萃取液，并将萃取液旋蒸得到旋蒸产物；
15.将旋蒸产物用正己烷溶解后加入变色硅胶和脂肪酶进行反应得到大环内酯产物。
16.在其中一些实施例中，所述脂肪酸的碳原子数为14～16的饱和直链脂肪酸。
17.在其中一些实施例中，所述脂肪酸的碳原子数为14的饱和直链脂肪酸。
18.在其中一些实施例中，所述脂肪酶是脂肪酶novozyme435。
19.本发明第三方面提供一种如上所述的非特异性过氧合酶mroupo的表达方法，包括如下步骤：
20.构建非特异性过氧合酶mroupo重组工程菌；
21.制备非特异性过氧合酶mroupo重组工程菌株种子液；
22.将种子液接种到发酵培养基中进行培养，发酵培养基中葡萄糖耗尽时开始流加补料培养基，并加入诱导剂诱导培养，其中，诱导培养的温度为18-25℃，ph值为6.3-7.5，诱导剂浓度为0.15-0.3，od600为25～35。
23.在其中一些实施例中，所述诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；和/或，所述工程菌为大肠杆菌。
24.在其中一些实施例中，诱导培养温度为19-22℃，ph值为6.3-6.7，诱导剂浓度为0.18-0.22，od600为28～32。
25.在其中一些实施例中，种子液在发酵培养基的培养温度为36℃～38℃，ph值为6.8-7.2，溶氧百分数为28％～32％。
26.本发明中，挖掘了一种来源于marasmius rotula的非特异性过氧合酶mroupo，发现以该非特异性过氧合酶mroupo作为催化剂，能够催化脂肪酸进行脂肪酸末端羟基化修饰，催化得到的末端羟基化修饰的反应产物再以脂肪酶为催化剂进行酯化反应后能够生成大环内酯；由此可知，该非特异性过氧合酶mroupo能够与脂肪酶构建合成大环内酯的新反应体系，为酶法合成大环内酯提供了一种新的技术基础与思路。
27.此外，在对非特异性过氧合酶mroupo的发酵过程的研究中，通过构建非特异性过氧合酶mroupo重组菌，并通过对非特异性过氧合酶mroupo重组菌发酵的条件进行优化，实现产非特异性过氧合酶mroupo重组菌的高密度发酵，从而实现非特异性过氧合酶mroupo的高效表达，为非特异性过氧合酶mroupo的工业化生产提供了理论依据。
附图说明
28.图1是实施例1的pet23a-mroupo重组质粒图谱；
29.图2是实施例2的mroupo纯化过程中各组分sds-page结果图；其中泳道m：蛋白marker；泳道1：总菌经破碎后蛋白样品；泳道2：总菌经破碎后离心沉淀蛋白样品；泳道3：粗酶液蛋白样品；泳道4：经镍柱纯化时穿过液蛋白样品；泳道5-6：经buffer b洗脱后蛋白样品。
30.图3是实施例2的od600对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响结果图。
31.图4是实施例2的诱导温度对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响结果图。
32.图5是实施例2的诱导剂iptg浓度对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响结果图。
33.图6是实施例2的诱导ph值对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响结果图。
34.图7是实施例3的大环内酯香料的合成路线图。
35.图8是14-羟基十四烷酸的总离子色谱图。
36.图9是实施例3的mroupo催化十四烷酸末端羟基化反应后产物的14-羟基十四烷酸的提取离子色谱图。
37.图10是15-羟基十五烷酸的总离子色谱图。
38.图11是实施例3的mroupo催化十五烷酸末端羟基化反应后产物的15-羟基十五烷酸的提取离子色谱图；
39.图12是16-羟基棕榈酸的总离子色谱图。
40.图13是实施例3的mroupo催化棕榈酸末端羟基化反应后产物的16-羟基棕榈酸的提取离子色谱图。
具体实施方式
41.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
42.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
43.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
44.本发明公开一种非特异性过氧合酶mroupo与脂肪酶在催化脂肪酸合成大环内酯反应中的应用。
45.其中，非特异性过氧合酶mroupo是一种来源于小应伞菌(marasmius rotula)的非特异性过氧合酶，以非特异性过氧合酶mroupo(以下简称为mroupo)作为催化剂能够催化脂肪酸进行脂肪酸末端羟基化修饰，催化得到的末端羟基化修饰的反应产物再以脂肪酶为催化剂进行酯化反应后能够生成大环内酯；而非特异性过氧合酶gmaupo是对脂肪酸的ω-1和ω-2位置发生羟基化反应，并非是对脂肪酸的末端位置催化形成羟基化产物，无法和脂肪酶级联反应生成该大环内酯。由此可知，该非特异性过氧合酶mroupo能够与脂肪酶构建合成大环内酯的新反应体系，为酶法合成大环内酯提供了一种新的技术基础与思路。
46.其中，该mroupo的氨基酸序列如seq id no.1所示。
47.seq id no.1：
48.sahpwkapgpndsrgpcpglntlanhgflprngrnisvpmivkagfegynvqsdililagkigmltsreadtisledlklhgtiehdaslsredvaigdnlhfneaifttlansnpgadvynissaaqvqhdrladslarnpnvtntdltatirssesaffltvmsagdplrgeapkkfvnvffreermpikegwkrsttpitipllgpiieritelsdw
kptgdncgaivlspel。
49.该mroupo的核苷酸序列如seq id no.2所示。
50.seq id no.2：
51.tctgctcacccgtggaaagcgccgggtccgaacgatagccgtggtccgtgtccgggtctgaacaccctggcaaaccacggttttctgccgcgtaacggtcgtaacatcagcgtgccgatgattgttaaagctggttttgaaggctacaacgttcagtctgatattctgattctggcgggtaagatcggtatgctgacttctcgtgaagcggataccatcagcctggaagatttaaaactgcatggcaccatcgaacacgatgcgagcctgagcagggaagatgttgcgattggagataacctgcacttcaacgaagcgatcttcaccaccctggcgaactctaacccaggcgcggatgtttacaacatcagcagcgctgcgcaggttcagcacgatcgtctggcggatagtctggcgcgcaacccgaacgttaccaacaccgatctgaccgcgaccatccgttcgagcgaatctgcgttcttcctgacggttatgtctgctggtgatccgctgcgtggtgaagcgccgaaaaaatttgttaacgttttcttccgtgaagaacgtatgccgatcaaagaaggttggaaacgttctaccaccccgatcaccatcccgctgctgggtccgatcatcgaacgtatcaccgaactgtccgattggaaaccgaccggtgataactgcggtgcaatcgttctgtctccggaactg。
52.本发明还公开一种如上所述的mroupo的高效表达方法，包括如下步骤：
53.构建mroupo重组工程菌；
54.制备mroupo重组工程菌株种子液；
55.将种子液接种到发酵培养基中进行培养，发酵培养基中葡萄糖耗尽时开始流加补料培养基和诱导剂诱导培养，其中，诱导培养温度为22-27℃，ph值为6-8，诱导剂浓度为0.08-0.2，菌浓od600为25～35。
56.上述，通过构建mroupo重组菌，并通过对mroupo重组菌发酵的条件(温度、ph值、诱导剂浓度和od600)进行优化，实现产mroupo重组菌的高密度发酵，从而实现mroupo的高效表达。
57.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
58.材料与试剂：基因mroupo和空载质粒pet23a均为本实验室保存；大肠杆菌top10和bl21(de3)感受态细胞，唯地生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒，中美泰和生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；所有的化学药品均购自sigma-aldrich、tci或阿拉丁公司，其纯度最高，无需进一步提纯即可使用。
59.lb液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，去离子水加至1000ml。
60.自诱导培养基：10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g甘油，0.5g葡萄糖，2g乳糖，10.65g na2hpo4，10.21g kh2po4，8.02g nh4cl，2.13g na2so4，0.72gmgso4，去离子水加至1000ml。
61.发酵培养基：10.56g葡萄糖，11.5g酵母提取物，19.5g蛋白胨，4g硫酸铵，0.98g一水柠檬酸，18g三水磷酸氢二钾，3g磷酸二氢钾，2.46g七水硫酸镁，1ml微量元素，加水至1000ml。
62.实施例1mroupo重组菌的构建
63.(1)pet23a-mroupo重组质粒构建
64.使用rcr技术扩增pet23a空载体和目的基因mroupo，pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最终72℃延伸10min。并使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒和sanpre柱式pcr产物纯化试剂盒分别对扩增产物进行胶回收和纯化。使用无缝克隆技术将目的基因克隆至大肠杆菌蛋白表达载体pet23a中得到
pet23a-mroupo重组质粒，该pet23a-mroupo重组质粒图谱如图1所示。
65.(2)mroupo重组工程菌的构建
66.将上述pet23a-mroupo的无缝克隆产物通过热激转化法转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中得到pet23a-mroupo-bl21(de3)，即上述的mroupo重组工程菌。具体步骤如下：将感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上5-10min，待其融化后加入无缝克隆产物10μl，于冰上静置30min。取出静置后的感受态细胞置于预热至42℃的水浴锅中，热激90s后立即置于冰上，2-3min后加入750μl的lb培养基，37℃、220rpm培养40min。培养完成后，1000rpm、3min离心去掉一定比例上清，将感受态细胞涂布于含有100μg/ml氨苄的lb固体平板上，培养12-16h。挑取单克隆进行菌落pcr反应以验证是否正确转化，将阳性克隆子进行测序以进一步验证突变是否正确。最后将构建完成的pet23a-mroupo-bl21(de3)工程菌于-20℃保存于30％甘油中，备用。
67.实施例2mroupo的高效制备
68.(1)mroupo的发酵与纯化
69.在超净工作台中挑取pet23a-mroupo-bl21(de3)甘油保藏菌划线活化于lb固体培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃静置培养12-15h。挑取单菌落转接至5ml lb液体培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃、220rpm培养12h。取1ml菌液于100ml lb液体培养基中，37℃、200rpm培养2-3h。取25ml菌液于500ml自诱导培养基中，21℃、200rpm培养24h，诱导完成后将菌液于5000rpm离心30min收菌，弃去上清培养基，得到菌体。用buffer a(20mm tris-hcl缓冲液ph 8.0,150mm nacl)以1:10(w/v)重悬菌体，于冰上超声破碎25min。菌体破碎完全后，于12000rpm离心25min，收集上清，得到mroupo粗酶液。将mroupo粗酶液于12000rpm、4℃离心25min，弃去沉淀。将离心后的上清上载至使用buffer a充分平衡后的ni亲核层析色谱柱上，先以30mm咪唑洗脱杂蛋白，再以500mm咪唑洗脱目的蛋白并收集，将洗脱的各组分进行sds-page检测及活性检测，如图2所示，在27kda有条带，分子量大小正确，有活性的蛋白洗脱液合并进行脱盐柱换盐至buffer c(20mm tris-hcl缓冲液ph 7.5)，4℃保存备用。
70.(2)产mroupo的pet23a-mroupo-bl21(de3)的高密度发酵
71.接种前调整发酵液温度到37℃，校准溶氧，调节ph至7.0，将pet23a-mroupo-bl21(de3)的种子液按5％(v/v)(300ml)接种量转接至发酵培养基中，在37℃和ph 7.0(通过流加氨水控制)下培养，初始转速300r/min，通气量为4l/min，通过调节搅拌转速和空气流速使溶氧百分数维持在30％，发酵培养基中葡萄糖耗尽时(ph上升时)开始流加补料培养基(葡萄糖)，诱导产酶，整个发酵过程每3h取样测定湿重、od600、酶活和发酵液中葡萄糖含量，保证葡萄糖残留量低于5g/l，诱导24h或湿重开始下降时结束发酵，离心收集菌体放于-20℃冰箱冻存。
72.发酵过程中od600对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响：选择3个od600：10、20、30对产mroupo的pet23a-mroupo-bl21(de3)的高密度发酵的反应条件进行优化，步骤如实施例2(2)所示，并控制诱导剂iptg浓度为0.1mm，诱导温度为25℃，诱导ph值为7,每隔三小时取样测定细胞湿重、酶活力和发酵液残余葡萄糖含量。结果如下图3所示，其中，od60：10代表图3中的对数生长前期，od60：20代表图3中的对数生长中期，od60：30代表图3中的对数生长后期。由图3可知，在对数生长后期开始诱导的重组菌生长速率明显高于对数
生长前期和对数生长中期开始诱导的重组菌，对数生长后期开始诱导发酵过程细胞湿重最高达到135.6g/l，分别是对数生长前期和对数生长中期的1.2和1.1倍。与此相一致的，对数生长后期开始诱导酶活力最高，达到9.67u/l，分别是对数生长前期和对数生长中期的1.5和1.2倍。同时，对数生长后期开始诱导发酵液中的葡萄糖积累量最低。由此可知，od600数值为30时效果最优。
73.发酵过程中诱导温度对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响：选择5个诱导温度：18℃、20℃、25℃、30℃、37℃对产mroupo的pet23a-mroupo-bl21(de3)的高密度发酵的反应条件进行优化，步骤如实施例2(2)所示，并控制诱导剂iptg浓度为0.1mm，诱导od600为30，诱导ph值为7,每隔三小时取样测定细胞湿重、酶活力和发酵液残余葡萄糖含量。结果如下图4所示。由图4可知，当诱导温度为20℃时，菌体生长正常，重组菌的细胞湿重最多达到139.67g/l，酶活力为14.2u/l，发酵液中葡萄糖残余量为3.06g/l，随着诱导温度增加，当诱导温度为25℃、30℃和37℃时，细胞湿重分别提高了2.24％、4.72％和8.61％，发酵液中葡萄糖余量也随着诱导温度的升高而降低，酶活分别是诱导温度20℃时酶活的80.84％、69.51％和60.98％，这是由于诱导温度过高，细胞生长速率过快，导致多肽合成速率快于折叠修饰速率形成了大量没有活性的包涵体。当诱导温度为18℃时，细胞湿重和酶活力均低于诱导温度20℃时，分别为诱导温度20℃时的89.28％和67.87％，这是由于诱导温度过低，重组菌生长缓慢，从而导致蛋白表达量降低。由此可知，诱导温度为20℃时效果最优。
74.发酵过程中诱导剂iptg浓度对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响：选择5个诱导剂iptg浓度：0.1mm、0.2mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm对产mroupo的pet23a-mroupo-bl21(de3)的高密度发酵的反应条件进行优化，步骤如实施例2(2)所示，并控制诱导od600为30，诱导温度为25℃，诱导ph值为7,每隔三小时取样测定细胞湿重、酶活力和发酵液残余葡萄糖含量。结果如下图5所示。由图5可知，当诱导剂浓度为0.2mm时，菌体生长正常，重组菌的细胞湿重最多达到138.9g/l，酶活力为16.62u/l，发酵液中葡萄糖残余量为2.59g/l，随着诱导剂浓度增加，当诱导剂浓度为0.4mm、0.6mm和0.8mm时，细胞湿重分别降低了8.13％、18.5％和25.38％，发酵液中葡萄糖余量也随着诱导剂浓度的升高而升高，酶活分别是诱导剂浓度0.2mm时酶活的68.23％、43.8％和34.78％，这是由于诱导强度大造成菌体过重的代谢负担，导致重组菌生长缓慢从而目的蛋白产量减少，当诱导剂浓度为0.1mm时，细胞湿重为143.7g/l高于诱导剂浓度为0.2mm时细胞湿重，然而酶活力低于诱导剂浓度为0.2mm时的酶活，这是由于诱导强度过低，导致蛋白表达量降低。由此可知，诱导剂浓度为0.2mm时效果最优。
75.发酵过程中诱导ph值对pet23a-mroupo-bl21(de3)产mroupo的影响：选择5个ph值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，对产mroupo的pet23a-mroupo-bl21(de3)的高密度发酵的反应条件进行优化，步骤如实施例2(2)所示，并控制诱导剂iptg浓度为0.1mm，诱导od600为30，诱导温度为25℃，每隔三小时取样测定细胞湿重、酶活力和发酵液残余葡萄糖含量。结果如下图6所示。由图6可知，当诱导ph为7时细胞湿重最高为145.83g/l，酶活力最高达到13.48u/l，同时发酵液中葡糖糖残余量为2.38g/l。当ph为7.5和8.0时，湿重迅速下降，分别为诱导ph为7时细胞湿重的91.86％和85.26％，最高酶活力为诱导ph为7时的80.34％和63.5％，同时发酵液中葡萄糖残余量随着诱导ph提高而增加。当ph低于7.0时，诱导ph为6.5时，细胞湿重为诱导ph为7时细胞湿重的94.29％，酶活却是诱导ph为7时的1.53倍，但诱导
ph再次降低为6时，细胞湿重和酶活力均偏低，分别是诱导ph7时的85.26％和73.37％。由此可知，诱导ph为6.5时效果最优。
76.实施例3大环内酯香料的合成
77.本实施例中，大环内酯香料的合成路线如下图7所示。
78.(1)mroupo催化脂肪酸末端羟基化反应
79.按照如下表1所示的反应体系分别进行mroupo催化十四烷酸、十五烷酸和棕榈酸的末端羟基化反应，样品用gc-ms检测。脂肪酸及其产物的分析采用岛津tq 8050气相色谱质谱联用仪(shimadzu technologies,japan)，装载岛津sh-rxi-5sil ms色谱柱(30m
×
0.25mm,i.d.0.25μm)。氦气作为载气，载气流量0.8ml/min，进样体积为1μl，进样口温度为280℃，分流比为100：1，离子源温度230℃，接口温度300℃，溶剂延迟时间4min。初始温度50℃，保持2min，然后以20℃每分钟升至250℃，保留12min。通过标准品质量碎片法鉴定化合物，并将其质谱与wiley和nist文库的质谱进行比较。mroupo催化十四烷酸、十五烷酸和棕榈酸的末端羟基化反应的效果如下表2和图8-13所示。
80.表1mroupo催化脂肪酸羟基化反应
[0081][0082]
表2mroupo催化脂肪酸末端羟基化效果
[0083]
底物产率(mm)转化率(％)十四烷酸0.08388.38十五烷酸0.07047.04棕榈酸0.06286.28
[0084]
由表2和图8-13可知，mroupo能够催化十四烷酸、十五烷酸和棕榈酸的末端羟基化反应，且催化十四烷酸的转化率最高，转化率可达8.38％，其次是十五烷酸，转化率为7.04％，最后是棕榈酸，转化率为6.28％。
[0085]
(2)脂肪酶内酯化羟基脂肪酸反应
[0086]
羟基化反应结束后，催化十五烷酸和棕榈酸末端羟基化反应所得样品分别用等体积的mtbe萃取，萃取液用旋转蒸发仪蒸干，旋蒸产物用10ml正己烷溶解。向正己烷中加入1g变色硅胶和1g脂肪酶novozymes 435，40℃，反应10h。反应结束后，样品用gc-ms检测。脂肪酸及其产物的分析采用岛津tq 8050气相色谱质谱联用仪(shimadzu technologies,japan)，装载岛津sh-rxi-5sil ms色谱柱(30m
×
0.25mm,i.d.0.25μm)。氦气作为载气，载气流量0.8ml/min，进样体积为1μl，进样口温度为280℃，分流比为100：1，离子源温度230℃，
接口温度300℃，溶剂延迟时间4min。初始温度50℃，保持2min，然后以20℃每分钟升至250℃，保留12min。通过标准品质量碎片法鉴定化合物，并将其质谱与wiley和nist文库的质谱进行比较，成功生成相应的环十五内酯和环十六内酯，且其转化率如下表3所示。
[0087]
表3脂肪酶催化末端羟基脂肪酸生成麝香大环内酯反应结果
[0088]
产物产率(mg/l)转化率(％)环十五内酯2934.27环十六内酯2328.8
[0089]
由表3可知，环十五内酯的转化率为34.27％，环十六内酯的转化率为28.8％。
[0090]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0091]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.非特异性过氧合酶mroupo与脂肪酶在催化脂肪酸合成大环内酯反应中的应用，所述非特异性过氧合酶mroupo的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非特异性过氧合酶mroupo的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种脂肪酸合成大环内酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、在反应体系中加入非特异性过氧合酶mroupo、过氧化氢和脂肪酸底物进行催化羟基化反应得到脂肪酸末端羟基化产物；步骤b、在脂肪酸末端羟基化产物中加入脂肪酶催化合成大环内酯。4.根据权利要求3所述的脂肪酸合成大环内酯的方法，其特征在于，所述步骤a的反应体系中，所述脂肪酸为30μl/ml～50μl/ml，非特异性过氧合酶mroupo为200μl/ml～600μl/ml，过氧化氢为90μl/ml～110μl/ml。5.根据权利要求3所述的脂肪酸合成大环内酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸的碳原子数为14～16的饱和直链脂肪酸。6.根据权利要求5所述的脂肪酸合成大环内酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸的碳原子数为14的饱和直链脂肪酸。7.根据权利要求3至5任一项所述的脂肪酸合成大环内酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶是脂肪酶novozyme435。8.一种权利要求1所述的非特异性过氧合酶mroupo的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：构建非特异性过氧合酶mroupo重组工程菌；制备非特异性过氧合酶mroupo重组工程菌株种子液；将种子液接种到发酵培养基中进行培养，发酵培养基中葡萄糖耗尽时开始流加补料培养基，并加入诱导剂诱导培养，其中，诱导培养的温度为18-25℃，ph值为6.3-7.5，诱导剂浓度为0.15-0.3，od600为25～35。9.根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；和/或，所述工程菌为大肠杆菌。10.根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于，诱导培养温度为19-22℃，ph值为6.3-6.7，诱导剂浓度为0.18-0.22，od600为28～32；和/或，种子液在发酵培养基的培养温度为36℃～38℃，ph值为6.8-7.2，溶氧百分数为28％～32％。

技术总结
本发明公开了一种非特异性过氧合酶MroUPO与脂肪酶在催化脂肪酸合成大环内酯反应中的应用，以及该非特异性过氧合酶MroUPO的表达方法；其中该非特异性过氧合酶MroUPO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该非特异性过氧合酶MroUPO能够催化脂肪酸进行脂肪酸末端羟基化修饰，催化得到的末端羟基化修饰的反应产物再以脂肪酶为催化剂进行酯化反应后能够生成大环内酯。在该非特异性过氧合酶MroUPO的表达方法中，通过构建MroUPO重组菌，并通过对MroUPO重组菌发酵的条件进行优化，实现产MroUPO重组菌的高密度发酵，从而实现MroUPO的高效表达，为MroUPO的工业化生产提供了理论依据。据。


技术研发人员：张皓 马云建 王永华 蓝东明 杨博 高文宏
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/7/20