一种近红外发光Nd和Yb同步高掺杂核壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用

一种近红外发光nd和yb同步高掺杂核壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用
技术领域
1.本发明属于免疫学检检测技术领域，具体涉及一种近红外发光nd和yb同步高掺杂核壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用。


背景技术：

2.横向流分析(lfa)作为全球最常见的护理点测试方法，由于具有快速读取、低成本和易于使用等优点而在学术研究和工业制造界受到了极大的关注。其中，最常见的lfa为免疫层析试纸条。然而，基于金纳米颗粒、乳胶珠和铕荧光微球的免疫层析试纸条仍然存在灵敏度低和信噪比低的问题，这是因为试纸条的硝化纤维膜(nm)以及血液、血浆样本基质均具有较高的光吸收和自荧光干扰所导致的。因此，开发一种可以消除光吸收和自动荧光干扰的免疫层析试纸条，才有可能实现复杂生物基质(如血浆、全血、尿液和粪便样本)中生物标志物的敏感性和准确量化检测。
3.稀土下转换纳米晶作为新一代的发光材料，具有以下几个方面优点：(1)斯托克斯位移大，发射光谱半峰宽窄，可实现多指标多重检测；(2)荧光量子产率高，无光漂白性，光稳定性好，可多次重复检测；(3)激发光和发射光多位于近红外区，光穿透能力强，无背景干扰，可实现无背景干扰，高信号噪音比检测。其中，稀土离子nd
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和yb
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共掺杂纳米晶的激发光和发射光分别为近红外光800nm激发和近红外光980nm激发，是实现无背景干扰检测复杂样本中疾病指标的潜力荧光材料。
4.有研究表明，稀土离子nd
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和yb
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间存在较强的能量传递效率，使得nd
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和yb
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共掺杂纳米晶的量产率达到了20.7％。尽管如此，如何进一步提高nd
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和yb
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共掺杂纳米晶的近红外发射亮度来满足高灵敏检测的需求仍是值得探究的方向。大量研究提示，稀土纳米晶的发光效率受纳米晶表面缺陷、稀土离子的掺杂浓度影响。因此，通过构建惰性壳层和优化稀土离子的掺杂浓度是提高稀土纳米晶的发光效率的有效方法。比如，中国发明专利cn111044493a和cn110514825a分别提供了一种核壳结构α相nalnf4:nd,yb@caf2/nalnf4和α相nayf4:yb,nd@nayf4纳米晶探针，但上述纳米晶探针的近红外发光的最高量产率仅为20.7％。同时，其所采用的α相发光效率明显低于β相，因为α相和β相中掺杂稀土离子的排布明显不同。另外，它们所采用的主基质成份含有其他ln元素，包括y元素、gd元素或lu元素，这些元素的掺杂会影响纳米晶nd元素和yb元素的含量、排布及离子间的距离等，从而不利于纳米晶激发能的高效吸收和利用，最终导致该纳米晶发光强度不能进一步的提高。因此，有必要对该纳米晶做改进，以进一步提高纳米晶对808nm光的吸收能力和激发能的利用率，以实现免疫层析检测方法零背景信号干扰的高灵敏检测。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明对nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法进行了改进，通过合成β相nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶，进而大大提高其对
808nm激发光的吸收能力，同时提高了该纳米晶中敏化离子nd
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激发能量的利用率，从而实现了纳米晶在980nm处的高效发射(量产率高达35.5％)，并克服了现有nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶近红外光发射强度不足的问题。与此同时，利用所得的高亮近红外发光nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶nandf4:yb@naluf4作为荧光识别探针来建立免疫层析检测方法，与已有的近红外免疫层析方法相比，其荧光标记物的稳定性相当、荧光发射更强，检测结果具有更好的灵敏度，从而使医学、农业、食品安全等领域的各种指标实现无背景干扰、高灵敏免疫层析检测。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.本发明第一方面提供了一种高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、制备核nandf4:yb：
9.s11、称取稀土醋酸盐ln(ch3coo)3，其中醋酸钕nd(ch3coo)3占40％，醋酸镱yb(ch3coo)3占60％，加入油酸和1-十八烯后在惰性气体氛围下加热到150-180℃，直至固体全部溶解，得到稀土前驱体溶液；
10.s12、往稀土前驱体溶液中加入含有氢氧化钠的甲醇溶液和含有氟化铵的甲醇溶液，惰性气体氛围下搅拌混匀后，将溶液升温至120℃去除溶液中的甲醇；最后将溶液加热到290-310℃并维持反应50-70min；
11.s13、反应完成后，将溶液冷却至室温，然后通过离心收集沉淀，即得核nandf4:yb60％；最后将nandf4:yb60％纳米晶分散在环己烷中备用；
12.s2、制备nandf4:yb60％@naluf4核壳结构：
13.s21、将氧化镥lu2o3加入到含三氟醋酸水溶液中；加热到90-110℃直至固体完全溶解，然后继续加热至溶液完全蒸干，即得三氟醋酸镥固体粉末；
14.s22、往三氟醋酸镥固体粉末中加入三氟醋酸钠na(cf3coo)3、油酸、1-十八烯以及步骤s13中制备得到的nandf4:yb60％环己烷溶液；惰性气体氛围下升温至110-130℃保持20-40min，以除去体系中的环己烷和水；然后再加热到290-310℃反应50-70min，用于外延生长naluf4壳层；
15.s23、待溶液冷却至室温，通过离心收集沉淀，即得高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶，即nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶，简称β-nandf4:yb@nalnf4。
16.采用本发明方法制备的近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂纳米材料包括内核，并且所述内核为无机基质掺杂离子；所述无机基质内核为nalnf4，ln＝yb
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和nd
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共掺杂离子；所述无机基质内核不能包含其他ln元素(ln＝y
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、gd
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、er
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、ho
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或ce
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中的任意一种或多种)；该近红外发光稀土纳米材料还包括壳层，壳层为一层或多层，包覆于内核外；壳层的基质为包括nalnf4，其中ln＝yb
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。
17.本发明采用了加速相转变的方法实现了敏化离子nd
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和发光离子yb
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同时的高浓度掺杂，其中敏化离子nd
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和发光离子yb
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的掺杂比例分别为40％和60％。这一掺杂比例既保证了纳米晶对于808nm的高吸收能力，又提高了发光中心yb
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对于激发能的充分利用率，最终制得的纳米晶的量子产率高达35.5％，明显高于已报道最高量产率的20.7％。同时，利用这一高亮近红外发光纳米晶作为免疫荧光探针来制备免疫层析试纸条，建立了无背景干
扰、高灵敏度检测粪便、血液、尿液等复杂样本中疾病指标的免疫层析方法。
18.优选地，步骤s11中，所述稀土醋酸盐与油酸、1-十八稀的用量比为1-3mmol：7.5ml：15ml。
19.优选地，步骤s12中，含有氢氧化钠的甲醇溶液的摩尔浓度为0.2-0.5mmol/ml，含有氟化铵的甲醇溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mmol/ml。
20.优选地，步骤s12中，所述含有氢氧化钠的甲醇溶液和含有氟化铵的甲醇溶液的体积比为1:1。
21.优选地，步骤s21中，所述氧化镥与三氟醋酸水溶液的用量比为0.5-2mmol/10-20ml，所述三氟醋酸水溶液的体积分数为50％。
22.优选地，步骤s22中，所述三氟醋酸钠、油酸、1-十八烯和nandf4:yb60％环己烷溶液的用量比为1-3mmol：10ml：10ml：10-20ml，所述nandf4:yb60％环己烷溶液的摩尔浓度为0.1-0.2mmol/ml。
23.本发明第二方面提供了采用第一方面所述的制备方法制备得到的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶。
24.本发明第三方面提供了第二方面所述的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶在免疫层析检测中的应用。
25.本发明第四方面提供了一种基于高亮近红外光发射β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的血清标记物发光检测侧流试纸条，其特征在于，所述侧流试纸条为以第二方面所述的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶为免疫标记，所述侧流试纸条由高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶、聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫、吸水垫组成，所述结合垫负载有结合抗体或者靶蛋白修饰的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶探针和抗质控物抗体修饰的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶探针。
26.优选地，所述抗质控物抗体包括羊抗鸡igy抗体。
27.本发明第五方面提供了第四方面所述的基于高亮近红外光发射β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的血清标记物发光检测侧流试纸条的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)β-nandf4:yb@nalnf4探针表面修饰识别标记物
29.s1、β-nandf4:yb@nalnf4中的功能化修饰为羧基修饰，所采用的方法为配体交换法：
30.s11、将β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶环己烷溶液与乙醇以及盐酸水溶液(0.1m)充分混合震荡，超声处理30min，以去除纳米晶表面的油酸配体；
31.s12、s11制备的β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶溶液经离心(10000r/min，30min)收集无配体的β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶，重新复溶在10ml的去离子水中；
32.s13、将s12制备的β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶重悬液中逐滴加入到含有聚丙烯酸的水溶液，室温下搅拌60min得到聚丙烯酸修饰的β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶；
33.s14、离心收集s12制备的聚丙烯酸修饰的β-nandf4:yb@nalnf4核壳结构纳米晶，并将其分散在10-20ml的去离子水中。
34.s2、β-nandf4:yb@nalnf4中的功能化结合识别检测靶标的结合抗体或者靶蛋白
35.s21、取步骤s14得到的氨基或者羧基功能化修饰的近红外发光β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料，加入mes缓冲液离心，弃上清；将β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料沉淀重新分散在mes缓冲液中。
36.s22、将s21得到的β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料缓冲液中加入edc/sulfo-nhs，活化10-60min。离心取沉淀，再重新分散在缓冲液中，
37.s23、将s22得到的活化β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料缓冲液中加入识别检测靶标的结合抗体或者靶蛋白，室温下反应1-3h，之后加入封闭剂进行封闭，反应0.5-2h。
38.s23、离心s23得到的结合抗体或者靶蛋白修饰的β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料缓冲液，取沉淀(即为近红外发光稀土纳米材料标记的检测靶标识别抗体标记的β相nd
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和yb
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共掺杂纳米材料)分散于pbs等缓冲液中，4℃保存。
39.同时，按相同的方法制备质控物抗体修饰的高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶探针。
40.(2)组装基于β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料近红外光层析检测卡
41.s11、检测垫的制备：将硝酸纤维素膜粘贴在聚氯乙烯支撑地板的中部备用，然后用包被缓冲液(pb缓冲液，10mm，ph＝7.4)将检测靶标识别抗体和质控抗体稀释到0.5-5mg/ml，然后用喷金划膜仪以10-80mm/s的划膜速度和1μl/cm的划膜量分别将检测靶标识别抗体和质控抗体均匀划在聚氯乙烯支撑底板的硝酸纤维素膜的检测线和质控线的位置，划好后的聚氯乙烯支撑底板置于37℃的鼓风烘干箱中烘干24h，备用。
42.s12、结合垫的预处理：用s9表面活性剂、酪蛋白、pvp-k30、tween-20的pb缓冲液(10mm，ph＝7.4)充分浸泡聚酯纤维膜2～4h；37℃烘干后的玻璃纤维膜用自动切割仪切割成宽10mm，长300mm的长条状；
43.s13、结合垫的制备：向喷金稀释液【含有10％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)牛血清蛋白(bsa)、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(pvp k-30)、5％(w/v)s9表面活性剂、0.03％(v/v)proclin-3000)】加入步骤(1)得到的1％(v/v)结合抗体或者靶蛋白修饰的β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料分散液和2％(v/v)质控物抗体修饰的β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料分散液；用喷金划膜仪以50mm/s的喷涂速度和4ul/cm的喷涂量均匀喷在之前预处理的结合垫上，之后制备好的结合垫置于37℃的鼓风干燥箱中烘干24h，备用。
44.s14、样本垫的制备：用含有以s9表面活性剂、酪蛋白、pvp-k30、tween-20的pb缓冲液(10mm，ph＝7.4)充分浸泡玻璃纤维膜2～4h；37℃烘干后的玻璃纤维膜用自动切割仪切割成宽21mm，长300mm的长条状；加样时，直接加入含有待测靶标的血液、尿液等样品即可。
45.s15、免疫层析试纸板的组装：取出固定好抗体的硝酸纤维素膜的聚氯乙烯支撑底板，在靠近硝酸纤维素膜检测线的一端粘贴制备好的s13结合垫，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫，在制备好的结合垫的另一端粘贴s14备好的样本垫；每个组分之间搭接2mm，即完成试纸板的组装；
46.s16、免疫层析试纸卡的制备：用自动切条机将组装好的试纸板切割成为4.00mm宽的试纸条，将试纸条装载在塑料卡壳中；得到β-nandf4:yb@nalnf4纳米材料近红外发光的免疫层析试纸卡(基于高亮近红外光发射β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的血清标记物发光检测侧流试纸条)。
47.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
48.本发明公开了一种近红外发光nd和yb同步高掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，通过利用加速相转变的方案合成了不含其他ln元素的nd
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和yb
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同时高掺杂的纳米晶。利用该方案一方面解决了nd
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和yb
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的晶格不匹配的问题，合成了形貌规则、粒径均匀的nd
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和yb
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共掺杂纳米晶，另一方面实现了nd
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和yb
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的同时高浓度掺杂，确定了nd
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和yb
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的掺杂比例分别为40％和60％，在该掺杂比例下，实现了纳米晶对808nm的高吸收，同时充分利用了808nm的激发能，最终使核壳结构纳米晶的近红外光980nm发射强度大大提升(与中国发明与专利cn110514825b公开的核壳结构α-nayf4:nd60％,yb7％@caf2纳米晶相比提高了30倍)，荧光量子产率高达35.5％，明显高于文献(cao c,xue m,zhu x,yang p,feng w,li f.energy transfer highway in nd
3+-sensitized nanoparticles for efficient near-infrared bioimaging.acs appl mater interfaces.2017jun 7；9(22):18540-18548)中报道α-nalnf4:nd,yb@caf2/nalnf4的20.7％。然后，利用这一高亮近红外发光纳米晶来构建荧光免疫探针来构建免疫层析试纸条，从而实现了无背景干扰，复杂样本中疾病指标的高灵敏度检测。具体而言，本发明有以下优点：
49.(1)本发明采用加速相转变的方法合成了形貌规则、粒径均匀的β相nandf4：yb@naluf4核壳结构纳米晶，高浓度nd
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掺杂实现了808nm光子的高吸收。同时，利用nd
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→
yb
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的高效的能量传递和高浓度yb
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掺杂实现了纳米晶对吸收808nm光子的充分利用，使其高亮发射980nm近红外光。通过nalnf4惰性壳层的包覆，抑制了高浓度yb
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掺杂引起的表面缺陷猝灭现象。最终制备得到了高亮度近红外光980nm发射的nandf4:yb60％@nalnf4纳米晶，这一高亮近红外光发射纳米晶作为免疫荧光标记有助于免疫层析的高灵敏检测。与现有的近红外免疫层析方法相比，nandf4:yb60％@nalnf4纳米晶近红外光发射更强，检测结果灵敏度更高。
50.(2)本发明提供的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶免疫层析试纸条在进行实际体液标记物检测时，需将适量的体液样本滴加到样本垫上，反应一段时间后，使用手持便携式检测仪器(808nm激发，980nm发射)对试纸条发光进行检测。由于nandf4:yb60％@naluf4纳米晶荧光探针的激发和发射光谱均位于近红外区，从而消除了纤维素膜、体液中的各种小分子、大分子物质对检测荧光信号的干扰，从而使免疫层析检测方法对血液、尿液、粪便等复杂样本中的各种指标实现了无背景信号干扰的高灵敏实时检测。
附图说明
51.图1为核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶的xrd衍射图谱；
52.图2为核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶的透射电镜图(柱状图表示核壳结构的纳米晶大小)；
53.图3为核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶与常规nayf4:nd20％，yb10％@nayf4纳米晶的荧光光谱对比图；
54.图4为核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶与专利cn110514825b公开的核壳结构nayf4:nd60％,yb7％@nayf4的荧光光谱对比图；
55.图5为以核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶为荧光免疫标记的免疫层析试纸条的示意图【
①
为样本垫，
②
为结合垫，
③
为检测线(t线)，
④
为质控线(c线)，
⑤
为吸水垫】；
56.图6为以核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶为荧光免疫标记的免疫层析试纸
条的实物图；
57.图7为以核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶为荧光免疫标记的免疫层析试纸条检测的sars-cov-2中和抗体浓度与检测线(t线)与质控线(c线)荧光强度之比的关系曲线。
具体实施方式
58.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
59.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
60.实施例1近红外发光nd和yb同步高掺杂核壳结构纳米晶(nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶)的制备和发光性质研究
61.1、制备核nandf4:yb60％：
62.1)将0.4mmol醋酸钕(nd(ch3coo)3)和0.6mmol醋酸镱(yb(ch3coo)3)加入到含有7.5ml油酸(oa)和15ml 1-十八烯(ode)的三口烧瓶中，在氮气氛围下，加热到100℃反应10min，以去除其中的水分和氧气，随后加热到160℃反应60min，直至固体全部溶解，最后冷却至室温，得到稀土前驱体溶液；
63.2)首先将10ml含有2.5mmol氢氧化钠(naoh)的甲醇溶液缓慢加入到上述三口烧瓶的稀土前驱体溶液中，剧烈搅拌20min，随后再向其中缓慢加入10ml含有4mmol氟化铵(nh4f)的甲醇溶液，在氮气氛围下，剧烈搅拌60min，之后加热到120℃反应30min，去除体系中的甲醇、氧气和水分，最后升温至300℃反应60min；
64.3)反应结束后，待溶液自然冷却至室温后转移到50ml离心管中，加入5ml无水乙醇，震荡混匀后以7500r/min离心5min，再用无水乙醇重复洗涤离心操作2-3次，得到的沉淀即为核nandf4:yb60％；
65.将得到的核nandf4:yb60％重新分散在10ml环己烷中，得到nandf4:yb60％分散液(摩尔浓度为0.1mmol/ml)，备用。
66.2、制备核壳nandf4:yb60％@naluf4：
67.1)将1mmol氧化镥(lu2o3)加入到含有5ml去离子水(h2o)和5ml三氟乙酸(cf3cooh)的三口烧瓶中，加热到98℃反应直至溶液完全透明，使固体全部溶解；随后加热蒸干去除所有水分，得到三氟醋酸镥固体粉末，冷却至室温，备用；
68.2)向上述含有三氟醋酸镥固体粉末的三口烧瓶中加入2mmol三氟醋酸钠(cf3coona)，15ml油酸(oa)，15ml 1-十八烯(ode)和10ml步骤1的nandf4:yb60％分散液(0.1mmol/ml)，在氮气氛围下升温至120℃反应30min，以去除体系中的环己烷和水分，随后再升温至300℃反应60min，用于外延生长naluf4惰性壳层；
69.3)待溶液自然冷却到室温后，加入10ml无水乙醇震荡洗涤，之后以8000r/min离心5min，重复用无水乙醇洗涤和离心操作2-3次，得到的沉淀即为核壳结构的nandf4:yb60％@naluf4。
70.将制备得到的核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶重新分散在10ml环己烷中，
得到nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶分散液(0.1mmol/ml)，备用。
71.首先，对本实施例制备得到的nandf4:yb60％@naluf4核壳壳结构纳米晶进行xrd衍射分析。从图1的xrd衍射谱图可以看出，nandf4:yb60％@naluf4纳米晶是六方相的晶相结构。
72.其次，对本实施例制备得到的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶进行透射电镜观察。从图2可以看出，该核壳结构nandf4:yb60％@naluf4纳米晶为单分散的，形貌规则和粒径均一的圆形粒子，直径为17nm。
73.此外，对本实施例制备得到的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶、专利cn110514825b公开的核壳结构α-nayf4:nd60％,yb7％@caf2纳米晶和文献(feng xu,et al.rare-earth doped nanoparticles with narrow nir-ii emission for optical imaging with reduced autofluorescence.chem.res.chinese universities,2021,37(4),943―950)中报道的核壳结构β-nayf4:nd60％,yb7％@nayf4纳米晶在808nm激发下的发射光谱进行分析。如图3所示，与核壳结构β-nayf4:nd60％,yb7％@nayf4纳米晶在808nm激发下的发射光谱相比，nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶980nm近红外发光增强了3.0倍。图4表明，与核壳结构α-nayf4:nd60％,yb7％@caf2纳米晶808nm激发下的发射光谱相比，nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶980nm近红外发光增强了30倍。
74.最后，对本实施例制备得到的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶进行相对荧光量子产率计算。使用紫外吸收光谱仪测定nandf4:yb60％@naluf4的dmso溶液(0.1mg/ml，dcnps溶液)和icg的dmso溶液(0.1mg/ml，icg溶液)在激发光源808nm处的吸光度，分别记为a
dcnps
和a
icg
。之后，使用近红外荧光光谱仪测定nandf4:yb60％@naluf4的dmso溶液(0.1mg/ml)和icg的dmso溶液(0.1mg/ml)在808nm激发下的发射光谱，计算nandf4:yb60％@naluf4核壳纳米晶和近红外荧光染料icg的发射峰峰面积，分别记作f
dcnps
和f
icg
。通过相对荧光量子产率计算公式得出qy
dcnps
＝35.5％。计算公式如下：
[0075][0076]
和
[0077]
其中，qy
icg
表示有机荧光染料icg在dmso溶液中的荧光量子产率，经文献查阅得出其值为13％；n
dcnps
和n
icg
分别表示dcnps溶液和icg溶液的折射率。
[0078]
实施例2高亮近红外发光免疫层析试纸条的制备
[0079]
本实施例的免疫层析试纸条是利用实施例1中的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶为免疫标记物制备而成，该试纸条由样本垫、结合垫、吸水垫、检测垫以及聚氯乙烯支撑底板组成；
[0080]
其中，检测垫由含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜组成：检测线是用一定量(3.5～4.2l)的血清指标抗体溶液平行画在硝酸纤维素膜上的线，质控线是用一定量(3.5～4.5l)的羊抗鸡igy抗体溶液平行画在硝酸纤维素膜上的线，检测线和质控线的线宽均为1～1.2mm，滴加体积量均为1～1.2ml/cm；
[0081]
结合垫是由负载有结合抗体或者靶蛋白修饰的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶探针和鸡igy抗体修饰的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶探针的聚酯纤维素膜组成的。
[0082]
检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑底板的中部，在检测垫的靠近检测线一端粘贴结合垫；在结合垫的另一端粘贴样本垫；在检测垫的质控线的一端粘贴吸水垫，其结构如图5和图6所示。
[0083]
上述免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：
[0084]
1、制备结合抗体或者靶蛋白修饰的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶探针和鸡igy抗体修饰的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶探针(即制备稀土下转换近红外二区发光探针)
[0085]
1)向实施例1制备的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶分散液(10ml，0.1mmol/ml)中加入10mlhci溶液(0.1m)和10ml无水乙醇，室温下震荡混匀后，超声30min去除油酸配体；随后离心(10000r/min，30min)收集得到无配体的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶；之后用去离子水离心洗涤(10000r/min，20min)，重复操作2～3次；将无配体的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶重新分散在10ml去离子水中，然后将其逐滴加入到10ml含有50mg聚丙烯酸(paa)的去离子水中，室温下剧烈搅拌60min，反应完成后通过离心(10000r/min，30min)收集聚丙烯酸修饰的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶(即为paa-nandf4:yb60％@naluf4纳米晶)，并用去离子水离心洗涤(10000r/min，20min)，重复操作2～3次，然后将其重新分散在10ml去离子水中，得到paa-nandf4:yb60％@naluf4纳米晶分散液(0.1mmol/ml)；
[0086]
2)取100ulpaa-nandf4:yb60％@naluf4纳米晶分散液(0.1mmol/ml)加入1.5ml ep管中，然后加入1ml mes缓冲液(ph＝6.0)进行洗涤，通过离心(15000r/min，15min)除去上清液，随后将paa-nandf4:yb60％@naluf4纳米晶重新分散在1ml mes缓冲液(ph＝6.0)中；向上述溶液中依次加入400ul含有40ug edc的mes缓冲液(ph＝6.0)和400ul含有70ug sulfo-nhs的mes缓冲液(ph＝6.0)，之后放在混匀仪上反应30min，反应完成后通过离心(15000r/min，15min)除去上清液，再将sulfo-nhs活化好的paa-nandf4:yb60％@naluf4纳米晶重悬在1mlmes缓冲液(ph＝6.0)中；
[0087]
向所得纳米晶悬液中加入60mg rbd蛋白(新型冠状病毒抗原)或者鸡igy抗体，放在混匀仪上反应90min，然后继续加入1ml封闭缓冲液【含1％(w/v)的牛血清蛋白(bsa))的tris缓冲液(ph＝8.0，10mm)】，放在混匀仪上继续反应60min，以封闭其他未反应的活化位点，经离心(15000r/min,15min)后去除上清液，收集rbd蛋白或鸡igy抗体偶联的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶；
[0088]
用终洗缓冲液【含有1％(w/v)牛血清蛋白(bsa),0.1％(v/v)吐温-20，0.03％(v/v)proclin-300的tris缓冲液(ph＝8.0，10mm)】洗涤rbd蛋白或鸡igy抗体偶联的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶，然后将其重新分散在100ul终洗缓冲液中，得到rbd蛋白或鸡igy抗体偶联的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶分散液(0.1mmol/ml)，备用。
[0089]
2、组装近红外二区发光免疫层析试纸条的步骤如下：
[0090]
1)样本垫的制备：用含有1％(v/v)吐温-20的pb缓冲液(10mm，ph＝7.4)充分浸泡玻璃纤维膜2～4h；然后放入37℃的鼓风干燥箱烘干24h；烘干后的玻璃纤维膜用自动切割仪切割成宽21mm，长300mm的长条状，制备好的样本垫放在干燥箱中备用；
[0091]
2)结合垫的预处理：用含有1％(v/v)吐温-20的pb缓冲液(10mm，ph＝7.4)充分浸泡聚酯纤维膜2～4h；然后放入37℃的鼓风干燥箱烘干24h；烘干后的玻璃纤维膜用自动切割仪切割成宽10mm，长300mm的长条状，预处理的结合垫放在干燥箱中备用；
[0092]
3)检测垫的制备：首先将硝酸纤维素膜粘贴在聚氯乙烯支撑地板的中部备用，然后用包被缓冲液(pb缓冲液(10mm，ph＝7.4))将血管紧张素转化酶2(ace2)和羊抗鸡igy抗体稀释到1mg/ml，再用喷金划膜仪以50mm/s的划膜速度和1ul/cm的划膜量分别将1mg/ml的血管紧张素转化酶2溶液和羊抗鸡igy抗体溶液均匀划在聚氯乙烯支撑底板的硝酸纤维素膜的检测线和质控线的位置，划好后的聚氯乙烯支撑底板置于37℃的鼓风烘干箱中烘干24h，备用。
[0093]
4)结合垫的制备：向喷金稀释液【含有10％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)牛血清蛋白(bsa)、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(pvp k-30)、5％(w/v)s9表面活性剂、0.03％(v/v)proclin-3000的tris缓冲液(20mm，ph＝7.4)】中加入1％(v/v)rbd蛋白偶联的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶分散液和2％(v/v)鸡igy抗体偶联的nandf4:yb60％@naluf4纳米晶分散液；用喷金划膜仪以50mm/s的喷涂速度和4ul/cm的喷涂量均匀喷在之前预处理的结合垫上，之后将制备好的结合垫置于37℃的鼓风干燥箱中烘干24h，备用。
[0094]
5)免疫层析试纸条的组装：取出固定好抗体的硝酸纤维素膜的聚氯乙烯支撑底板，在靠近硝酸纤维素膜检测线的一端粘贴制备好的结合垫，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫，在制备好的结合垫的另一端粘贴制备好的样本垫；每个组分之间的搭接距离为2mm，即完成试纸板的组装；用自动切条机将组装好的试纸板切割成为4.00mm宽的试纸条，将试纸条装载在塑料卡壳中，得到高亮近红外发光免疫层析试纸条，也称为高亮近红外发光nd和yb共掺杂的核壳结构纳米晶sars-cov-2中和抗体测定试纸条。
[0095]
3、本实施例制备的以高亮近红外二区发光的nandf4:yb60％@naluf4核壳结构纳米晶为免疫荧光标记探针的免疫层析试纸条的使用方法为：将50ul的血液样本和80ul的样本缓冲液【含有0.85％(w/v)氯化钠(nacl)，0.5％(v/v)曲拉通100(tx-100)，0.1％(v/v)吐温-20(t-20),0.1％(w/v)s9表面活性剂的tris缓冲液(100mm，ph＝8.0)】震荡混匀后，加入到样本垫中，静置层析15min，然后利用手持型检测仪器检测试纸条中检测线和质控线在980nm处的荧光信号；并根据测定的荧光强度与标准样品sars-cov-2中和抗体的浓度制定标准曲线；将检测样本的荧光强度和标准曲线进行对比获取样本中sars-cov-2中和抗体的浓度。
[0096]
实施例3高亮近红外发光免疫层析试纸条的检测限
[0097]
探究实施例2制备的高亮近红外发光免疫层析试纸条测定sars-cov-2中和抗体的检测限，具体方法如下：
[0098]
1)将sars-cov-2中和抗体的标准品添加到样本缓冲液【含有0.85％(w/v)氯化钠(nacl)，0.5％(v/v)曲拉通100(tx-100)，0.1％(v/v)吐温-20(t-20),0.1％(w/v)s9表面活性剂的tris缓冲液(100mm，ph＝8.0)】中，制备的sars-cov-2中和抗体浓度分别为0ug/ml，0.6ug/ml，0.13ug/ml，0.25ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml，16/ml；
[0099]
2)将100ul各浓度的样本溶液加入到试剂卡的加样孔内(实施例2制备的免疫层析试纸条)，室温下，静置层析反应15min，用手持型检测仪器对近红外二区发光免疫层析试纸条的检测线和质控线处进行980nm发射光信号强度的采集，各sars-cov-2中和抗体浓度的样本的测试结果以及对应的标准曲线如图7所示，从图7可以看出，该免疫层析试纸条的检测限为0.11ug/ml，且重复性良好。
[0100]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对
于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、制备核nandf4:yb：s11、称取稀土醋酸盐，其中醋酸钕占40％，醋酸镱占60％，加入油酸和1-十八烯后在惰性气体氛围下加热到150-180℃，直至固体全部溶解，得到稀土前驱体溶液；s12、往稀土前驱体溶液中加入含有氢氧化钠的甲醇溶液和含有氟化铵的甲醇溶液，惰性气体氛围下搅拌混匀后，将溶液升温至120℃去除溶液中的甲醇；最后将溶液加热到290-310℃并维持反应50-70min；s13、反应完成后，将溶液冷却至室温，然后通过离心收集沉淀，即得核nandf4:yb60％；最后将nandf4:yb60％纳米晶分散在环己烷中备用；s2、制备nandf4:yb60％@naluf4核壳结构：s21、将氧化镥加入到含三氟醋酸水溶液中；加热到90-110℃直至固体完全溶解，然后继续加热至溶液完全蒸干，即得三氟醋酸镥固体粉末；s22、往三氟醋酸镥固体粉末中加入三氟醋酸钠、油酸、1-十八烯以及步骤s13中制备得到的nandf4:yb60％环己烷溶液；惰性气体氛围下升温至110-130℃保持20-40min，以除去体系中的环己烷和水；然后再加热到290-310℃反应50-70min，用于外延生长naluf4壳层；s23、待溶液冷却至室温，通过离心收集沉淀，即得高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶。2.根据权利要求1所述的一种高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，步骤s11中，所述稀土醋酸盐与油酸、1-十八稀的用量比为1-3mmol：7.5ml：15ml。3.根据权利要求1所述的一种高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，步骤s12中，含有氢氧化钠的甲醇溶液的摩尔浓度为0.2-0.5mmol/ml，含有氟化铵的甲醇溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mmol/ml。4.根据权利要求1所述的一种高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，步骤s12中，所述含有氢氧化钠的甲醇溶液和含有氟化铵的甲醇溶液的体积比为1:1。5.根据权利要求1所述的一种高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，步骤s21中，所述氧化镥与三氟醋酸水溶液的用量比为0.5-2mmol/10-20ml，所述三氟醋酸水溶液的体积分数为50％。6.根据权利要求1所述的一种高亮近红外发光β相nd
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和yb
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共掺杂核壳结构纳米晶的制备方法，其特征在于，步骤s22中，所述三氟醋酸钠、油酸、1-十八烯和nandf4:yb60％环己烷溶液的用量比为1-3mmol：10ml：10ml：10-20ml，所述nandf4:yb60％环己烷溶液的摩尔浓度为0.1-0.2mmol/ml。7.采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶。8.权利要求7所述的高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶在免疫层析检测中的应用。9.一种基于高亮近红外光发射β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶的血清标记物发光
检测侧流试纸条，其特征在于，所述侧流试纸条为以权利要求7所述的高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶为免疫标记，所述侧流试纸条由高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶、聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫、吸水垫组成，所述结合垫负载有结合抗体或者靶蛋白修饰的高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶探针和抗质控物抗体修饰的高亮近红外发光β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶探针。10.根据权利要求9所述的一种基于高亮近红外光发射β相nd
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共掺杂核壳结构纳米晶的血清标记物发光检测侧流试纸条，其特征在于，所述抗质控物抗体包括羊抗鸡igy抗体。

技术总结
本发明属于免疫学检检测技术领域，具体涉及一种近红外发光Nd和Yb同步高掺杂核壳结构纳米晶的制备及其在免疫层析检测中的应用。为进一步提高纳米晶对808nm光的吸收能力和激发能的利用率，本发明通过加速相转变的方法使敏化离子Nd


技术研发人员：冀天星 魏嵬 丁卫东 宋庆炜
受保护的技术使用者：华南师范大学
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/7/20