一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法

1.本发明属于类黑精提取技术领域，具体地，涉及一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法。


背景技术：

2.食醋中富含多种营养功能成分，其中类黑精是主要的抗氧化成分。类黑精是还原糖和含游离氨基的化合物在热加工过程中通过美拉德反应形成的含氮棕色色素，具有高抗氧化活性。前期研究发现，类黑精为食醋贡献50％以上的抗氧化能力，大量小分子酚类化合物以共价键键合在类黑精骨架上，为类黑精贡献高达89％的抗氧化能力。同时，类黑精能够促进nad+的生成来发挥抗氧化和抗炎作用，可以有效预防和抑制酒精性炎症的发生和发展。
3.中国发明专利cn109401910b公布了一种富含抗氧化活性成分的醋粉及其制备方法与应用，在制备过程中，使用超滤膜将食醋中的类黑精大分子抗氧化物截留，滤出液使用乙醇和乙酸乙酯有机溶剂萃取将传统食醋中的多酚、黄酮等小分子抗氧化成分富集，进而增强传统食醋在预防心血管疾病、护肝、抗衰老、防癌抗癌等方面的功效，同时，其在浓缩液中添加复合填充剂如：麦芽糊精和β-环糊精可有效防止醋粉中有效成分氧化，增加产品稳定性，该制备方法在对于食醋中强极性的类黑精组分会存在提取不充分的问题，其次，同水提法类似，单一的浸提对食品物料内部包括细胞分子内部的类黑精提取不充分，也会对最后的结果产生影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，解决了现有技术中存在的食醋中强极性的类黑精组分提取不充分的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤s1、将食醋和夹带剂装入超临界反应釜中,经萃取工艺，得到纯化食醋液和余液，其中，食醋和夹带剂的用量比为1l:1-3l,超临界二氧化碳流体具有亲脂性,是非极性溶剂,它对非极性的油溶性物质而对有一定极性的物质的溶解度则较差,通过加入夹带剂以调节超临界二氧化碳流体的极性,提高被萃取物质在二氧化碳流体中的溶解度,使有机酸、多酚类、黄酮类和氨基酸等小分子抗氧化成分被提取出来；
8.进一步地，步骤s1中,夹带剂为醇和水的混合溶液。
9.进一步地,步骤s1中,醇选自乙醇和丙二醇中的一种或两种，更进一步地,所述醇占所述夹带剂的质量百分比为20％-40％。
10.进一步地，萃取工艺为超临界co2萃取工艺，该工艺的具体参数如下所示：co2的流速为24-32l/h，温度为40-45℃，压力为33-35mpa，时间为50-60mi n。
11.步骤s2、将步骤s1所得余液经装有大孔树脂d312离交柱进行吸附富集，吸附完毕，
先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10l/h，再用葡聚糖凝胶sephadex g-50柱层析纯化，得到纯化液；
12.葡聚糖凝胶层析的分离原理为分子筛机制，葡聚糖凝胶表面分布着不同尺寸的孔径，不同的有机物分子进入葡聚糖凝胶层析柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大分子物质随洗脱液从凝胶颗粒之间的缝隙中较快的洗脱出，而小分子量物质进入凝胶的多孔结构，滞留时间较长后洗脱出来。
13.进一步地，步骤s2中，大孔树脂d312离交柱的装柱高度40cm，上样量为3bv，上柱流速为0.8-3bv/h，d312树脂和余液的重量比为0.5-1：2，洗脱流速为1bv/h，洗脱体积均为最大上样量。
14.进一步地，步骤s2中，葡聚糖凝胶sephadex g-50柱，层析柱的上样浓度100mg/ml，上样量0.5ml，洗脱剂为去离子水，洗脱流速0.2-0.8ml/mi n，由于凝胶柱的孔径较大，收集过程中，不能将多糖和蛋白质有效地从类黑精中分离出来。
15.步骤s3、将步骤s1中制备得到的纯化食醋液、步骤s2中制备得到的纯化液和壁材液，升温至60-65℃，搅拌均匀，再加入生物固化剂混合均匀，进行喷雾干燥、出粉、包装，得到醋粉类黑精，其中，步骤s1中制备得到的纯化食醋液、步骤s3中制备得到的纯化液、壁材液和生物固化剂的用量比为25-35ml:15-25ml:100ml:10ml，壁材液中的组分和生物固化剂中的组分能够形成微胶囊对步骤s1中制备得到的纯化食醋液和步骤s2中制备得到的纯化液形成包裹。
16.进一步地，壁材液由麦芽糖糊精、壳聚糖和1wt％醋酸水溶液按照用量比10g:0.3g：100ml混合而成。
17.进一步地，生物固化剂的制备方法，包括以下步骤：
18.将植酸和20wt％乙醇水溶液搅拌均匀，升温至50℃，再加入京尼平，搅拌均匀，得到生物固化剂，其中，植酸、20wt％乙醇水溶液和京尼平的用量比为3-5g：10ml:0.1-0.14ml。
19.植酸能够通过络合金属离子形成稳定性很高的化合物，抑制氧化作用，起到抗氧化的作用，同时，植酸中独特的富磷酸盐基团，能够有效促进纯化液中的多糖、蛋白质和纯化食醋液中的氨基酸分子在喷雾干燥的过程中进一步发生美拉德反应，制备得到醋粉类黑精。
20.京尼平为交联固化剂，是中药桅子成分中活性非常高的成分，在抗炎、糖尿病治疗及抗肿瘤方面具有显著的应用效果，且在药理价值方面具有较好的表现，同时，它是一种优良的天然生物交联剂，可以和壁材液中壳聚糖和纯化液中的蛋白质分子交联，具有相容性好、抗降解能力强以及毒性小的优点。
21.进一步地，步骤s3中，喷雾干燥的进风温度140-180℃，雾化器转速为15000-20000rpm/mi n，出风温度90-100℃，进风温度180-200℃，进料速度为1.5-2l/h。
22.进一步地，步骤s3中的出粉是将经喷雾干燥得到醋粉类黑精过100-200目筛，控制粉状粒径小于100μm。
23.进一步地，步骤s3中的包装是将经喷雾干燥得到醋粉类黑精进行杀菌，符合要求后进行外观包装。
24.进一步地，食醋为镇江香醋。
25.本发明的有益效果：
26.本发明技术方案中，将分离得到的纯化食醋液和纯化液经微囊化后，可以防止外部环境干扰和喷雾干燥过程中有效成分的挥发损失，极大地提高了制备得到类黑素的稳定性，植酸中含有大量磷酸根，能够显著促进在喷雾干燥过程中，纯化液中未分离的蛋白质和多糖组分与纯化食醋液中的氨基酸继续发生美拉德反应，进一步提高制备得到的类黑精的含量，京尼平不仅作为生物交联剂，而且，其自身在抗炎、糖尿病治疗及抗肿瘤方面具有显著的应用效果，在制备过程中能协同增强制备得到的醋粉类黑精的抗纤维化功效。
27.本发明技术方案中，采用超临界co2萃取工艺，该工艺综合了“蒸馏”和“液－液萃取”两个化工单元操作的优点，利用超临界萃取中的co2较低的粘度和较高的扩散系数保证较高的萃取产率，从而高效地提取出有机酸、多酚类、黄酮类和氨基酸等小分子抗氧化成分，并且能够避免传统有机溶剂萃取所带来的残留溶剂污染，安全环保。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为对本发明中实施例1和对比例1中总的类黑精含量示意图；
30.图2为本发明实施例2中制备得到的醋粉类黑精抗纤维化作用测试结果示意图；
31.图3为本发明中实施例2中制备得到的醋粉类黑精抗氧化作用测试结果示意图；
32.图4为实施例2中制备得到的醋粉类黑精抗纤维化作用原理示意图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.本实施例提供一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，包括以下步骤：
36.步骤s1、将1l镇江香醋和1l夹带剂装入超临界反应釜中,经超临界co2萃取工艺，得到纯化镇江香醋液和余液，其中，夹带剂为乙醇和水的混合溶液，乙醇占夹带剂的质量百分比为20％，超临界co2萃取工艺的具体参数如下所示：co2的流速为24l/h，温度为40℃，压力为33mpa，时间为50mi n；
37.步骤s2、将步骤s1所得余液经装有大孔树脂d312离交柱进行吸附富集，吸附完毕，先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10l/h，再用葡聚糖凝胶sephadex g-50柱层析纯化，得到纯化液，其中，大孔树脂d312离交柱的装柱高度40cm，上样量为3bv，上柱流速为0.8bv/h，d312树脂和余液的重量比为0.5：2，洗脱流速为1bv/h，洗脱体积均为最大上样量，葡聚糖凝胶sephadex g-50柱，层析柱的上样浓度100mg/ml，上样量0.5ml，洗脱剂为去离子水，洗脱流速0.2ml/mi n；
38.步骤s3、将25ml步骤s1中制备得到的纯化镇江香醋液、15ml步骤s2中制备得到的纯化液和100ml壁材液，升温至60℃，搅拌均匀，再加入10ml生物固化剂混合均匀，进行喷雾干燥，将经喷雾干燥得到醋粉类黑精过100目筛，控制粉状粒径小于100μm，再进行杀菌，符合要求后进行外观包装，得到醋粉类黑精，其中，壁材液由麦芽糖糊精、壳聚糖和1wt％醋酸水溶液按照用量比10g:0.3g：100ml混合而成，喷雾干燥的进风温度140℃，雾化器转速为15000rpm/mi n，出风温度90℃，进风温度180℃，进料速度为1.5l/h；
39.进一步地，生物固化剂的制备方法，包括以下步骤：
40.将3g植酸和10ml 20wt％乙醇水溶液搅拌均匀，升温至50℃，再加入0.10ml京尼平，搅拌均匀，得到生物固化剂。
41.实施例2
42.本实施例提供一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，包括以下步骤：
43.步骤s1、将1l镇江香醋和2l夹带剂装入超临界反应釜中,经超临界co2萃取工艺，得到纯化镇江香醋液和余液，其中，夹带剂为丙二醇和水的混合溶液，丙二醇占夹带剂的质量百分比为30％，超临界co2萃取工艺的具体参数如下所示：co2的流速为28l/h，温度为42.5℃，压力为34mpa，时间为55mi n；
44.步骤s2、将步骤s1所得余液经装有大孔树脂d312离交柱进行吸附富集，吸附完毕，先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10l/h，再用葡聚糖凝胶sephadex g-50柱层析纯化，得到纯化液，其中，大孔树脂d312离交柱的装柱高度40cm，上样量为3bv，上柱流速为1.9bv/h，d312树脂和余液的重量比为0.75：2，洗脱流速为1bv/h，洗脱体积均为最大上样量，葡聚糖凝胶sephadex g-50柱，层析柱的上样浓度100mg/ml，上样量0.5ml，洗脱剂为去离子水，洗脱流速0.5ml/mi n；
45.步骤s3、将30ml步骤s1中制备得到的纯化镇江香醋液、20ml步骤s2中制备得到的纯化液和100ml壁材液，升温至62.5℃，搅拌均匀，再加入10ml实施例1制备得到的生物固化剂混合均匀，进行喷雾干燥，将经喷雾干燥得到醋粉类黑精过150目筛，控制粉状粒径小于100μm，再进行杀菌，符合要求后进行外观包装，得到醋粉类黑精，其中，壁材液由麦芽糖糊精、壳聚糖和1wt％醋酸水溶液按照用量比10g:0.3g：100ml混合而成，喷雾干燥的进风温度160℃，雾化器转速为17500rpm/mi n，出风温度95℃，进风温度190℃，进料速度为1.75l/h；
46.进一步地，生物固化剂的制备方法，包括以下步骤：
47.将4g植酸和10ml 20wt％乙醇水溶液搅拌均匀，升温至50℃，再加入0.12ml京尼平，搅拌均匀，得到生物固化剂。
48.实施例3
49.步骤s1、将1l镇江香醋和3l夹带剂装入超临界反应釜中,经超临界co2萃取工艺，得到纯化镇江香醋液和余液，其中，夹带剂为乙醇和水的混合溶液，乙醇占夹带剂的质量百分比为30％，超临界co2萃取工艺的具体参数如下所示：co2的流速为32l/h，温度为45℃，压力为35mpa，时间为60mi n；
50.步骤s2、将步骤s1所得余液经装有大孔树脂d312离交柱进行吸附富集，吸附完毕，先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10l/h，再用葡聚糖凝胶sephadex g-50柱层析纯化，得到纯化液，其中，大孔树脂d312离交柱的装柱高度40cm，上样量为3bv，上柱流速为3bv/h，d312树脂和余液的重量比为1：2，洗脱流速为1bv/h，
mrna相对表达量。然而，不管是正常培养的lx-2细胞还是经tgfβ1诱导的lx-2细胞，经醋粉类黑精干预后，抗氧化相关基因，如cat、sod1、sod2、gpx1和gpx4 mrna等相对表达量均低于正常水平(图3-b)；醋粉类黑精强自由基清除能力使lx-2细胞内ros积累量低于正常培养基中培养的细胞，进而使由抗氧化酶组成的抗氧化应激防御屏障没有发挥作用，是造成醋粉类黑精干预下，lx-2细胞中与抗氧化相关的基因相对表达量均低于正常水平的原因。证明了醋粉类黑精可通过降低细胞内ros积累、在不激活由抗氧化酶组成的抗氧化应激防御屏障的情况下发挥抗氧化作用。
65.对实施例2制备得到醋粉类黑精抗纤维化作用原理进行测试，具体测试方法为采用western blot方法测定蛋白含量，测试结果如图4所示；
66.由图4可以看出，用tgfβ1诱导lx-2细胞30分钟，其smad3的磷酸化水平显著提高；而醋粉类黑精则显著降低了在该时间点的细胞smad3磷酸化水平(图4-a)。同时，tgfβ1显著提高了促纤维化基因，即αsma和col1a1 mrna相对表达量；在单独使用sis3或醋粉类黑精处理tgfβ1诱导的lx-2细胞时，αsma和col1a1 mrna相对表达量相较于tgfβ1诱导组的lx-2细胞，均显著降低；而当同时用sis3和醋粉类黑精处理tgfβ1诱导的lx-2细胞时，αsma mrna相对表达量低于基础表达水平，col1a1 mrna相对表达量则降低至基础水平(图4-b)。因此，醋粉类黑精的抗纤维化作用是通过smad3途径介导的，即醋粉类黑精通过抑制smad3磷酸化来发挥抗纤维化作用。
67.综上，本发明公开的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，简单便捷、易操作，所得醋粉类黑精具有优异的抗纤维化以及抗氧化作用。
68.本发明实施例1-3制备的抗纤维化醋粉类黑精与对比例1-3制备抗纤维化醋粉类黑精的提取率，如表1所示：
69.表1
70.组别提取率(％)实施例193.5实施例295.4实施例392.7对比例172.6对比例283.5对比例376.4
71.(所述提取率为醋粉中类黑精总量占原料醋液中小分子抗氧化物总量的百分比)
72.由表1可知，相对于对比例1-3，实施例1-3制备得到的抗纤维化醋粉类黑精有着较高的提取率，对比例1，由于没有采取喷雾干燥，导致纯化液中的多糖、蛋白质和纯化食醋液中的氨基酸分子不能发生美拉德反应，导致醋粉类黑精的提取率很低，对比例2中，由于未采取壁材包裹，喷雾干燥过程中有效成分的挥发损失，造成醋粉类黑精的提取率下降，对比例3中，由于去除了生物固化剂，生物固化剂中植酸内含有的磷酸根能促进喷雾干燥过程的美拉德反应的进行，进而导致醋粉类黑精的提取率下降。
73.在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而
且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
74.以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤s1、将食醋和夹带剂装入超临界反应釜中,经萃取工艺，得到纯化食醋液和余液；步骤s2、将步骤s1所得余液经装有大孔树脂d312离交柱进行吸附富集，吸附完毕，先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10l/h，再用葡聚糖凝胶sephadex g-50柱层析纯化，得到纯化液；步骤s3、将步骤s1中制备得到的纯化食醋液、步骤s2中制备得到的纯化液和壁材液，升温至60-65℃，搅拌均匀，再加入生物固化剂混合均匀，进行喷雾干燥、出粉、包装，得到醋粉类黑精；生物固化剂的制备方法，包括以下步骤：将植酸和20wt％乙醇水溶液搅拌均匀，升温至50℃，再加入京尼平，搅拌均匀，得到生物固化剂。2.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s1中，食醋和夹带剂的用量比为1l:1-3l，夹带剂为醇和水的混合溶液。3.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s1中,醇选自乙醇和丙二醇中的一种或两种，醇占夹带剂的质量百分比为20％-40％。4.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s1中,萃取工艺为超临界co2萃取工艺，工艺的具体参数如下所示：co2的流速为24-32l/h，温度为40-45℃，压力为33-35mpa，时间为50-60min。5.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s2中,大孔树脂d312离交柱的装柱高度40cm，上样量为3bv，上柱流速为0.8-3bv/h，d312树脂和余液的重量比为0.5-1：2，洗脱流速为1bv/h，洗脱体积均为最大上样量。6.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s2中,葡聚糖凝胶sephadex g-50柱，层析柱的上样浓度100mg/ml，上样量0.5ml，洗脱剂为去离子水，洗脱流速0.2-0.8ml/min。7.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s3中,步骤s1中制备得到的纯化食醋液、步骤s3中制备得到的纯化液、壁材液和生物固化剂的用量比为25-35ml:15-25ml:100ml:10ml。8.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，壁材液由麦芽糖糊精、壳聚糖和1wt％醋酸水溶液按照用量比10g:0.3g：100ml混合而成。9.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，步骤s3中，喷雾干燥的进风温度140-180℃，雾化器转速为15000-20000rpm/min，出风温度90-100℃，进风温度180-200℃，进料速度为1.5-2l/h。10.根据权利要求1所述的一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，其特征在于，植酸、20wt％乙醇水溶液和京尼平的用量比为3-5g：10ml:0.1-0.14ml。

技术总结
本发明涉及一种抗纤维化醋粉类黑精的制备方法，属于类黑精提取技术领域，包括以下步骤：步骤S1、将食醋和夹带剂装入超临界反应釜中,经萃取工艺，得到纯化食醋液和余液；步骤S2、将步骤S1所得余液经大孔树脂D312离交柱吸附，洗涤，解吸，再经葡聚糖凝胶柱层析，得到纯化液；步骤S3、将步骤S1中制备得到的纯化食醋液、步骤S2中制备得到的纯化液和壁材液，升温至60-65℃，搅拌均匀，再加入生物固化剂，混合均匀，喷雾干燥、出粉、包装，即可，本发明中，将分离得到的纯化食醋液和纯化液经微囊化后，避免了外部环境干扰和喷雾干燥过程中有效成分的挥发，同时，植酸中含有磷酸根，促进了美拉德反应进行，提高了类黑精的含量。提高了类黑精的含量。提高了类黑精的含量。


技术研发人员：夏蓉 程永强 陶汇源 卞瀚勤
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/20