一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针及其制备方法和应用

1.本发明属于医用修复材料领域，具体涉及一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肌腱是一种高度结构化的纤维结缔组织，用于将肌肉与骨骼连接起来并实现身体活动，其主要功能是在肌肉和骨骼之间传递力量、稳定关节，在日常活动中起着至关重要的作用。然而，当肌腱上的负荷超过临界阈值时(如在剧烈运动或过度使用期间通常发生的情况)，肌腱组织极易受到损伤。自21世纪初以来，肌腱病在全球范围内不断增加，导致所有年龄段的运动和非运动个体的长期或永久性功能损害。人群中肌腱病的患病率约为5.9％，而运动员中跟腱疾病的患病率高达23.9％。肌腱的病理变化以肌腱的异常微观结构、成分和细胞结构为特征。具体而言，患病肌腱的炎症反应、i型胶原被iii型胶原替代以及胶原的无序排列导致肌腱的生物力学强度降低。
3.目前肌腱病的治疗主要集中于减轻疼痛和改善功能，很少有考虑致病机制的治疗。治疗方法包括局部治疗和全身治疗，其中局部治疗主要包括以下三种类型：常用药物(糖皮质激素)、生物制剂(富血小板血浆)和干细胞治疗，但前述三种方法均需多次注射，而多次注射可能导致治疗相关并发症。其中，反复注射皮质类固醇可能会损害局部组织的生理愈合反应，并促进疾病进展；此外，尽管富血小板血浆prp被公认为是肌腱病的局部治疗方法，但仍缺乏高水平的研究证据来证明其在治疗跟腱肌腱病方面的有效性；应用祖细胞、干细胞或自体肌腱细胞形式的细胞疗法治疗跟腱肌腱病也存在缺陷：供体特异性(如年龄和性别)显著影响干细胞潜能，包括细胞增殖、分化以及促进血管生成和防止凋亡的能力，且细胞培养技术存在局限性，如体外细胞扩增的安全性和质量以及表型、功能和遗传不稳定性。
4.可溶性微针(mns)可以穿透表皮层，以无痛、无创、无感染的方式进入内部组织。由可生物降解且具有生物相容性的天然聚合物或合成聚合物制成。刺入组织一段时间后mns完全溶解，包裹在聚合物基质中的药物持续释放，这有利于控制药物释放以及增强药物渗透性。
5.ceffe是来源于脂肪组织的无细胞脂肪提取物，具有显著的抗衰老、抗氧化作用。特别指出，ceffe是从人体皮下脂肪组织中提取的无细胞液体，使用无菌机械方法去除细胞成分和脂质残余物，大大降低了其免疫原性并具有良好的生物安全性。然而，经查阅国内外相关文献，尚未见有关ceffe对肌腱病防治作用的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明针对现有肌腱病治疗方法存在单次给药造成疗效不佳、反复注射给药引起相关并发症等问题，提供了一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针及其制备方法和应
用。本发明制得的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针具有低免疫原性、低细胞毒性、高生物相容性等优点，可有效恢复肌腱损伤，满足体内降解要求；且制备方法简单，原料易得、成本低，利于推广应用。
7.本发明首先提供了一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，包括以下步骤：
8.s1，将gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物以及光引发剂溶液混合均匀，获得针体混合液，将所述针体混合液加入到微针模具中，经真空除泡、30℃干燥浓缩处理后，紫外照射固化60s，制得微针尖；
9.s2，加入针体基座溶液至覆盖微针尖，离心去除气泡，30℃干燥过夜，所述的针体基座溶液为甲基丙烯酰化透明质酸溶液；
10.s3，脱模，得到负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针。
11.优选地，所述的gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物的用量比为0.1～0.15g/ml：0.1～0.15g/ml：50～1000μg/ml。
12.优选地，所述的gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物的用量比为0.15g/ml：0.1g/ml：200μg/ml。
13.优选地，所述的光引发剂溶液的浓度为0.5％(w/v)，所述的光引发剂包括苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)亚磷酸锂。
14.优选地，所述的甲基丙烯酰化透明质酸溶液的浓度为4％(w/v)。
15.本发明另一方面还提供了一种根据前面任一项所述的制备方法制得的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，所述的可溶性微针包括微针尖和基座，所述的微针尖包括以下材料：gelma、聚乙烯醇、光引发剂和无细胞脂肪提取物，所述基座的材料为甲基丙烯酰化透明质酸。
16.优选地，所述的微针尖呈圆锥体，针体高度为450～550μm，针体底端的直径为200～350μm。
17.优选地，所述的微针尖以阵列形式排于所述的基座上，相邻两个微针尖之间的距离为600～800μm。
18.本发明另一方面还提供了前面任一项所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针在制备缓解和/或治疗肌腱病药物和/或生物材料中的应用。
19.本发明另一方面还提供了无细胞脂肪提取物在制备缓解和/或治疗肌腱病药物中的应用。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果至少包含：
21.(1)本发明通过一系列体内外实验评价了负载无细胞脂肪提取物的微针(ceffe-mns)不同给药模式对肌腱病的治疗效果，结果发现：
22.ceffe-mns通过抑制tnf/nf-κk信号通路治疗肌腱病，不仅可以有效抑制肌腱损伤细胞的氧化应激和凋亡程度，还能有效抑制炎症反应并促进胶原纤维的生成，能够明显恢复损伤肌腱的拉伸模量和最大机械强度。相较于现有主要是减轻疼痛和改善功能的治疗方法，其针对致病机制治疗肌腱病，治疗效果更稳定、彻底。
23.另外，相较于单次注射ceffe(injection组)，本发明提供的ceffe-mns治疗肌腱病的效果更优，所述的ceffe-mns能穿透表皮层，以无痛、无创、无感染的非侵入方式进入内部
组织，并缓慢降解释放ceffe，最终达到显著治疗肌腱病的效果，且同时避免了反复注射给药引起的相关并发症。
24.(2)本发明提供的ceffe-mns具有低免疫原性、低细胞毒性、高生物相容性等优点，可有效恢复肌腱损伤，满足体内降解要求。具体应用时，将这种可溶性微针制成贴片，施加到损伤跟腱处，随后微针尖脱离基座，并在体内逐步降解缓释ceffe，最终达到缓解、治疗肌腱病的作用。
25.(3)本发明提供的ceffe-mns制备方法简单，原料易得且成本低，利于推广应用。
附图说明
26.图1为ceffe-mns的制备和体外降解实验结果，其中：
27.(a)mn结构示意图。(b)mn的一般视图。(c)ceffe-mns的机械强度试验。(d)不同ceffe含量的ceffe-mns的抗炎效果。(e)ceffe负载mn的退化测试。(f)ceffe-mns在0、3、6、9和12天降解后的大体视图。
28.图2为体外施加ceffe对lps诱导的肌腱细胞氧化应激、凋亡和炎症的影响，其中：
29.(a)dcfh-da染色和亮场成像(放大
×
100)。比例尺，250μm。(b)流式细胞仪显示ceffe显著降低lps诱导的肌腱细胞凋亡。(c，d)将lps(50ng/ml)添加到肌腱细胞以诱导炎症状态，ceffe(200μg/ml)处理后bcl-2、bad、bax、裂解半胱天冬酶3、il-1β、cox-2、col1a、col3、mmp3、mmp13和β-肌动蛋白的蛋白水平。(e)荧光绿dcfh-da染色强度定量，通过imagej计算(n＝3)。(f)凋亡统计的流式细胞术分析(n＝3)。(g-p)对照组、lps组和ceffe组中蛋白质(bcl-2、bad、bax、裂解半胱天冬酶3、il-1β、cox-2、col1a、col3、mmp3、mmp13)的表达水平。(数据显示为平均值
±
sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
30.图3为肌腱的生物力学测试，其中：
31.(a)拉伸试验过程。(b)四组肌腱的应力曲线。(c)四组肌腱的最大力(n＝3)。数据表示为平均值
±
sd*p《0.05，**p《0.01。
32.图4为ceffe-mns体内治疗效果评估，其中：
33.(a)宏观照片、肌腱he染色、masson染色、sirius染色和cox-2的免疫组化。(b)四组(对照组、腱病组、注射组和mns组)中col1、col3、mmp3、mmp13和裂解半胱天冬酶3的免疫组织化学；所有标尺均为50μm。(c)四组肌腱的tem成像。(d)通过imagej(n＝3)计算的四组中炎性增生的总面积。(e)四组肌腱的线粒体面积，通过imagej计算(n＝3)。(f-k)通过imagej计算的四组中cox-2、col1、col3、mmp3、mmp13和cleaved-caspase-3阳性区域的比例(n＝3)。数据表示为平均值
±
sd*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001。
具体实施方式
34.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
35.本发明基于现有肌腱病治疗方法存在单次给药造成疗效不佳、反复注射给药引起相关并发症等问题，通过大量研究发现，无细胞脂肪提取物(ceffe)对肌腱病有明显的治疗效果。因此，首先提供了ceffe的一种新用途，即在制备缓解和/或治疗肌腱病药物中的应用。但在本技术前期局部注射ceffe的研究中发现，ceffe中的生长因子在体内快速降解且不稳定。
36.为了提高ceffe的使用效率并避免重复注射的副作用，本发明经过研究，最终提出了一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针及其制备方法，所述的可溶性微针包括微针尖和基座，所述的微针尖包括以下材料：gelma、聚乙烯醇、光引发剂和无细胞脂肪提取物，所述基座的材料为甲基丙烯酰化透明质酸。
37.一些实施例中，所述的微针尖呈圆锥体，针体高度为450～550μm，针体底端的直径为200～350μm。
38.一些实施例中，所述的微针尖以阵列形式排于所述的基座上，相邻两个微针尖之间的距离为600～800μm。
39.本发明另一方面还提供了所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针在制备缓解和/或治疗肌腱病药物和/或生物材料中的应用。
40.本发明通过一系列体内外实验评价了无细胞脂肪提取物(ceffe)不同给药模式对肌腱病的治疗效果，结果发现：
41.ceffe-mns通过抑制tnf/nf-κk信号通路治疗肌腱病，不仅可以有效抑制肌腱损伤细胞的氧化应激和凋亡程度，还能有效抑制炎症反应并促进胶原纤维的生成，能够明显恢复损伤肌腱的拉伸模量和最大机械强度。相较于现有主要是减轻疼痛和改善功能的治疗方法，ceffe针对致病机制治疗肌腱病，治疗效果更稳定、彻底。
42.另外，相较于单次注射ceffe(injection组)，本发明提供的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针(ceffe-mns)治疗肌腱病的效果更优，所述的ceffe-mns能穿透表皮层，以无痛、无创、无感染的非侵入方式进入内部组织，并缓慢降解释放ceffe，最终达到显著治疗肌腱病的效果，且同时避免了反复注射给药引起的相关并发症。
43.下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明。
44.实验材料：甲基丙烯酰基化明胶(gelma)、聚乙烯醇(pva)和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)亚磷酸锂(lap)以及甲基丙烯酰化透明质酸(ha)均购自engineering for life(中国苏州)，细胞计数试剂盒-8(cck-8)购自dojindo moleculartechnology，inc.(日本熊本)，低葡萄糖dulbecco改良eagle培养基(dmem/低葡萄糖)来自hyclone laboratories inc.(美国犹他州洛根)，胎牛血清(fbs)来自sigmaaldrich(美国密歇根州圣路易斯)，l-谷氨酰胺和青霉素链霉素来自sangon biotech co.ltd.(中国上海)，用于蛋白质印迹的所有蛋白质均来自abcam(英国剑桥)，脂多糖(lps)购自kingmorn life sciences(中国上海)。
45.其中，gelma由明胶和甲基丙烯酸酐制备，氨基取代率为90％，高氨基取代率有利于微针交联后的高机械强度。
46.(一)负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针ceffe-mns的制备及性能表征
47.1、实验方法
48.(1)ceffe准备
49.从健康志愿者获得的新鲜脂肪在离心后进行机械乳化。再次离心后保留第三层水层，使用0.22μm过滤器过滤，并在-80℃下储存。使用双辛可宁酸测定试剂盒(中国上海贝奥蒂美生物科技有限公司)检测ceffe蛋白浓度。
50.(2)ceffe-mns的制备
51.s1，将gelma、pva以及溶解于1ml 0.25％lap溶液中的ceffe混合均匀，获得针体混合液，将所述针体混合液加入到微针模具中，经真空除泡、30℃干燥浓缩处理后，去除多余
的溶液，并在紫外线照射(405nm)下固化尖端60s，制得微针尖；
52.s2，加入针体基座溶液，即300μl 4％ha溶液至覆盖微针尖，离心去除气泡，30℃干燥过夜；
53.s3，脱模，得到负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，4℃的干燥条件下密封储存并尽快使用。
54.其中，设计的微针模具由硅胶制备，设计参数如下：每个mn的微针尖呈圆锥体，针体高度为500μm，针体底端直径为270μm，两个相邻mn之间的距离为700μm。
55.(3)体外降解实验
56.通过浸入模拟体液(sbf)观察ceffe-mns的体外降解。包括：冻干ceffe-mns，确定初始重量后，将ceffe-mns放置在孔径为70μm的细胞过滤器上；将细胞过滤器放置在含有5ml sbf的6孔板上，使得ceffe-mns完全浸没；然后，在每个设定时间点取出ceffe-mns，用去离子水洗涤三次，冷冻干燥，并称重。
57.(4)动物和细胞培养
58.野生型雄性sprague-dawley大鼠(300～400g)(中国上海sipprbk实验动物有限公司)被单独安置在一个温度可控的动物设施中，光/暗循环12小时，并可自由获取食物和水。从大鼠收获跟腱，利用3mg/ml胶原酶i溶液消化肌腱获得肌腱细胞。此外，肌腱细胞在dmem/低葡萄糖、10％fbs、1％l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的湿润环境(37℃，5％co2)中培养。培养基每3天更换一次。在实验中使用f5代内的肌腱细胞。本技术动物实验经过了上海交通大学医学院动物实验伦理委员会批准。
59.(5)ceffe-mns浸提液的制备
60.将制得的ceffe-mns置于含10％fbs、1％l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的dmem/低葡萄糖中，在潮湿环境(37℃，5％co2)中放置72小时，以获得ceffe-mns浸提液。
61.(6)细胞活力测定
62.将肌腱细胞(2000/孔)接种在96孔板中，并在37℃下用5％co2进行培养。培养48小时后，将lps(50ng/ml)和ceffe-mns浸提液(0、50、100、200、500或1000μg/ml ceffe)添加到培养基中。孵育48小时后，根据制造商的说明(n＝5)使用cck-8测定法测定细胞活力，以确定后续实验的最佳ceffe浓度。在dmem/低葡萄糖中培养的细胞，补充10％fbs、1％l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素，作为对照组。
63.2、实验结果
64.(1)ceffe-mns的成分用量的探究
65.本领域公知，要想达到非侵入性治疗，mns必须具有穿透皮肤的强度，然后在治疗期间缓慢降解并释放药物。因此，首先有必要测试mns的渗透性、降解和药物释放特性。
66.本实施例制备了gelma和pva不同含量组合的未负载ceffe的可溶性微针，比较其机械强度及降解性能。结果如图1所示，用15％gelma和10％pva制备的微针的机械强度能够穿透大鼠皮肤(图1的c)，微针在14天内逐渐降解(图1的e-f)。
67.基于上述gelma和pva的研究参数，进一步探究负载不同含量ceffe的mns的抗炎作用。结果如图1的d图所示，cck-8结果显示，负载200μg/ml ceffe的mns具有最佳的抗炎作用。
68.最后，4％ha被用作mns的基座，其溶胀性有利于基座脱离微针尖。
69.(2)ceffe-mns的制备及表征
70.经过前述实验研究，本实施例制备了一种ceffe-mns以进行后续体内外实验疗效的研究，包括以下步骤：
71.s1，将0.15g gelma、0.1g pva以及溶解有200μg的无细胞脂肪提取物的1ml 0.25％lap溶液混合均匀，获得针体混合液，将所述针体混合液加入到微针模具中，经真空除泡、30℃干燥浓缩处理后，去除多余的溶液，并在紫外线照射(405nm)下固化尖端60s，制得微针尖；
72.s2，加入针体基座溶液，即300μl 4％ha溶液至覆盖微针尖，离心去除气泡，30℃干燥过夜；
73.s3，脱模，得到负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，4℃的干燥条件下密封储存并尽快使用。
74.如图1所示，制备得到的ceffe-mns包括微针尖和基座(图1的a和b)。
75.(二)ceffe-mns体外抑制炎症诱导的肌腱细胞凋亡并促进胶原合成
76.1、实验方法
77.(1)动物和细胞培养
78.方法同实验(一)中的动物和细胞培养方法。
79.(2)ceffe-mns浸提液的制备
80.方法同实验(一)中的)ceffe-mns浸提液的制备方法。
81.(3)体外细胞实验
82.将肌腱细胞以3.0
×
105个细胞/孔接种在6孔板中，并分为对照(control)组、lps组和ceffe治疗组。每组细胞在含10％fbs、1％l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的dmem/低葡萄糖中培养，直至粘附。此外，lps(50ng/ml)被用作体外肌腱细胞无菌炎症过程的刺激因子。lps组和ceffe治疗组的肌腱细胞与20ng/ml lps孵育48小时；lps组细胞用正常培养基处理，ceffe治疗组细胞用前述得到的ceffe-mns浸提液处理48小时。处理后，每组细胞用于后续ros测定和蛋白印迹分析。
83.(4)ros测定
84.使用荧光探针(dcfh-da)(beyotime biotechnology)检测不同组肌腱细胞中的ros水平。首先，dcfh-da在无血清培养基中以1：1000的比例稀释至最终浓度10μm。然后，从孔板中取出细胞培养液，向每个孔中加入1ml稀释的dcfh-da，并在37℃下培养板20分钟。将rosup(ros诱导剂)添加到阳性对照中。最后，用无血清细胞培养基洗涤细胞三次以去除未进入细胞的dcfh-da，并在荧光显微镜下观察(leica microsystems，wetzlar，germany)。
85.(5)蛋白印迹分析
86.从每组肌腱细胞中收集总蛋白，使用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(beyotime biotechnology)对总蛋白质浓度进行定量。接下来，将总蛋白进行15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜(millipore，billerica，ma，usa)，在25℃下用5％牛血清白蛋白(bsa)封闭1小时，然后与白介素1β(il-1β)、环氧化酶2(cox2)、col1a、col3、基质金属蛋白酶(mmp)3、mmp13、b细胞淋巴瘤2(bcl-2)及其相关蛋白bad和bax、裂解半胱天冬酶3、drp1、tnf-α、tnf受体1(tnfr1)、iκbα、p-iκbβ、p65、p-p65和β-肌动蛋白在4℃过夜。之后，将混合物与二级过氧化物酶抗体缀合1小时。随后，将膜与抗兔或抗小鼠免疫球
蛋白g(cst，danvers，ma，usa)在室温下孵育1小时。使用odyssey红外成像系统(li-corbiosciences，lincoln，ne，usa)对蛋白质带进行可视化。
87.(6)流式细胞分析
88.使用annexin v/碘化丙啶(pi)凋亡检测试剂盒(yeasen biotechnologyco.，shanghai，china)通过流式细胞术测定lps诱导的肌腱细胞凋亡率。
89.2、实验结果
90.(1)ceffe减轻lps诱导的肌腱细胞的氧化应激和凋亡
91.如图2所示，在lps组大鼠肌腱细胞中观察到显著的氧化应激和凋亡。ceffe治疗组大鼠肌腱细胞中ros的过度产生被部分抑制(图2的a和e)。
92.通过用膜联蛋白-v和pi标记各组大鼠肌腱细胞并进行流式细胞术分析，结果发现：与lps组相比，ceffe治疗组早期和晚期凋亡肌腱细胞的数量显著减少，并接近对照组(图2的b和f)。
93.另外，通过western blot观察细胞凋亡的标记蛋白，获得类似的结果。具体表现为：与lps组相比，ceffe组抗凋亡蛋白bcl-2表达增加，促凋亡蛋白bad、bax和裂解半胱天冬酶3(cleaved caspase 3)表达降低，且与对照组的表达接近(图2的c和g-j)。
94.上述结果表明，ceffe可以减轻lps诱导的肌腱细胞氧化应激和凋亡。
95.(2)ceffe在体外抑制lps诱导的肌腱炎症并促进胶原的合成
96.如图2的d图和k
–
p图所示，50ng/ml lps刺激48小时后，lps组大鼠肌腱细胞中炎性因子il-1β和cox-2的表达显著上调，mmp3和mmp13的表达也升高，表明lps会刺激体外肌腱细胞的慢性炎症。而ceffe治疗组大鼠肌腱细胞中il-1β和cox-2的表达降低，col3、mmp3和mmp13的表达也降低，且col1(i型胶原)的表达显著上调。
97.上述结果表明，ceffe在体外可抑制lps诱导的肌腱炎症并促进胶原的合成。
98.(三)ceffe-mns的体内治疗效果
99.1、实验方法
100.(1)大鼠跟腱病变模型的建立
101.24只成年大鼠，平均体重400g，用于建立跟腱病变模型。在实验室动物中心环境适应1周后，大鼠可随意获得食物和水，除对照组外，每2天在右后腿注射60μl胶原酶i溶液(5mg/ml)。14天后，成功建立了跟腱病变模型。在建立腱病模型后，由于疼痛，下肢的功能可能不协调。所用镇痛剂为美洛昔康，剂量为5mg/kg，皮下注射。单剂量持续24小时。
102.(2)体内动物实验
103.将大鼠随机分为四组：对照组(ctrl组)、腱病变组(tendinopathy组)、ceffe注射组(injection组)和计算机辅助下的ceffe-mns组(mns组)，每组6只，实验单位：一只大鼠。ctrl组和tendinopathy组的大鼠未接受治疗，injection组的每只大鼠通过注射接受200μg ceffe，而mns组的大鼠接受ceffe-mns治疗。人道终点和措施的确定(当动物出现一种或多种症状时，如体重不足或体重下降过快、身体状况不佳、无法进食或饮水、行为异常、严重临床症状等，在出现实验终止指标之前，需要对其实施安乐死)。
104.(3)免疫组织化学
105.治疗14天后，提取所有组大鼠的跟腱，并准备每组的三条肌腱进行苏木精和伊红(he)、masson、sirius和免疫组织化学染色分析。简言之，肌腱组织在分级乙醇系列中脱水，
并在切片成5μm块之前嵌入石蜡中。接下来，将这些切片用二甲苯脱蜡并从乙醇转移到去离子水中。抗原回收过程后，对切片进行不同的染色和免疫组化程序，以检测cox-2、col1、col3、mmp3、mmp13和cleaved-caspase3的表达。
106.(4)生物力学测试
107.对每组抽取的三根跟腱进行机械测试。用手术刀切除跟腱周围的肌肉和血管后，固定跟腱并进行拉伸试验。施加5mm/min的拉伸，直到肌腱断裂，并记录拉伸过程中张力和最大张力的变化。
108.2、实验结果
109.(1)体内ceffe-mns治疗有效改善损伤肌腱的生物力学性能
110.健康的跟腱柔韧、有弹性、结实，能够承受一定程度的拉力。然而，跟腱受伤后，其形态发生显著变化，强度降低，所承受的最大拉力明显低于健康跟腱。因此，本实施例使用跟腱的机械测试来反映mn对其强度的影响(图3的a)。结果显示，随着拉伸距离的持续增加，各组肌腱的张力增加；然而，当张力相同时，tendinopathy组的抗张力能力最差，其次是injection组，mns组和对照组的抗张力较其他两组更好(图3的b)，这表明ceffe-mns治疗可以改善i型胶原酶诱导肌腱导致的跟腱韧性、弹性和强度的显著降低。此外，在使用ceffe-mns治疗后，tendinopathy组的最大张力最低，而mns组的最大张力增加最明显，且与ctrl组无统计学显著差异(图3的c)。这些结果表明，炎性损伤后跟腱的韧性、弹性和强度显著降低，但ceffe治疗可以有效改善这些参数，特别是如果通过ceffe-mns治疗。
111.(2)体内ceffe-mns治疗有效改善损伤肌腱的炎症反应并促进胶原纤维的生成
112.通过大体观察、he、masson和sirius染色、免疫组织化学和其他形态学分析，评估不同ceffe给药模式对大鼠肌腱炎症(由胶原酶i诱导)的影响。
113.参见附图4的a图，从宏观上看，tendinopathy组的跟腱比ctrl组更粗糙、更肿胀。当跟腱被分离时，在胶原酶i诱导后更容易检测跟腱与周围组织的粘附。ceffe治疗(mns组和injection组)14天后，跟腱光滑，其体积恢复正常。
114.he染色显示，tendinopathy组小鼠肌腱纤维排列紊乱，并被炎性细胞浸润，在单次注射ceffe后，胶原纤维的排列比tendinopathy组更整齐、更紧密，并且这种现象在mns组中更明显。
115.masson染色显示，由于胶原纤维肿胀(蓝色染色纤维证明)和细胞外基质的大量减少(红色染色)，胶原蛋白酶i诱导的肌腱炎症使肌腱增厚，但这通过ceffe治疗得以逆转。
116.天狼星(sirius)染色证明，ctrl组中大多数col1(黄色染色)排列整齐；相反，tendinopathy组出现大量col3纤维(绿色染色)，而injection组和mns组的col1逐渐增加(图4的a-b、g-h)。
117.在跟腱组织切片上进行免疫组织化学分析，结果显示，ceffe mns组中炎性因子cox-2表达量低于tendinopathy组和injection组(图4的a和f)；凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的染色结果也显示ceffe mns组的染色强度低于tendinopathy组和injection组(图4的b和k)；与tendinopathy组相比，ceffe治疗后col3显著降低，col1显著增加，并且mns组的这种效果比injection组更明显(图4的b、g-h)；mmp3和mmp13测定结果相似，mns组的阳性染色低于tendinopathy组和injection组(图4的b、i-j)。
118.(3)体内ceffe-mns治疗有效缓解肌腱细胞的线粒体损伤程度
119.tem显示ceffe对肌腱细胞线粒体损伤具有治疗作用。与对照组(control)相比，tendinopathy组的线粒体显著肿胀，空泡化，嵴减少或消失(图4的c)。经ceffe治疗后，肌腱细胞的线粒体损伤程度得到缓解，其中，mns组效果更优，mns组肌腱细胞中线粒体的形态与对照组相似(图4的e)。
120.以上结果表明，ceffe在体内可有效改善损伤肌腱的生物力学性能，改善损伤肌腱的炎症反应并促进胶原纤维的生成，对肌腱损伤具有良好的体内治疗效果。
121.另外，本技术还通过大鼠器官的he染色对ceffe及载药微针进行了生物安全性检测。各组大鼠器官的he染色结果表明，单纯ceffe注射和ceffe-mns给药均未对大鼠产生明显的组织毒性。
122.(四)ceffe通过抑制tnf/nf-κk信号通路治疗肌腱病
123.本技术还对ceffe治疗肌腱病的机制进行了探究。通过转录组测序及kegg富集分析发现，lps诱导炎症相关通路的上调，即与炎症和凋亡相关的tnf信号通路和tnf-nf-κb通路。在体外通过qrt-pcr和western blot检测对照组、lps组和ceffe治疗组肌腱细胞中tnf-nf-κb通路的表达，结果发现与转录组测序结果一致。根据nf-κb通路上关键蛋白的表达，发现lps诱导的肌腱细胞炎症激活nf-κ。具体为：ceffe治疗组肌腱细胞中p-iκbα和p-p65的表达显著低于lps组肌腱细胞，甚至低于对照组肌腱细胞。因此，ceffe可能抑制nf-κb通路的过度激活。
124.综上所述，本发明提供的负载ceffe的可溶性微针具有低免疫原性、低细胞毒性、高生物相容性等优点，可有效恢肌腱损伤，满足体内降解要求；且制备方法简单，原料易得、成本低，利于推广应用。
125.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，将gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物以及光引发剂溶液混合均匀，获得针体混合液，将所述针体混合液加入到微针模具中，经真空除泡、30℃干燥浓缩处理后，紫外照射固化60s，制得微针尖；s2，加入针体基座溶液至覆盖微针尖，离心去除气泡，30℃干燥过夜，所述的针体基座溶液为甲基丙烯酰化透明质酸溶液；s3，脱模，得到负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针。2.如权利要求1所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，其特征在于，所述的gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物的用量比为0.1～0.15g/ml：0.1～0.15g/ml：50～1000μg/ml。3.如权利要求2所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，其特征在于，所述的gelma、聚乙烯醇、无细胞脂肪提取物的用量比为0.15g/ml：0.1g/ml：200μg/ml。4.如权利要求1所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，其特征在于，所述的光引发剂溶液的浓度为0.5％(w/v)，所述的光引发剂包括苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)亚磷酸锂。5.如权利要求1所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针的制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酰化透明质酸溶液的浓度为4％(w/v)。6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法制得的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，其特征在于，所述的可溶性微针包括微针尖和基座，所述的微针尖包括以下材料：gelma、聚乙烯醇、光引发剂和无细胞脂肪提取物，所述基座的材料为甲基丙烯酰化透明质酸。7.如权利要求6所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，其特征在于，所述的微针尖呈圆锥体，针体高度为450～550μm，针体底端的直径为200～350μm。8.如权利要求6所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针，其特征在于，所述的微针尖以阵列形式排于所述的基座上，相邻两个微针尖之间的距离为600～800μm。9.权利要求6-8中任一项所述的负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针在制备缓解和/或治疗肌腱病药物和/或生物材料中的应用。10.无细胞脂肪提取物在制备缓解和/或治疗肌腱病药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针及其制备方法和应用，属于医用修复材料领域。本发明通过一系列体内外实验评价了负载无细胞脂肪提取物的可溶性微针(CEFFE-MNs)对肌腱病的治疗效果，结果发现，CEFFE-MNs不仅可以有效抑制肌腱损伤细胞的氧化应激和凋亡程度，还能有效抑制炎症反应并促进胶原纤维的生成，能够明显恢复损伤肌腱的拉伸模量和最大机械强度。本发明提供的CEFFE-MNs具有低免疫原性、低细胞毒性、高生物相容性等优点，其以非侵入方式进入体内，并缓慢降解释放CEFFE，达到治疗效果，避免反复注射给药引起的相关并发症。另外，本发明制备方法简单，原料易得且成本低，利于推广应用。利于推广应用。利于推广应用。


技术研发人员：阚天佑 谢凯 严孟宁 张文杰 孙林
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/20