用于鉴定美洲商陆的特异性引物及方法与流程

1.本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及用于鉴定美洲商陆的特异性引物及方法。


背景技术：

2.美洲商陆(phytolacca americana l.)，为商陆科、商陆属植物。原产北美洲，1935年在我国杭州采集到标本，并且作为观赏植物被引进中国。美洲商陆已对本地植物的生长和生物多样性造成了一定的影响，因此被列为外来有害生物。美洲商陆易随植物原粮、植物种子及其他产品的调运而传播。美洲商陆全株有毒，根及果实毒性最强。由于其根茎酷似人参，常被人误当作人参采挖或栽种，易被误当人参食用或泡药酒后饮用引起中毒，也有不法商人将较小的美洲商陆的根茎假冒人参、西洋参出售，使患者误服后中毒。我国各地误食商陆中毒事件时有发生，有食用块根中毒，也有食用嫩叶中毒事件的报道。
3.为了快速将有毒植物从众多的相似植物中鉴定出来，人们从宏观到微观各个领域都总结出了许多方法，但是随着鉴定需要的增加以及鉴定要求的提高，传统鉴定方法的短板也逐渐显现，已不能满足日益增长的鉴定需要，结合新兴技术，近年来有毒植物鉴定技术得到了较大发展。本发明建立了美洲商陆的分子生物学鉴定技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供用于鉴定美洲商陆的特异性引物及方法。
5.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一对用于鉴定美洲商陆的特异性引物，包括如seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物。
6.第二方面，本发明提供美洲商陆特异性pcr检测方法，包括以下步骤：
7.1)提取样品dna；
8.2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用seq id no:1-2所示引物进行pcr扩增反应；
9.3)分析pcr产物。
10.优选地，pcr反应体系为：2
×
taq pcr master mix 12.5μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，用ddh2o补齐至总体积25μl。
11.优选地，pcr反应条件为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。
12.第三方面，本发明提供美洲商陆qpcr检测引物及探针，包括如seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物以及seq id no:3所示的探针，且探针的5
′
端带有荧光基团，3
′
端带有荧光淬灭基团。
13.第四方面，本发明提供美洲商陆qpcr检测方法，包括以下步骤：
14.1)提取样品dna；
15.2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用seq id no:1-3所示引物及探针进行pcr扩增反应；
16.3)分析pcr产物。
17.优选地，qpcr反应体系为：2
×
premix ex taq 10μl，10μm上、下游引物各0.4μl，10μm探针0.8μl，dna模板1μl，用ddh2o补齐至总体积20μl。
18.优选地，qpcr反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火及延伸45s，40个循环。
19.利用所述引物和探针进行荧光pcr扩增验证，得到的扩增曲线(图3)，显示只有美洲商陆的6个样品的dna有特异性扩增，ct值＜30，而其他13种易混淆种dna和ddh2o对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对曼陀罗属物种有特异性，如果ct＜30则判断为美洲商陆物种阳性，ct≥30则判断为美洲商陆物种阴性。
20.第五方面，本发明提供含有seq id no:1-2所示引物或seq id no:1-3所示引物及探针的检测试剂或试剂盒。
21.所述试剂盒还可以包括dntps、taq dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。
22.第六方面，本发明提供seq id no:1-2所示引物、seq id no:1-3所示引物及探针，或者所述检测试剂或试剂盒在检测美洲商陆中的应用。
23.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
24.本发明建立的分子生物学方法进行美洲商陆物种鉴定的技术，为实现口岸快速筛查和鉴定提供有效手段，为快速确定毒物种类，制定抢救方案和食物中毒事件处置提供技术支持。
25.本发明提供的美洲商陆实时荧光定量pcr(qpcr)检测法，检测过程简便，可满足中毒事件中早期、快速、准确诊断，加快毒物的清除，对症使用解毒剂，是提高抢救成功率和治愈率的关键。
附图说明
26.图1为本发明较佳实施例中美洲商陆及易混淆物种its2基因序列比对结果。缩写字母代表的物种材料名称见表1；
“‑”
表示缺失碱基；“·”表示相同碱基；方框部分为美洲商陆物种特异性碱基位点。
27.图2为本发明较佳实施例中美洲商陆特异性引物pcr检测结果(a)及灵敏度检测结果(b)。其中：a,1-19泳道分别对应于表1中的样品编号，m为dl500 marker；b,1-6泳道分别为不同浓度的模板dna，分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl，6为ddh2o，m为dl500 marker。
28.图3为本发明较佳实施例中实时荧光定量pcr扩增曲线。
具体实施方式
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1美洲商陆特异性pcr检测方法
30.1.实验材料方法及结果
31.1.1样品采集
32.实验所选材料，具体名称及材料来源见表1，用于实验的植物材料为硅胶干燥的叶片。
33.表1实验材料及其来源
[0034][0035][0036]
1.2基因组dna的提取
[0037]
硅胶干燥的植物叶片100mg置于预先加入4mm钢珠的2ml ep管中，迅速放入液氮中冷冻30min，将ep管置于geno/grinder 2000(spex sampleprep)高通量研磨机上研磨3min，1000rpm。按照qiagen植物基因组dna提取试剂盒(dneasy plant minikit)提取叶片总dna。
[0038]
1.3pcr扩增及测序
[0039]
引物序列its2-f：5
′‑
atgcgatacttggtgtgaat-3
′
；its2-r：5
′‑
gacgcttctccagactacaat-3
′
。pcr反应体系为25μl，包含kodone pcr master mix 12.5μl，dna模板1μl，正、反向引物各0.75μl,ddh2o 10μl。its2序列的pcr扩增程序为：95℃预变性1min；98℃变性10s,56℃退火及延伸5s,40个循环，68℃延伸1s。pcr产物用1％琼脂糖凝胶
电泳检测后，委托上海生工公司进行双向测序。
[0040]
1.4特异性引物的设计
[0041]
采用codon codealigner v3.0对测序峰图进行校正，去除低质量序列及引物区。随后使用基于隐马尔可夫模型(hmmer)的注释方法将所有序列及所需的genbank序列去除两端的5.8s和28s区段，进而获得its2间隔区序列。
[0042]
所有序列用bioedit软件进行比对分析(图1)，发现在its2基因的43bp处，美洲商陆为a，其它种为g；201bp处美洲商陆为a，其它种为t。与其它材料存在特异性，适合用于设计上下游特异性引物，特异性引物pam f、pam r的信息如表2所示：
[0043]
表2特异性引物(seq id no:1-2)
[0044]
引物名称引物序列(5'-3')引物位置pam fatacctagtggaggggagggga22bp-43bp区间pam raggttttgagcacgaggctcat201bp-222bp区间
[0045]
1.5普通pcr特异性扩增及灵敏度检测
[0046]
用特异性引物分别对表1中19份样品dna进行pcr扩增，检测引物的特异性。25μl反应体系：2
×
taq pcr master mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号kt201)12.5μl，引物pam f/pam r(浓度均为10μm)各1μl，dna模板1μl，用ddh2o补齐至总体积25μl。
[0047]
pcr扩增程序为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。
[0048]
反应结束后取5μl扩增产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0049]
利用本发明设计的特异性引物对pam f/pam r，对美洲商陆物种及其易混淆种dna进行pcr扩增，电泳结果显示只有美洲商陆物种的6个样品有特异性扩增，扩增片段长度约为201bp，其它种均无扩增片段，说明该引物对美洲商陆具有特异性。特异性检测电泳结果如图2中a所示，同时对扩增序列blast比对结果表明，该目标片段属于美洲商陆。
[0050]
pcr灵敏度检测结果如图2中b所示，当模板dna浓度为1ng/μl时，即可产生明亮的条带。
[0051]
实施例2美洲商陆qpcr检测方法
[0052]
1.taqman-mgb探针的设计
[0053]
在已筛选出的种特异性引物(pam f/pam r)基础上，进行种特异性taqman探针设计。根据序列比对结果，在美洲商陆特异性引物范围内，通过primer express 3.0软件在上下游引物间区域设计特异性的荧光探针。
[0054]
探针设计原则如下：1)5’端第一个碱基不能为g；2)3’端的前四个碱基避免有3个或以上g；3)探针与引物的距离越近越好；4)gc％含量在30％-70％之间，且退火温度在65℃-67℃之间；5)探针长度在13bp-25bp之间；6)避免出现重复喊基，尤其避免4个以上的g重复出现，避免6个a连续出现；7)选择c比g多的序列作为探针。探针委托上海生物工程技术服务有限公司合成。
[0055]
探针pam mgb：5
′‑
fam-agctccaactggcaa-mgb-nfq-3
′
(seq id no:3)
[0056]
2.荧光定量pcr反应
[0057]
实时荧光pcr反应总体系为20μl，包括：2
×
premix ex taq 10μl，上、下游引物(10μmol/l)各0.4μl，探针(10μmol/l)0.8μl，ddh2o 7.4μl，dna模板1μl。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火及延伸45s，40个循环。
[0058]
利用所设计的引物和探针进行荧光pcr扩增验证，得到的扩增曲线(图3)，显示只有美洲商陆的6个样品的dna有特异性扩增，ct值＜30，而其他13种易混淆种dna和ddh2o对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对曼陀罗属物种有特异性，如果ct＜30则判断为美洲商陆物种阳性，ct≥30则判断为美洲商陆物种阴性。
[0059]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.用于鉴定美洲商陆的特异性引物，其特征在于，包括如seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物。2.美洲商陆特异性pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样品dna；2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用权利要求1所述引物进行pcr扩增反应；3)分析pcr产物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，pcr反应体系为：2
×
taq pcr master mix 12.5μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，用ddh2o补齐至总体积25μl。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，pcr反应条件为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。5.美洲商陆qpcr检测引物及探针，其特征在于，包括如seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物以及seq id no:3所示的探针，且探针的5
′
端带有荧光基团，3
′
端带有荧光淬灭基团。6.美洲商陆qpcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样品dna；2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用权利要求5所述引物及探针进行pcr扩增反应；3)分析pcr产物；qpcr反应体系为：2
×
premix ex taq 10μl，10μm上、下游引物各0.4μl，10μm探针0.8μl，dna模板1μl，用ddh2o补齐至总体积20μl。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，qpcr反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火及延伸45s，40个循环。8.含有权利要求1所述引物或权利要求5所述引物及探针的检测试剂或试剂盒。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dntps、taq dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。10.权利要求1所述引物、权利要求5所述引物及探针，或者权利要求8或9所述检测试剂或试剂盒在检测美洲商陆中的应用。

技术总结
本发明公开了用于鉴定美洲商陆的特异性引物及方法。用于鉴定美洲商陆的特异性引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，并在此基础上设计了TaqMan-MGB探针，建立美洲商陆实时荧光定量PCR检测法，检测过程简便，可满足中毒事件中早期、快速、准确诊断。本发明建立的分子生物学方法进行美洲商陆物种鉴定的技术，为实现口岸快速筛查和鉴定提供有效手段，为快速确定毒物种类，制定抢救方案和食物中毒事件处置提供技术支持。支持。


技术研发人员：宋云 徐晗 翟俊峰 赵文军 许瑾
受保护的技术使用者：中国检验检疫科学研究院
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/20