一种高效利用木质纤维素水解液生产甘油的方法

1.本发明提供了一种高效利用木质纤维素水解液生产甘油的方法，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.丙三醇(glycerol)又名甘油，分子式c3h8o3，是一种重要的平台化合物，是化工、食品和炸药工业中的重要原料。在化学工业中，甘油也是作为生产聚合物和特种化学品的廉价和可再生原材料，例如1,3-丙二醇、乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和丙酸，以及氢气和二羟基丙酮等。食品中加入甘油，通常是作为一种甜味剂和保湿物质，使食品爽滑可口。硝化甘油广泛用于炸药工业。甘油可与水以任何比例溶解，低浓度丙三醇溶液可做润滑油对皮肤进行滋润，广泛用于化妆品行业。甘油的来源一般是从石化原料的化学合成产生，这种方法对设备要求较高，分离提取难度大、成本高；也可从肥皂生产中回收或者微生物发酵生产。随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，微生物发酵法越来越受到人们的重视。微生物发酵法生产甘油具有绿色环保而且甘油纯度高的特点。
3.木质纤维素是农业以及林业制造产生的废弃物，如甘蔗渣、玉米芯等。木质纤维素生物质供应广泛且丰富，是一种很有前途的生产化学品的绿色经济原料。纤维素生物质水解后的主要可用成分是葡萄糖和木糖。木糖是自然界中第二丰富的糖，占纤维素水解物中总糖的30％，可用作生产各种基本化学品的一个来源。木糖的有效利用是开发木质纤维素生物质的必要条件。由于木质纤维素原料内部结构成网状紧密排列，组成复杂，木质纤维原料未经预处理时酶解得率不到20％，效率低而且非常缓慢。因此，预处理是木质纤维原料发酵必不可少的环节。通过预处理，在一定浓度化学试剂、温度、压力下可有效破坏木质纤维素的致密结构，降低聚合度和结晶度，增加酶与底物的接触面积，从而提高酶解效率。甘蔗渣经过预处理和酶糖化后才能被微生物进一步利用。在一些最常用的预处理方法中，通过酸水解可以获得更高的收率。但与酸水解相比，碱性水解的温度更低，水解时间更短，因此更简单、更经济。
4.酶解过程不可避免的会产生有毒物质，如糠醛，乙酸等，会抑制微生物生长，从而降低木质纤维素水解物的利用率。特别是在典型的稀酸预处理条件下，生物质原料会降解生成一系列结构复杂的抑制物。这些发酵抑制物的种类和浓度与原料和预处理条件密切相关，随着抑制物浓度的增加，严重影响细胞活力和生长速度，延长生长延滞期，降低酶解和发酵过程中葡萄糖和木糖的转化率。
5.为了降低纤维素水解液毒性，并提高生产效率，水解液得脱毒处理是常用的方法之一。具体方法包括：
①
添加化学试剂，如碱、还原剂和聚合物；
②
酶处理；
③
加热和汽化；
④
萃取，包括液-液萃取和液-固萃取，其中液-固萃取包括离子交换法和活性炭处理等技术。但是脱毒处理往往会造成水解液中糖类的损失，而且额外引入了处理步骤增加发酵的成本。因此只有提高发酵菌株的抑制物耐受性或采用耐受性高的菌株，使其适应未脱毒的水解液环境，才能从根本上解决水解液抑制物对酵母产生的毒害影响。
6.产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018是一株能够耐受木质纤维素水解液毒性的耐高渗酵母，在高渗高毒性等恶劣环境下能高产甘油。是一株能够发酵未脱毒水解液的良好菌株。


技术实现要素：

7.针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种以耐高渗透压的candida glycerinogenes为生产菌株发酵木质纤维素水解液生产甘油的方法。采用本发明构建得到的耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6，可利用未经脱毒的木质纤维素水解液(包含约60g/l的葡萄糖和40g/l的木糖)生成50.8g/l的甘油。
8.本发明的第一个目的是提供一种高效代谢未经脱毒的木质纤维素水解液生产甘油工程菌的构建方法，所述工程菌以产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018为宿主，将来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶基因xyl1、木糖醇脱氢酶xyl2、木酮糖激酶xks1，以及candida glycerinogenes自身转醛缩酶tal1、转酮醇酶tkl1、糖转运蛋白hxt4基因整合到宿主中，构建高效发酵木质纤维素水解液生产甘油的工程菌；所述方法是将上述基因整合到产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018基因组中得到cg-6。cg-6能够高效发酵木质纤维素水解液生产甘油，所用水解液不用进行脱毒处理，也不用调节ph，直接可用于发酵。
9.本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌为cg-6，在产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018的基因组上，整合表达了来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶xyl1、来源于scheffersomyces stipitis的木糖醇脱氢酶xyl2、来源于scheffersomyces stipitis的木酮糖激酶xks1、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1及来源于candida glycerinogenes的糖转运蛋白hxt4。
10.在本发明的一种实施方式中，所述木糖还原酶氨基酸序列的genbank号为：caa42072.1；所述木糖醇脱氢酶氨基酸序列的genbank号为：aad28251.1；所述木酮糖激酶氨基酸序列的genbank号为：eaz63302.2，所述转醛缩酶氨基酸序列如seq id no.1所示；所述转酮醇酶tkl1氨基酸序列如seq id no.2所示；所述糖转运蛋白hxt4氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.在本发明的一种实施方式中，编码所述木糖还原酶xyl1核苷酸序列的gene id：4839234；编码所述木糖醇脱氢酶xyl2核苷酸序列的gene id：4852013；编码所述木酮糖激酶xks1核苷酸序列的gene id：4850923，编码所述转醛缩酶tal1核苷酸序列如seq id no.4所示；编码所述转酮醇酶tkl1核苷酸序列如seq id no.5所示；编码所述糖转运蛋白hxt4核苷酸序列如seq id no.6所示。
12.在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为cg-6，按照木糖还原酶基因xyl1、木糖醇脱氢酶xyl2、木酮糖激酶xks1、转醛缩酶基因tal1、转酮醇酶基因tkl1、糖转运蛋白基因hxt4的顺序依次整合至产甘油假丝酵母cctcc m 93018的基因组上的5.8s rrna位点。
13.本发明还提供了高效代谢木质纤维素水解液生产甘油工程菌的构建方法包括如下步骤：
14.(1)将来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶xyl1、来源于
scheffersomyces stipitis的木糖醇脱氢酶xyl2、来源于scheffersomyces stipitis的木酮糖激酶xks1、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1及来源于candida glycerinogenes的糖转运蛋白hxt4依次连接到purgapu质粒apai和noti两个酶切位点之间，构建重组表达载体，采用saci线性化重组表达载体；
15.(2)采用醋酸锂转化法将线性化重组表达载体转化到产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018基因组中，构建高效代谢木质纤维素水解液生产甘油工程菌cg-6。
16.本发明还提供了一种可利用未脱毒纤维素水解液生产甘油的方法，所述方法为，采用产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018或上述基因工程菌，以未经脱毒木质纤维素水解液作为碳源，进行发酵制备得到甘油。
17.在本发明的一种实施方式中，所述未经脱毒木质纤维素水解液的制备方法包括以下步骤：
18.(1)将木质纤维素粉碎成颗粒，过筛后烘干至恒重；
19.(2)在固液质量比1:15-1:25的条件下，将步骤(1)得到的烘干后纤维素置于0.5mol/l的naoh溶液中，60-80℃水浴搅拌150rpm反应2h进行水解；
20.(3)水解结束后，用hcl调节水解液ph值中性，过滤水解后的固体纤维素，用清水洗涤两遍，烘干至恒重；
21.(4)酶解：在酶解前，用0.2m的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节系统的ph值至5.0；纤维素酶用量为5～20fpu/g木质纤维素(dm)，酶解固体负荷为8-25％(w/v)；在50℃，150rpm下酶解72～96h后离心得到的木质纤维素水解液。
22.在本发明的一种实施方式中，在发酵过程中需要加入nacl。
23.在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为：发酵温度为25～37℃，发酵ph为3.5～8.0，转速为200～300r/min，发酵时间为72～96h。
24.本发明还提供了一种提高产甘油假丝酵母产甘油能力的方法，所述方法为，在产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018的基因组上，整合表达了来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶xyl1、来源于scheffersomyces stipitis的木糖醇脱氢酶xyl2、来源于scheffersomyces stipitis的木酮糖激酶xks1、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1及来源于candida glycerinogenes的糖转运蛋白hxt4。
25.在本发明的一种实施方式中，所述木糖还原酶氨基酸序列的genbank号为：caa42072.1；所述木糖醇脱氢酶氨基酸序列的genbank号为：aad28251.1；所述木酮糖激酶氨基酸序列的genbank号为：eaz63302.2，所述转醛缩酶氨基酸序列如seq id no.1所示；所述转酮醇酶tkl1氨基酸序列如seq id no.2所示；所述糖转运蛋白hxt4氨基酸序列如seq id no.3所示。
26.本发明还提供了上述基因工程菌或上述方法在甘油工业生产中的应用。
27.有益效果
28.(1)本发明构建得到的耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6耐受性高，克服了木质纤维素水解液中有毒物质在发酵过程中对菌株的毒害作用，能在未脱毒水
解液中良好生长。
29.(2)本发明耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6可发酵未脱毒木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖，糖利用高，发酵液中几乎不残留可发酵糖。
30.(3)本发明耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6可以直接发酵未经ph调节的未脱毒的木质纤维素水解液，可发酵ph范围3.5-8.0。
31.(4)本发明耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6可发酵温度范围为25-40℃，适应性强，有利于该菌株在甘油工业生产、国防军事、药物制备以及食品添加中的应用。
32.(5)本发明耐高渗透压的candida glycerinogenes菌株cg-6具有甘油产量高，糖转化率高的特点，经检测，该菌株可利用木质纤维素水解液生成50.8g/l的甘油,糖转化率超过50％。
33.(6)本发明采用的水解工艺简单，对设备和工艺条件要求不高；用水量以及酶量少，经济，绿色环保。
附图说明
34.图1为不同菌株的96h木糖代谢能力对比。
35.图2为不同菌株在不同木质纤维素水解液中甘油产量。
36.图3为生产菌株cg-6在100l发酵罐中发酵未脱毒甘蔗渣水解液情况。
具体实施方式
37.下述实施例中所涉及的纤维素酶购自夏盛生物技术有限公司(河北，中国)
38.下述实施例中所涉及的培养基如下：
39.ypd培养基：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。
40.ypx培养基：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，木糖20g/l。
41.mm固体培养基：ynb(无氨基酵母氮源)6.7g/l，酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。
42.ysb培养基：木质纤维素水解液(葡萄糖60g/l，木糖40g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l。
43.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
44.木糖浓度的检测方法：
45.色谱条件：hplc(高效液相色谱仪)氨基hpx-87h柱(bio-rad)，检测条件为5mm硫酸作为移动相，流速0.6ml/min，色谱柱温度60℃，检测器为差分检测器ri-101(shodex)。
46.下述实施例中所涉及的醋酸锂法转化酵母细胞的方法如下：
47.接种活化的产甘油假丝酵母细胞于10ml ypd培养基中30℃过夜培养。按1％接种量接种50ml ypd培养基，培养至od 600为1左右。6000r/min离心3min收集菌体，加入1ml无菌水轻柔悬浮洗涤，离心弃去上清液，重复两次。加入44μl无菌水轻柔悬浮菌体，再分别加入240μl 50％聚乙二醇溶液(peg)，36μl 1m醋酸锂(liac)，20μl ssdna(鲑鱼精dna，预先沸水浴10min，然后冰上冷却1min)，500ng线性化dna片段。充分轻柔地吹吸混匀，置于42℃水浴锅中热激1h。6000r/min离心收集菌体，弃去上清液，加入1ml ypd培养基，30℃培养2h。培
养后的菌体6000r/min离心收集，用无菌水洗涤两次。涂布于mm固体培养基上，30℃培养3d，获得产甘油工程菌。
48.下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示
49.表1：引物(5
’‑3’
)
[0050][0051]
[0052]
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
[0053]
实施例1：产甘油工程菌cg
ss
、cg
ci
、cg
ct
、cg-6菌株的构建
[0054]
(1)重组载体的构建
[0055]
分别将来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶基因xyl1(gene id：4839234)、来源于scheffersomyces stipitis木糖醇脱氢酶xyl2(gene id：4852013)、来源于scheffersomyces stipitis木酮糖激酶xks1(gene id：4850923)、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1(核苷酸序列如seq id no.4所示)、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1(核苷酸序列如seq id no.5所示)以及来源于scheffersomyces stipitis的糖转运蛋白基因xut4(gene id：4840896)，所述基因依次连接至质粒purgapu的apai和noti酶切位点之间，获得重组质粒purgapu-ssxyl1-xyl2-xks1-tal1-tkl1-xut4；将载体命名为purgapu-1。
[0056]
分别将来源于candida intermedia的木糖还原酶基因xyl1(核苷酸序列如seq id no.7所示)、来源于candida intermedia的木糖醇脱氢酶xyl2(核苷酸序列如seq id no.8所示)、来源于candida intermedia的木酮糖激酶xks1(核苷酸序列如seq id no.9所示)、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1(核苷酸序列如seq id no.4所示)、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1(核苷酸序列如seq id no.5所示)以及来源于scheffersomyces stipitis的糖转运蛋白基因xut4(gene id：4840896)，所述基因依次连接至质粒purgapu的apai和noti酶切位点之间，获得重组质粒purgapu-cixyl1-xyl2-xks1-tal1-tkl1-xut4；将载体命名为purgapu-2。
[0057]
分别将来源于candida tropicalis的木糖还原酶基因xyl1(gene id：8298564)、来源于candida tropicalis的木糖醇脱氢酶xyl2(核苷酸序列如seq id no.10所示)、来源于candida tropicalis的木酮糖激酶xks1(核苷酸序列如seq id no.11所示)、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1(核苷酸序列如seq id no.4所示)、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1(核苷酸序列如seq id no.5所示)以及来源于scheffersomyces stipitis的糖转运蛋白基因xut4(gene id：4840896)，所述基因依次连接至质粒purgapu的apai和noti酶切位点之间，获得重组质粒purgapu-ctxyl1-xyl2-xks1-tal1-tkl1-xut4；将载体命名为purgapu-3；
[0058]
分别将来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶基因xyl1(gene id：4839234)、木糖醇脱氢酶xyl2(gene id：4852013)、木酮糖激酶xks1(gene id：4850923)、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1(核苷酸序列如seq id no.4所示)、转酮醇酶基因tkl1(核苷酸序列如seq id no.5所示)以及糖转运蛋白基因hxt4(核苷酸序列如seq id no.6所示)所述基因依次连接至质粒purgapu的apai和noti酶切位点之间，获得重组质粒purgapu-xyl1-xyl2-xks1-tal1-tkl1-hxt4；将载体命名为purgapu-4。
[0059]
所涉及的pcr反应体系为(50μl)：25μl prime star max premix(2
×
)，15pmol引物(所涉及引物如表1所示)，150ng模板，加双蒸水至50μl(引物为亦欣生物科技(上海)有限公司)合成，其余购于takara公司)。
[0060]
pcr扩增条件为：98℃变性10s，60℃退火15s,72℃延伸1kb/1min，30个循环；72℃延伸10min。
[0061]
(2)重组菌的构建
[0062]
采用saci将步骤(1)得到的重组表达载体purgapu-1、purgapu-2、purgapu-3、purgapu-4单酶切为线性化dna片段。
[0063]
采用醋酸锂转化法将线性化重组表达载体转化到产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018基因组的5.8s rrna位点(核苷酸序列如seq id no.12所示)中，分别构建产甘油工程菌m 93018/ss-xyl1-xyl2-xks1-tal-tkl-xut4、m 93018/ci-xyl1-xyl2-xks1-tal-tkl-xut4、m 93018/ct-xyl1-xyl2-xks1-tal-tkl-xut4、m93018/xyl1-xyl2-xks1-tal1-tkl1-hxt4，分别命名为：cg
ss
、cg
ci
、cg
ct
、cg-6，同时，将原始菌株产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018，命名为cg。
[0064]
实施例2：产甘油工程菌cg、cg
ct
、cg
ci
、cg
ss
以及cg-6木糖利用能力检测
[0065]
具体步骤如下：
[0066]
(1)分别挑取1环产甘油工程菌cg、cgct、cgci、cgss、cg-6接入ypd种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到种子液。
[0067]
(2)分别将种子液按5％(v/v)的接种量接入50ml ypx发酵培养基中，控制发酵温度为30℃，往复式摇床，转速为150r/min，发酵时间为96h，每隔12h取样测定od
600
和样品中木糖浓度，产物确认采用高效液相色谱检测。
[0068]
具体结果如表2及图1所示。
[0069]
表2：不同产甘油工程菌株木糖利用能力检测
[0070][0071]
结果显示，工程菌株cg-6能代谢完培养基中的20g/l的木糖，而cg几乎不能代谢木糖，cg
ct
、cg
ci
、cg
ss
的木糖代谢能力在cg与cg-6之间。
[0072]
实施例3：不同菌株在纤维素水解液中甘油产量
[0073]
具体步骤如下：
[0074]
1、纤维素水解液的制备方法
[0075]
(1)木质纤维素(甘蔗渣或玉米芯)粉碎成颗粒后通过40的网筛(《0.425mm)后于60℃烘干至恒重。
[0076]
(2)在固液质量比1:15-1:25的条件下，将烘干后的纤维素置于0.5mol/l的naoh溶液中，80℃水浴搅拌150rpm反应2h。
[0077]
(3)水解结束后，用hcl调节水解液ph值中性，过滤水解后的固体纤维素，用清水洗涤两遍，后于60℃烘干至恒重，制备得到固体纤维素。
[0078]
(4)在酶解前，向步骤(3)得到的固体纤维素中添加0.2m的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并调节系统的ph值至5.0；向含有纤维素的缓冲液中添加纤维素酶，纤维素酶用量为8～
15fpu/g木质纤维素(dm)，酶解固体负荷为10％(w/v)；在50℃，150rpm下酶解72～96h后离心得到的纤维素水解液；
[0079]
(5)分别制备得到甘蔗渣水解液和玉米芯水解液，分别将得到的甘蔗渣水解液和玉米芯水解液加热浓缩至总糖浓度为100g/l(葡萄糖浓度与木糖浓度约为3:2)用于甘油发酵。
[0080]
2、甘油的制备
[0081]
(1)分别挑取1环产甘油工程菌cg、cg
ss
、cg
ci
、cg
ct
、cg-6，接入ypd种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到种子液。
[0082]
(2)分别将种子液按5％(v/v)的接种量接入30ml ysb发酵培养基中(总糖100g/l)，控制发酵温度为32℃，往复式，转速为150r/min，发酵时间为96h，每隔12h取样测定od
600
和样品中糖和甘油浓度，产物采用高效液相色谱检测。
[0083]
ysb发酵培养基：纤维素水解液(葡萄糖60g/l，木糖40g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l，用纤维素水解液定容到1l。
[0084]
具体结果如表3及图2所示：
[0085]
表3：不同菌株发酵不同纤维素水解液能力
[0086][0087][0088]
结果显示，所有菌株均能消耗掉所有葡萄糖，但是只有产甘油工程菌cg-6几乎能够消耗掉所有木糖，甘油产量最高为36.81g/l。
[0089]
实施例4：生产菌株cg-6发酵脱毒与未脱毒甘蔗渣水解液情况
[0090]
(1)挑取1环产甘油工程菌cg-6，接入ypd种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到种子液。
[0091]
(2)将种子液按5％(v/v)的接种量接入30ml ysb发酵培养基中(总糖100g/l)，控制发酵温度为32℃，往复式，转速为150r/min，发酵时间为84-120h，检测得到的发酵液中的甘油产量；其中ysb发酵培养基分为未脱毒ysb发酵培养基和脱毒ysb发酵培养基，成分如下：
[0092]
未脱毒ysb发酵培养基：浓缩后的甘蔗渣水解液(葡萄糖60g/l，木糖40g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l，nacl 30g/l，用纤维素水解液定容到1l。
[0093]
脱毒ysb发酵培养基：脱毒后浓缩的甘蔗渣水解液(葡萄糖60g/l，木糖40g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l，nacl 30g/l，用脱毒后的纤维素水解液定容到1l；脱毒后浓缩的甘蔗渣水解液的制备：将制备的纤维素水解液加入2％的活性炭，200rpm/min孵育1h。
[0094]
具体结果如表4所示。
[0095]
表4：生产菌株cg-6在不同浓度nacl下的甘油能力
[0096][0097]
结果表明发酵脱毒后的甘蔗渣水解液酵母长势良好od
600
达到25.82，而发酵未脱毒的甘蔗渣水解液的甘油产量更高达到44.82g/l。
[0098]
实施例5：生产菌株在cg-6在100l发酵罐下的甘油生产情况
[0099]
(1)挑取1环产甘油工程菌cg-6，接入ypd种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到一级种子液。
[0100]
(2)将一级种子液按1％(v/v)的接种量接入总糖约为80g/l的未浓缩的ysb培养基(采用实施例3的步骤1的(1)～(4)的方法制备得到的未浓缩的纤维素水解液)中，30℃，200r/min条件培养24h得到二级种子液。
[0101]
总糖约为80g/l的未浓缩的ysb培养基的制备：未浓缩的甘蔗渣水解液(葡萄糖浓度：木糖浓度为3:2，总糖为80g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l，用未浓缩的甘蔗渣水解液定容到1l。
[0102]
(3)将制备得到的二级种子液按5％(v/v)的接种量接种于总糖浓度为100g/l的浓缩后的ysb培养基(采用实施例3的步骤1的方法制备得到的未浓缩的纤维素水解液)，发酵培养基中添加3％的nacl，使用100l发酵罐，温度30℃，通气量1.5vvm，转速500r/min自然ph；总糖浓度为100g/l的浓缩后的ysb培养基的制备：浓缩后甘蔗渣水解液(葡萄糖浓度：木糖浓度为3:2，总糖浓度为100g/l)，尿素2g/l，玉米浆10g/l，用浓缩后的甘蔗渣水解液定容到1l。
[0103]
结果发现(图3)，采用本发明的菌株产甘油工程菌cg-6，能够利用未脱毒的甘蔗渣水解液进行甘油的制备，且最终甘油产量为50.6g/l。
[0104]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，在产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018的基因组上，整合表达了来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶xyl1、来源于scheffersomyces stipitis的木糖醇脱氢酶xyl2、来源于scheffersomyces stipitis的木酮糖激酶xks1、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1及来源于candida glycerinogenes的糖转运蛋白hxt4。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述木糖还原酶氨基酸序列的genbank号为：caa42072.1；所述木糖醇脱氢酶氨基酸序列的genbank号为：aad28251.1；所述木酮糖激酶氨基酸序列的genbank号为：eaz63302.2，所述转醛缩酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述转酮醇酶tkl1的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述糖转运蛋白hxt4的氨基酸序列如seq id no.3所示。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述木糖还原酶xyl1核苷酸序列的gene id：4839234；编码所述木糖醇脱氢酶xyl2核苷酸序列的gene id：4852013；编码所述木酮糖激酶xks1核苷酸序列的gene id：4850923，编码所述转醛缩酶tal1核苷酸序列如seq id no.4所示；编码所述转酮醇酶tkl1核苷酸序列如seq id no.5所示；编码所述糖转运蛋白hxt4核苷酸序列如seq id no.6所示。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述整合表达为，按照木糖还原酶基因xyl1、木糖醇脱氢酶xyl2、木酮糖激酶xks1、转醛缩酶基因tal1、转酮醇酶基因tkl1、糖转运蛋白基因hxt4的顺序依次整合至产甘油假丝酵母cctcc m 93018的基因组上的5.8s rrna位点。5.一种可利用未脱毒纤维素水解液生产甘油的方法，其特征在于，所述方法为，采用产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018或权利要求1～4任一所述的基因工程菌，以未脱毒的木质纤维素水解液作为碳源，发酵制备得到甘油。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述未脱毒的木质纤维素水解液的制备方法包括以下步骤：(1)将木质纤维素粉碎成颗粒，过筛后烘干至恒重；(2)在固液质量比1:15-1:25的条件下，将步骤(1)得到的烘干后纤维素置于0.3-1mol/l的naoh溶液中，60-80℃水浴搅拌150-200rpm反应2h进行水解；(3)水解结束后，用hcl调节水解液ph值中性，过滤水解后的固体纤维素，用清水洗涤两遍，烘干至恒重；(4)酶解：在酶解前，用0.2m的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节系统的ph值至4.5-6.0；纤维素酶用量为5～20fpu/g木质纤维素(dm)，酶解固体负荷为8-25％(w/v)；在40-55℃，150-200rpm下酶解72～96h后离心后不经任何处理得到未脱毒木质纤维素水解液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述未脱毒的木质纤维素水解液直接用于发酵，不用脱毒也无需调节ph；所述发酵的条件为：发酵温度为25～37℃，转速为200～300r/min，发酵ph为3.5～8.0，发酵时间为72～96h。8.一种提高产甘油假丝酵母产甘油能力的方法，其特征在于，所述方法为，在产甘油假丝酵母(candida glycerinogenes)cctcc m 93018的基因组上，整合表达了来源于scheffersomyces stipitis的木糖还原酶xyl1、来源于scheffersomyces stipitis的木糖
醇脱氢酶xyl2、来源于scheffersomyces stipitis的木酮糖激酶xks1、来源于candida glycerinogenes的转醛缩酶基因tal1、来源于candida glycerinogenes的转酮醇酶基因tkl1及来源于candida glycerinogenes的糖转运蛋白hxt4。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述木糖还原酶氨基酸序列的genbank号为：caa42072.1；所述木糖醇脱氢酶氨基酸序列的genbank号为：aad28251.1；所述木酮糖激酶氨基酸序列的genbank号为：eaz63302.2，所述转醛缩酶氨基酸序列如seq id no.1所示；所述转酮醇酶tkl1氨基酸序列如seq id no.2所示；所述糖转运蛋白hxt4氨基酸序列如seq id no.3所示。10.权利要求1～4任一所述的基因工程菌或权利要求5～9任一所述的方法在甘油工业生产或制备含有甘油的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种高效利用木质纤维素水解液生产甘油的方法，属于微生物技术领域。本发明提供了一种以耐高渗透压的Candida glycerinogenes为生产菌株发酵纤维素水解液生产甘油的方法。采用本发明构建得到的耐高渗透压的Candida glycerinogenes菌株Cg-6，该菌株能够耐受纤维素水解液中有毒物质，有效克服了水解液对宿主生产菌的生长抑制，可利用纤维素水解液(包含约60g/L的葡萄糖和40g/L的木糖)生成50.8g/L的甘油。本发明的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。前景广等特点。前景广等特点。


技术研发人员：诸葛斌 姜东琪 王梦萦 陆信曜 宗红
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/20