过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

1.本发明涉及基因工程和微生物领域，具体地说，涉及一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。


背景技术：

2.氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。
3.固氮微生物在常温常压下，利用体内的固氮酶能将空气中的氮气还原成铵，供植物生长利用。但固氮效率受铵浓度的影响，即，在限铵或铵浓度低时固氮，铵浓度一般大于5mm以上抑制固氮。在贫瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生长但不固氮。因此，获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。
5.本发明构思如下：ald基因存在于部分微生物中，ald基因编码的丙氨酸脱氢酶催化丙氨酸合成和分解，而丙氨酸的合成前体为丙酮酸，因而在碳氮代谢中起到中间桥梁的作用。本发明首次发现，在固氮类芽孢杆菌中，高铵固氮现象与丙氨酸脱氢酶相关。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物，所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属(paenibacillus)微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的。
7.所述过表达的途径可选自以下1)～6)，或任选的组合：
8.1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
9.2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
10.3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
11.4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
12.5)通过导入增强子而增强；
13.6)通过使用具有编码高活性丙氨酸脱氢酶的基因或等位基因而增强。
14.所述ald基因可以来自多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、固氮类芽孢杆菌(paenibacillus sabinae)等。
15.在本发明的一个具体实施方式中，ald基因来自多粘类芽孢杆菌wly78，其核苷酸序列为：
16.i)seq id no:1所示的核苷酸序列；
17.ii)seq id no:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
18.iii)在严格条件下与seq id no:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％ sds的0.1
×
sspe或含0.1％ sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
19.iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
20.ald基因编码的丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:4所示。
21.可选地，ald基因过表达是通过如下方式实现的：将ald基因启动子区(seq idno:5)的转录调控因子glnr结合位点(glnr结合位点的序列为：tgtcattttacatgaca)中的tgtcat替换为ggatcc(bamh i酶切位点)。
22.进一步地，出发菌株可以是多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。
23.第二方面，本发明提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：
24.(1)利用引物aldpf和aldr(seq id no:2和3)，以多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)wly78基因组为模板pcr扩增得到长1329bp的片段；用tiangen胶回收试剂盒切胶回收片段；
25.(2)用bamhi和hindiii酶切质粒phy300plk，得到酶切片段；
26.(3)将步骤(1)的回收片段和步骤(2)的酶切片段，通过gibson组装得到重组载体phy78ald；
27.(4)将重组载体phy78ald转化到多粘类芽孢杆菌wly78感受态细胞中，筛选具有四环素抗性的菌株，即得。
28.优选地，步骤(4)的转化为电击转化。
29.第三方面，本发明提供ald基因在诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮的应用。
30.所述应用包括：利用基因工程手段，使所述微生物过表达ald基因，以诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮。
31.所述ald基因来自类芽孢杆菌属微生物，优选多粘类芽孢杆菌、固氮类芽孢杆菌，更优选多粘类芽孢杆菌wly78。
32.出发菌株可以是多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。
33.前述的应用，所述高铵条件指微生物所处环境中nh
4+
的浓度为30～400mm。
34.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
35.本发明提供一种耐铵固氮微生物，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，通过过表达多粘类芽孢杆菌wly78中的ald基因，成功赋予了菌株高铵固氮能力，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
36.图1为本发明较佳实施例中野生型菌株(wt)和wt/ald菌株在不同铵浓度条件下固氮酶活性比较。其中，1：野生型菌株(wt)，2：wt/ald菌株。
37.图2为本发明较佳实施例中野生型菌株(wt)和wt/27ald菌株在无铵和高铵条件下固氮酶活性比较。
38.图3为本发明较佳实施例中野生型菌株(wt)和mpald菌株在无铵和高铵条件下固氮酶活性比较。
39.图2和图3中，-n：无铵培养基，+n：高铵培养基。
具体实施方式
40.本发明旨在提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。
41.本发明采用如下技术方案：
42.本发明提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物，将来自多粘类芽孢杆菌的ald基因与表达载体重组后转化至固氮微生物，所述ald基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
43.进一步地，所述微生物为固氮类芽孢杆菌属微生物。
44.进一步地，本发明以多粘类芽孢杆菌为例，提供所述耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：
45.(1)利用引物aldpf和aldr(seq id no:2和3)，以paenibacillus polymyxa wly78基因组为模板pcr扩增得到长1329bp的表达盒；用tiangen胶回收试剂盒切胶回收片段；
46.(2)用bamhi和hind iii酶切质粒phy300plk，得到酶切片段；
47.(3)用gibson assembly master mix(new england biolabs)将回收纯化后的片段和酶切纯化后的phy300plk组装在一起，得到重组载体phy78ald；
48.(4)将重组载体phy78ald通过电击转化到paenibacillus polymyxa wly78感受态细胞中，筛选得到具有四环素抗性的菌株，经pcr验证和测序确认得到ald基因过表达菌株wt/ald。
49.第二方面，本发明提供seq id no:1所示的ald基因在诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮的应用，通过使所述微生物中含有ald基因的表达载体，诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮作用。
50.所述类芽孢杆菌属微生物优选为多粘类芽孢杆菌。
51.本发明所述的高铵条件指微生物所处环境中nh
4+
的浓度为30～400mm。
52.本发明提供的过表达ald基因的耐铵固氮微生物，在限铵和高铵下，均具有固氮酶活性。而野生型菌株只在0-5mm nh
4+
范围内才有固氮酶活性。
53.本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
54.例如，本发明使用的bamhi/hindiii限制性内切酶购自new england biolabs。质粒phy300plk购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。paenibacillus polymyxa wly78由中国农业大学生物学院陈三凤课题组提供，也可以使用购自上海柯维化学技术有限公司的多粘类芽孢杆菌进行替代。
55.paenibacillus polymyxa wly78已在文献(comparative genomic analysis of n
2-fixing and non-n
2-fixing paenibacillus spp.:organization,evolution and expression of the nitrogen fixation genes，jian-bo xie etc.，plos genetics，doi:10.1371/journal.pgen.1004231)中公开。
56.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例
均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
57.实施例1 ald基因过表达的固氮类芽孢杆菌的构建
58.1.引物与载体
59.aldpf：5
′‑
atggaaaaacgctttgcccaatattcatcaaaaagtcgagc-3
′
(seq id no:2)；
60.aldr：5
′‑
ttataacaggaattcccgggctattgtaaggctttcgc-3
′
(seq id no:3)。
61.phy300plk：穿梭质粒，tcr，购自biovector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心(ntcc典型培养物保藏中心)。
62.2.利用引物aldpf和aldr，以paenibacillus polymyxa wly78基因组为模板pcr扩增得到长1329bp的片段，其中包含ald启动子区和ald基因。
63.用tiangen胶回收试剂盒切胶回收上述片段；用bamhi和hindiii酶切质粒phy300plk，37℃酶切3h后过柱回收。
64.用gibson assembly master mix(new england biolabs)将纯化后的片段和酶切纯化后的phy300plk组装在一起，得到重组载体phy78ald。
65.将重组载体phy78ald通过电击转化到paenibacillus polymyxa wly78感受态细胞中，筛选得到具有四环素抗性的菌株，经pcr验证和测序确认得到同源双交换后的ald过表达菌株wt/ald。
66.实施例2固氮酶活性测定
67.将ald基因过表达菌株wt/ald和野生型菌株(wt)分别培养在添加不同铵浓度的基本培养基中，培养10h以上测定固氮酶活力(乙炔还原法)。
68.固氮酶活(nmol c2h4/mg protein hr)的计算公式如下：
[0069][0070]
基本培养基的配方如下：每升液体培养基中含10.4g na2hpo4,3.4g kh2po4,26mg cacl2·
2h2o,30mg mgso4,0.3mg mnso4,36mg ferric citrate,7.6mg na2moo4·
2h2o,10mg对氨基苯甲酸,5μg生物素和4g葡萄糖。
[0071]
测定固氮酶活力(乙炔还原法)的具体方法可参见a minimal nitrogen fixation gene cluster from paenibacillus sp.wly78 enables expression of active nitrogenase in escherichia coli.liying wang etc.，plos genet.，doi:10.1371/journal.pgen.1003865。
[0072]
实验结果如图1所示，野生型菌株(wt)在30-400mm nh
4+
条件下几乎没有固氮酶活性，而ald基因过表达菌株wt/ald菌株在30-400mm nh
4+
条件下都可以固氮，且在100mm nh
4+
条件下的固氮酶活性能达到在无铵条件下的水平。
[0073]
实施例3固氮类芽孢杆菌的培养
[0074]
将固氮类芽孢杆菌wt/ald培养在培养基(蔗糖36g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母粉11g/l，mgso
4 0.51g/l，nacl 3.5g/l，na2moo
4 g/l，feso
4 g/l)，在30℃振荡培养36-48h，活菌浓度达108个/g。
[0075]
实施例4在多粘类芽孢杆菌中过表达来自固氮类芽孢杆菌的ald基因
[0076]
1.引物与载体
[0077]
aldpf:5
′‑
atggaaaaacgctttgcccaatattcatcaaaaagtcgagc-3
′
[0078]
aldp27r:5
′‑
cgatgatcatttcattcacctctcctaaaaataatg-3
′
[0079]
t27aldf:5
′‑
ggtgaatgaaatgatcatcggagtacctaag-3
′
[0080]
t27aldr:5
′‑
ttataacaggaattcccgggttagatcagggtaaactcttg-3
′
[0081]
phy300plk：穿梭质粒，tcr，购自biovector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心(ntcc典型培养物保藏中心)。
[0082]
2.将来自paenibacillus sabinae t27(genbank:cp004078)的ald基因(seq idno:6)在paenibacillus polymyxa wly78中进行过表达，测定对固氮酶活的影响。利用引物t27aldf和t27aldr，以p.sabinae t27基因组为模板pcr扩增得到长1134bp的的ald基因编码区；利用引物aldpf和aldp27r，以p.polymyxa wly78基因组为模板pcr扩增得到长198bp的ald启动子区，将两个片段重组于线性化的phy300plk载体，得到重组载体phy27ald。将phy27ald转化至p.polymyxa wly78，得到ald基因过表达突变株wt/27ald。
[0083]
将野生型(wt)、wt/27ald突变株分别培养在含有0mm nh4cl的基本培养基(无铵培养基，-n)和100mm nh4cl的基本培养基(高铵培养基，+n)中培养并测定固氮酶活性，培养10h以上测定固氮酶活力(乙炔还原法)，结果如图2所示，野生型菌株(wt)在高铵条件下没有固氮酶活性，而wt/27ald菌株能在高铵条件下固氮，表明来自其他固氮类芽孢杆菌的ald基因也能诱导p.polymyxa wly78进行高铵固氮。实施例5多粘类芽孢杆菌wly78的ald基因启动子区的glnr结合位点突变菌株构建
[0084]
1.引物与载体
[0085]
p1：5
′‑
acgatgcgtccggcgtagagtactgtcccttcgataacaatcgc-3
′
[0086]
p2：5
′‑
tgtaaaggatcctaaagacatatacataaggagaatgccgatg-3
′
[0087]
p3：5
′‑
tctttaggatcctttacatgacatatattcatcaaaaagtcgagcc-3
′
[0088]
p4：5
′‑
cgcaaaagacataatcgatactattgtaaggctttcgc-3
′
[0089]
prn5101：温敏型穿梭质粒，emr，购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。
[0090]
2.利用引物p1和p2，以paenibacillus polymyxa wly78基因组为模板pcr扩增得到长984bp的序列；利用引物p3和p4，以paenibacillus polymyxa wly78基因组为模板pcr扩增得到长1353bp的序列；用tiangen胶回收试剂盒切胶回收上述两个片段。
[0091]
用bamhi和hindiii酶切温敏型质粒prn5101，得到酶切片段。
[0092]
用gibson assembly master mix(new england biolabs)将回收纯化后的2个片段和酶切纯化后的prn5101组装在一起，得到载体pmald。
[0093]
将载体pmpald通过电击转化到paenibacillus polymyxa wly78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经pcr验证和测序确认得到同源双交换后的ald启动子区glnr结合位点突变的菌株mpald。
[0094]
将野生型、mpald突变株在含有0mm和100mm氯化铵的基本培养基中培养并测定固氮酶活性，结果如图3所示，mpald突变株在高铵条件下具有固氮酶活性，说明通过调控ald基因的表达也能诱导p.polymyxa wly78进行高铵固氮。
[0095]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.过表达ald基因的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属(paenibacillus)微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的；所述过表达的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；5)通过导入增强子而增强；6)通过使用具有编码高活性丙氨酸脱氢酶的基因或等位基因而增强。2.根据权利要求1所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述ald基因来自多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、固氮类芽孢杆菌(paenibacillus sabinae)。3.根据权利要求2所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述ald基因的核苷酸序列为：i)seq id no:1所示的核苷酸序列；ii)seq id no:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与seq id no:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，将ald基因启动子区的转录调控因子glnr结合位点中的tgtcat替换为ggatcc。5.根据权利要求1-4所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，出发菌株为多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。6.过表达ald基因的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用引物aldpf和aldr，以多粘类芽孢杆菌wly78基因组为模板pcr扩增得到长1329bp的片段；用tiangen胶回收试剂盒切胶回收片段；(2)用bamhi和hindiii酶切质粒phy300plk，得到酶切片段；(3)将步骤(1)的回收片段和步骤(2)的酶切片段，通过gibson组装得到重组载体phy78ald；(4)将重组载体phy78ald转化到多粘类芽孢杆菌wly78感受态细胞中，筛选具有四环素抗性的菌株，即得；其中，所述引物aldpf和aldr的核苷酸序列分别如seq id no:2和3所示。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)的转化为电击转化。8.ald基因在诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮中的应用；所述应用包括：利用基因工程手段，使所述微生物过表达ald基因；所述ald基因来自类芽孢杆菌属微生物，优选多粘类芽孢杆菌、固氮类芽孢杆菌，更优选多粘类芽孢杆菌wly78。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，出发菌株为多粘类芽孢杆菌，优选多粘类
芽孢杆菌wly78。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述高铵条件指微生物所处环境中nh
4+
的浓度为30～400mm。

技术总结
本发明公开了过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的。本发明构建的耐铵固氮微生物，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。在农业生产中具有广阔的应用前景。


技术研发人员：陈三风 李琴
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.01.16
技术公布日：2023/7/20