基于cysB突变体的高产L-半胱氨酸基因工程菌及应用

基于cysb突变体的高产l-半胱氨酸基因工程菌及应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种cysb突变体，以及基于cysb突变体构建的高产l-半胱氨酸的基因工程菌，以及该基因工程菌株在微生物发酵制备l-半胱氨酸中的应用。
(二)

背景技术：

2.在大肠杆菌中，硫酸盐转运蛋白、还原硫酸盐以及合成半胱氨酸的酶的表达均由转录调控因子cysb控制，其cysb蛋白作为硫酸盐代谢和半胱氨酸生物合成的分子传感器，不断监测代谢中间物的细胞内水平。转录调控因子cysb属于lysr型转录调控因子(lttrs)，其分子量为36kda，是一种正向调控靶基因转录的dna结合蛋白，同时也抑制自身的表达。
3.cysb调控蛋白通常以二聚体或四聚体形式行使功能。其中lbd(即ligand binding domain)约由70个氨基酸组成，dbd(即dna binding domain)约由228个氨基酸组成，两者通过柔性接头连接。其中，通过salmonella typhimurium中的cysb的晶体结构显示，lbd包含两个rd结构域(rdi和rdii)，由两个小的多肽片段连接。其中rdi(即site-1)可与硫化物和nas特异性结合，rdii(即site-2)可与nas和oas特异性结合，并且oas通过与site-2的结合改变site-1的结构，但site-1的突变对site-2介导的oas激活无影响。
4.在大肠杆菌微生物发酵生产l-半胱氨酸的过程中，对于硫源的利用率始终没有提高，故希望通过cysb的结构变化在一定程度上增强与硫化物的同化。但目前利用生物法生产l-半胱氨酸仍存在缺陷，例如生产过程中对硫的利用率较低，生长速率缓慢等问题。因此，构建一株更高产且稳定的l-半胱氨酸菌株仍是一大挑战。
(三)

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种cysb突变体，以及基于cysb突变体构建的高产l-半胱氨酸的基因工程菌，以及该基因工程菌株在微生物发酵制备l-半胱氨酸中的应用。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种cysb突变体，其核苷酸序列如seq id no.10所示。
8.本发明还涉及所述cysb突变体在构建高产l-半胱氨酸的基因工程菌中的应用。
9.本发明还涉及基于cysb突变体构建的高产l-半胱氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌由如下方法构建：对调节转录因子cysb的硫酸盐结合口袋进行突变，获得核苷酸序列如seq id no.10所示的突变体cysb
q128l
，使其在底盘菌eyc::dksac-1中过表达，得到eyc::dksac-1/peb
q128l
，即所述高产l-半胱氨酸的基因工程菌。
10.具体的，所述基因工程菌是按如下方法构建获得的：构建荧光报告系统，对转录调控因子cysb的硫酸盐结合口袋进行随机突变后高通量筛选，根据荧光强度筛选出效果较好的cysb突变点，并且运用基因编辑技术，通过中高拷贝质粒ptrc99a-peb使其在底盘菌e.coli w3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae::p
yhao-apfab689-tolc/pe(即eyc::dksac-1，已在202211335028.1中记载)中过表达，得到eyc::dksac-1/peb
q128l
，即所述高产l-半胱氨酸的基因工程菌。
11.本发明在前期实验室已构建的无质粒、无诱导剂使用的l-半胱氨酸生产菌株eyc::dksac-1的基础上，运用了代谢工程改造、酶改造、生物传感器的优化等方式，构建了一株性能更优的l-半胱氨酸生产菌株。
12.cysb作为转录调控因子，在自然情况下以四聚体形式存在与dna启动子区域结合，且结合后行使激活/抑制作用，目前已知基因cysk、cyspuwa、cysm、cysjih、等均为cysb正向激活基因，且cysb会抑制自身基因的表达，故本发明通过构建荧光报告系统，连接激活基因的启动子区与egfp荧光表达蛋白，使该系统对cysb的表达强度较为敏感，从而通过荧光强度的表达强弱直接反映cysb表达强度的强弱变化。本发明通过对cysb的第一个口袋进行易错pcr，该口袋可以与硫酸盐分子以及nas结合，可直接影响到l-半胱氨酸合成途径中对硫源的摄取效率，除此之外，nas及oas作为与cysb的第二个口袋结合的小分子，同时也是大肠杆菌生成l-半胱氨酸中硫代硫酸盐及硫酸盐途径中共同使用的碳骨架，对l-半胱氨酸的合成也起到了关键作用。
13.本发明利用96深孔板筛选，构建了cysb突变文库，以荧光强度的表达强弱先选择了其中3个突变体，并对此进行基因测序，随后通过摇瓶发酵进一步选择出荧光强度表达较优的突变体，最终将其与生产菌株整合，使l-半胱氨酸的效价提高了3.3％，也使基因工程菌在单位时间内生长效率提高了32.7％。
14.本发明基因工程菌株的构建方法具体如下所示：
15.运用基因编辑技术，在eyc::dksac-1中对cysb进行突变，得到eyc::dksac-b1菌株，同时将cysb
q128l
与pe质粒相连接，得到peb
q128l
质粒，随后将该质粒于底盘菌株eyc::dksac-b1中过表达，得到eyc::dksac-b1/peb
q128l
，即所述基于cysb突变体高产l-半胱氨酸的基因工程菌。
16.本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备l-半胱氨酸中的应用。
17.具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有amp抗性的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养至od600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mm的iptg，之后转至30℃，150-200rpm下继续培养48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到l-半胱氨酸。
18.所述摇瓶发酵培养基组成如下：葡萄糖30-50g/l，(nh4)2so
4 5-20g/l，酵母提取物3-10g/l，蛋白胨1-5g/l，kh2po
4 0.5-5g/l，na2hpo
4 0.5-5g/l，na2s2o35-15g/l，微量元素溶液0.5-2ml/l，溶剂为去离子水，ph自然。另外单独称取0.01g/ml caco3，分装到摇瓶中调节ph。
19.微量元素溶液组成为：mnso4·
8h2o 2-10g/l，mgso4·
7h2o 300-700g/l，feso4·
7h2o 2-15g/l，znso
4 2-10g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
20.通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至lb培养基中，于37℃、150-200rpm的摇床上过夜培养，之后以体积浓度1％接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。
21.本发明的有益效果主要体现在：
22.本发明在对cysb的硫酸盐结合口袋进行随机突变的同时，通过构建的荧光报告系统进行高通量筛选，筛选出对硫源结合能力更优的cysb突变体，并基于突变体构建了一种能够对cysb表达强度一株性能更优的高产l-半胱氨酸的基因工程菌，相对于出发菌株，基因工程菌单位时间内生长效率提高了32.7％，最终使l-半胱氨酸的效价提高了3.3％。
(四)附图说明
23.图1为不同基因启动子在m9培养基中的荧光强度的变化；
24.图2为不同基因启动子在m9改良培养基中的荧光强度的变化；
25.图3为荧光报告系统ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp构建示意图；
26.图4为菌株w3110/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp在m9培养基中的生长曲线和荧光强度变化；
27.图5为菌株w3110-δcysb/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp在m9培养基中的生长曲线和荧光强度变化；
28.图6为利用荧光报告系统在96深孔板中高通量筛选cysb突变体；
29.图7为3株筛选突变体在m9培养基中荧光强度的变化；
30.图8为3株筛选突变体在m9改良培养基中荧光强度的变化；
31.图9为500ml摇瓶发酵中eyc::dksac-b1/peb
q128l
的od
600
和l-半胱氨酸的效价变化；
32.图10为5l发酵罐中eyc::dksac-b1/peb
q128l
的od
600
和l-半胱氨酸的效价变化；
(五)具体实施方式
33.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
34.以下实施例中，所述氨苄青霉素在培养基中终浓度为0.1mg/l、卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/l、维生素b1在培养基中终浓度为0.005mg/l。
35.本发明所述亲本菌株e.coli w3110来自耶鲁大学cgsc保藏中心(coli genetic stock center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号cgsc#4474，已在专利us 2009/0298135 a1，us 2010/0248311中公开。
36.实施例1-5中使用的引物序列信息如表2所示，
37.表1：基因编辑所涉及的基因及相应途径
38.基因涉及途径cysb半胱氨酸合成途径
39.表2：引物序列
40.[0041][0042]
[0043]
实施例1：l-半胱氨酸含量的hplc测定
[0044]
检测方法如下：
[0045]
(1)色谱方法：c18柱(250
×
4.6mm，particle size 5μm，agilent technologiesco.，santa clara，ca，usa)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
[0046]
发酵液处理：取1ml菌液于2ml的ep管中，在10000-15000rpm/min条件下离心1-4min；将上清与沉淀分离后分别处理，用于l-半胱氨酸以及其他代谢产物的检测。
[0047]
(2)衍生化反应体系：称取cnbf 0.27g溶于10ml乙腈中作为a液，存于棕色避光瓶中，于4℃保存，宜现配现用。以0.2m硼酸溶液和0.05m硼砂溶液作为母液，以4:1体积比混合配成ph＝9.0标准缓冲液记为b液。将发酵样品稀释成0-5g/l浓度，按照100μl上清、500μl硼酸缓冲液b液以及300μl衍生化试剂a液比例混合，将其于60℃600rpm下金属浴反应1h后过膜处理于棕色液相瓶中待测。
[0048]
(3)检测方法：仪器为赛默飞uplc超高压液相色谱仪。色谱柱为c18柱(4.6
×
250nm，5μm)；紫外检测器检测波长260nm；进样量10μl；柱温30℃；流速为0.8ml/min；流动相使用ab两相，a相为纯乙腈；b相为50mm hac-naac缓冲液:乙腈＝83.0:17.0，用hac调节ph至4.9。
[0049]
数据采集时间：23min。
[0050]
实施例2：荧光报告系统中启动子的筛选及摇瓶验证
[0051]
以e.coli w3110为底盘菌株，通过构建重组质粒ptrc99a-p
cysk-egfp、ptrc99a-p
cysjih-egfp、ptrc99a-p
cysp-egfp，将其化转导入底盘菌株e.coli w3110中，验证不同启动子对荧光强度变化的影响。
[0052]
(1)构建ptrc99a质粒线性化载体：以原始ptrc99a质粒为模板，使用引物ptrc99a-f与ptrc99a-r对其进行线性化开环处理。pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1-3h消化处理，消化结束后，对产物进行纯化、测核酸浓度，最终得到ptrc99a线性化载体片段。
[0053]
(2)几种原始启动子的片段扩增：使用https://www.ecocyc.org网站查找cysk、cysp、cysjih基因或基因簇所对应的启动子，以野生型e.coli w3110基因组为模板，使用引物cysk
ec-f和cysk
ec-r、cysp
ec-f和cysp
ec-r、cysjih
ec-f和cysjih
ec-r对其分别进行pcr扩增目的片段，并将t
rpoc
连接于p
cysk
之前。产物经核酸胶电泳验证后，对其进行纯化、测核酸浓度，最终得到扩增的cysk、cysp、cysjih的启动子片段(参见seq id no.1～3)。
[0054]
(3)绿色荧光蛋白表达框egfp构建：对该基因进行合成，并使用引物egfp-f和egfp-r对其进行pcr扩增验证，产物经核酸胶电泳验证后，对其进行纯化、测核酸浓度，最终得到扩增的egfp片段(参见seq id no.4)。
[0055]
(4)质粒ptrc99a-p
cysk-egfp、ptrc99a-p
cysjih-egfp、ptrc99a-p
cysp-egfp构建：以ptrc99a线性化载体和扩增的cysk、cysp、cysjih的启动子片段以及egfp片段为模板，参照一步克隆试剂盒(clonexpress ultra one step cloning kit)说明书添加反应体系，于50℃温度下放置15-20min后，取出立即放置于冰上降温，即可将cysk、cyspuwam、cysjih的启动子片段以及egfp片段基因片段分别整合到ptrc99a(k)质粒多克隆位点上，之后将其连接产物转化至dh5α化转感受态，菌落pcr验证成功后，通过挑菌接试管，即可得到重组质粒ptrc99a-p
cysk-egfp、ptrc99a-p
cysp-egfp、ptrc99a-p
cysjih-egfp(参见seq idno.5～7)。
[0056]
(5)将上述四种重组质粒转化至底盘菌e.coli w3110中，以e.coli w3110/ptrc99a为对照菌株，设定三组平行，分别接种到m9基本盐培养基中，37℃、150-200rpm培养用作预培养物；18～24h后，接种1ml预培养物到装有50ml的两种m9培养基中外加不同硫源的500ml摇瓶中，然后在25-30℃、150-200rpm培养至菌体浓度达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mm的iptg，继续培养24h；培养结束后取1ml菌液，并使用紫外分光光度计和酶标仪检测其菌体浓度和荧光强度，绘制菌株生长曲线和荧光强度变化曲线如图1、2所示。
[0057]
由图可见，通过构建不同基因启动子的重组质粒ptrc99a-p
cysk-egfp、ptrc99a-p
cysp-egfp、ptrc99a-p
cysjih-egfp对荧光强度的影响不同，其中重组质粒ptrc99a-p
cysk-egfp的相对荧光强度较高。这说明不同的启动子，对cysb表达的敏感强度不同。
[0058]
m9培养基(外加双硫源)：na2hpo
4 6g/l，kh2po
4 3g/l，nh4cl 1g/l，vb
1 0.5g/l，mncl
2 0.01g/l，fecl
3 0.2mg/l，glucose 10g/l，nacl 0.5g/l，mgcl2·
6h2o 0.2g/l，na2s2o
3 4.74g/l，na2so4·
10h2o 19.33g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0059]
m9改良培养基(外加双硫源)：glucose 10g/l，na2hpo
4 6g/l，kh2po
4 3g/l，na2s2o
3 4.74g/l，na2so4·
10h2o 19.33g/l，nh4cl 1g/l，mncl2·
4h2o 0.01g/l，nacl 0.5g/l，mgcl2·
6h2o 0.2g/l，fecl
3 0.2mg/l，vb
1 5mg/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0060]
lb培养基：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l nacl，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0061]
实施例3：荧光报告系统的构建及摇瓶验证
[0062]
以e.coli w3110-δcysb为底盘菌株，通过构建重组质粒ptrc99a-cysb-pcysk-egfp，将其化转导入底盘菌株e.coli w3110-δcysb中，验证重组质粒对菌株生长过程中荧光强度变化的影响。
[0063]
(1)构建ptrc99a-p
cysk-egfp质粒线性化载体：以ptrc99a-p
cysk-egfp重组质粒为模板，使用引物cysb-xxh-f与cysb-xxh-r对其进行线性化开环处理。pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行纯化、测核酸浓度，最终得到ptrc99a-p
cysk-egfp线性化载体片段。
[0064]
(2)原始cysb片段扩增：以野生型e.coli w3110基因组为模板，使用引物cysb
ec-f和cysb
ec-r对其进行pcr扩增目的片段，产物经核酸胶电泳验证后，对其进行纯化、测核酸浓度，最终得到扩增的cysb片段(参见seq id no.8)。(3)质粒ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp构建：以ptrc99a-p
cysk-egfp线性化载体和扩增的cysb片段为模板，参照一步克隆试剂盒(clonexpress ultra one step cloning kit)说明书添加反应体系，于50℃温度下放置15-20min后，取出立即放置于冰上降温，即可将cysb基因片段整合到ptrc99a-p
cysk-egfp(k)质粒多克隆位点上，之后将其连接产物转化至dh5α化转感受态，菌落pcr验证成功后，通过挑菌接试管，即可得到ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp重组质粒，如图3所示(参见seq id no.9)。
[0065]
(4)将荧光报告系统ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp分别转化至底盘菌株e.coli w3110和e.coli w3110-δcysb中，并以e.coli w3110/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp为对照菌株，设定三组平行，分别接种到m9基本盐培养基中，37℃、150-200rpm培养用作预培养物；18-24h后，接种1ml预培养物到装有50ml的m9培养基的500ml摇瓶中，然后在25-30℃、150-200rpm
培养至菌体浓度达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mm的iptg，继续培养；在培养过程中定时取样，并使用紫外分光光度计和酶标仪检测其菌体浓度和荧光强度，绘制菌株生长曲线和荧光强度变化曲线如图4、5所示。
[0066]
由图4、5可见，e.coli w3110-δcysb/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp菌株较e.coli w3110/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp菌株的生长速率减缓，荧光强度虽有一定削弱，但都可以在荧光显微镜下观察到一定的绿色荧光，故可证明构建的荧光报告系统，即ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp质粒能够敏感响应cysb基因的表达强度。
[0067]
实施例4：易错pcr随机突变cysb的硫酸盐结合口袋及高通量筛选突变体
[0068]
以e.coli w3110-δcysb/ptrc99a-cysb-p
cysk-egfp菌株为出发菌株，将大肠杆菌原始cysb蛋白的硫酸盐结合口袋进行随机突变，通过各个突变体的荧光强度的变化高通量筛选cysb正向突变体。
[0069]
(1)对cysb的硫酸盐结合口袋进行易错pcr：以大肠杆菌原始cysb基因为模板，参照即用型易错pcr试剂盒(instant error-prone pcr kit)说明书添加反应体系，使用引物error pcr-f和error pcr-r对cysb蛋白的硫酸盐结合口袋进行随机突变，对随机突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证回收后，测定核酸浓度，最终得到cysb易错pcr片段。
[0070]
(2)将质粒ptrc99a-cysb
error pcr-p
cysk-egfp构建：将质粒ptrc99a-cysb
error pcr-p
cysk-egfp通过使用引物error xxh-f和error xxh-r开环线性化，对其经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ消化酶对剩余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到开环质粒；随后以线性化载体与cysb随机突变片段为模板，参照一步克隆试剂盒(clonexpress ultra one step cloning kit)说明书添加反应体系，于50℃温度下放置15-20min后，立即放置于冰上降温，即可将突变片段整合到线性化载体上，之后将其连接产物转化至w3110-δcysb化转感受态。
[0071]
(3)96深孔板高通量筛选cysb突变体：将化转转化子挑至装有1ml/每孔的m9培养基外加双硫源的96深孔板中，并在其中加入终浓度为0.1mm的iptg对其进行诱导，然后在25-30℃、150-200rpm培养至菌体浓度达到od
600
＝0.3-0.5左右时，于低温离心机中4℃、4000-5000rpm离心10-20min后，用1
×
pbs(ph＝8.0)的磷酸盐缓冲液重悬后再次以上述条件进行离心，按其步骤重复两次后用1
×
pbs(ph＝8.0)的磷酸盐缓冲液重悬，并将每孔取200μl于96酶标板中进行菌体浓度的测定及对应荧光强度的测定，最终绘制不同突变体相对荧光强度的热图，如图5所示。
[0072]
由图可见，通过对蛋白cysb的硫酸盐结合口袋随机突变，与对照菌株相比，有部分突变株的相对表达强度高于对照菌株，根据相对荧光强度对突变株进行排序后，选择了3个突变菌株对其进行进一步的摇瓶验证，即第44、48、73号3个突变体。
[0073]
实施例5：3种突变体的摇瓶验证
[0074]
(1)3种突变体的摇瓶验证：将上述3种突变体划线于含有卡那霉素抗性的平板培养皿中，于37℃恒温培养箱中过夜培养后，挑选单菌落于装有10ml m9培养基试管中，于25-30℃、150-200rpm中培养进行活化；培养18-20h后，将1ml菌液到接种到两种改良后的装有50ml的m9培养基的500ml摇瓶中，并且每种菌株做三个平行，并向其中添加终浓度为0.1mm的iptg，于25-30℃、150-200rpm中培养24h后对菌液进行取样；取1ml菌液后离心并用1
×
pbs(ph＝8.0)的磷酸盐缓冲液清洗培养基，后取200μl重悬菌液分别进行浓度测定及荧光
强度测定，最终绘制不同突变体相对荧光强度，如图7、8所示。
[0075]
由图7、8可见，44号、48号、73号突变体中44号突变体的相对荧光强度最高，较对照组提高了54.7％，相对荧光强度为17622.1。故以44号突变体菌体裂解物为模板，使用引物tb-yz-f和tb-yz-r进行pcr扩增后经核酸胶电泳验证，并送至擎科公司进行测序，得到突变体序列详情，即得到cysb
q128l
(参见seq id no.10)。
[0076]
磷酸盐缓冲液：nacl 8g/l，kcl 0.2g/l，na2hpo
4 1.1g/l，kh2po
4 0.27g/l，溶剂为去离子水，ph值调至8.0。
[0077]
实施例6：底盘菌eyc::dksac-1构建
[0078]
(一)工程菌e.coliw3110eyc::p
yhao-yded的构建：
[0079]
(1)以ptarget质粒(addgene plasmid#62226)为模版，通过pcr扩增(引物pttb-f和pttb-r)，对grna进行定点突变。用dpni对pcr产物进行消化。将消化产物化转到e.coli dh5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pttb-vf和pttb-vr)，筛选突变成功的ptarget-yded质粒。
[0080]
(2)以e.coli w3110基因组为模板，通过pcr扩增基因yded启动子上下游500bp序列，以及启动子p
yhao
，得到dna片段，donor-yded-up(引物up-f和up-r)，donor-yded-down(引物down-f和down-r)和donor-p
yhao
(yded)(引物p
yhao-f和p
yhao-r)。通过融合pcr将上述三个dna片段融合，得到dna片段donor-yded。
[0081]
(3)将菌株e.coliw3110eyc(cctcc no：m 20191026，已在cn111019877a中公开)制备成化转感受态，将pcas质粒(addgene plasmid#62225)通过化学转化法转化到e.coliw3110eyc化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株e.coliw3110eyc/pcas。
[0082]
(4)将菌株e.coliw3110eyc/pcas制备成电转感受态。将质粒ptarget-yded，片段donor-yded电转到w3110eyc/pcas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行pcr验证(引物ydedjyz-vf和ydedjyz-vr)，筛选编辑成功菌株，得到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded。引物如表3所示。
[0083]
表3：引物序列
[0084]
[0085][0086]
(二)工程菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik/pe(ecy::dk)的构建：
[0087]
(1)以ptarget质粒(addgene plasmid#62226)为模版，通过pcr扩增，对grna进行定点突变(引物pttb-f和pttb-r)。用dpni对pcr产物进行消化。将消化产物化转到e.coli dh5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pttb-vf和pttb-vr)，筛选突变成功的ptarget-yfik质粒。
[0088]
(2)以e.coli w3110基因组为模板，通过pcr扩增基因yfik启动子上下游500bp序列，以及启动子p
yhao
，得到dna片段，donor-yfik-up(引物up-f和up-r)，donor-yfik-down(引物down-f和down-r)和donor-p
yhao
(yfik)(引物-p
yhao-f和p
yhao-r)。通过融合pcr将上述三个dna片段融合，得到dna片段donor-yfik。
[0089]
(3)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded制备成化转感受态，将pcas质粒(addgene plasmid#62225)通过化学转化法转化到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded/pcas。
[0090]
(4)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded/pcas制备成电转感受态。将质粒ptarget-yfik，片段donor-yfik电转到w3110 eyc::p
yhao-yded/pcas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行pcr验证(引物yfikjyz-vf和yfikjyz-vr)，筛选编辑成功菌株，得到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik。引物如表4所示。
[0091]
表4：引物序列
[0092][0093][0094]
(三)工程菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas/pe(eyc::dks)的构建：
[0095]
(1)以ptarget质粒(addgene plasmid#62226)为模版，通过pcr扩增，对grna进行定点突变(引物pttb-f和pttb-r)。用dpni对pcr产物进行消化。将消化产物化转到e.coli dh5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pttb-vf和pttb-vr)，筛选突变成功的ptarget-yeas质粒。
[0096]
(2)以e.coli w3110基因组为模板，通过pcr扩增基因yeas启动子上下游500bp序列，以及启动子p
yhao
，得到dna片段，donor-yeas-up(引物up-f和up-r)，donor-yeas-down(引物down-f和down-r)和donor-p
yhao
(yeas)(引物p
yhao-f和p
yhao-r)。通过融合pcr将上述三个dna片段融合，得到dna片段donor-yeas。
[0097]
(3)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik制备成化转感受态，将pcas质粒(addgene plasmid#62225)通过化学转化法转化到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik/pcas。
[0098]
(4)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik/pcas制备成电转感受态。将质粒ptarget-yeas，片段donor-yeas电转到w3110 eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik/pcas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行pcr验证(引物yeasjyz-vf和yeasjyz-vr)，筛选编辑成功菌株，得到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas。引物如表5所示。
[0099]
表5：引物序列
[0100][0101][0102]
(四)工程菌e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae的构建：
[0103]
(1)以ptarget质粒(addgene plasmid#62226)为模版，通过pcr扩增，对grna进行定点突变(引物pttb-f和pttb-r)。用dpni对pcr产物进行消化。将消化产物化转到e.coli dh5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pttb-vf和pttb-vr)，筛选突
变成功的ptarget-alae质粒。
[0104]
(2)以e.coli w3110基因组为模板，通过pcr扩增基因alae启动子上下游500bp序列，以及启动子p
yhao
，得到dna片段，donor-alae-up(引物up-f和up-r)，donor-alae-down(引物down-f和down-r)和donor-p
yhao
(alae)(引物p
yhao-f和p
yhao-r)。通过融合pcr将上述三个dna片段融合，得到dna片段donor-alae。
[0105]
(3)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas制备成化转感受态，将pcas质粒(addgene plasmid#62225)通过化学转化法转化到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas/pcas。
[0106]
(4)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas/pcas制备成电转感受态。将质粒ptarget-alae，片段donor-alae电转到w3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas/pcas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行pcr验证(引物alaejyz-vf和alaejyz-vr)，筛选编辑成功菌株，得到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae。引物如表6所示。
[0107]
表6：引物序列
[0108]
引物名称序列(5
’‑3’
)pttb-ftaatactagtgtacaaaaaacgagccgttagttttagagctagaaatagcpttb-rgctctaaaactaacggctcgttttttgtacactagtattatacctaggacup-fatgttatttaaactttgtaacattacggacup-rgcggcgtttactgctttcatatgatttatttttaattaaatcaattagatatggp
yhao-fatgaaagcagtaaacgccgcgp
yhao-rggtctgtttcctgtgtgaaatccagcacgacccgccggdown-ftcgtgctggatttcacacaggaaacagaccatgttctcaccgcagtcacgcdown-rgcgaagccagttaaagacgcpttb-vfgtcagtgagcgaggaagcggpttb-vrtagcacgatcaacggcactgalaejyz-vftcatcagctccagccaggtgalaejyz-vraatggccagtcctccgcgtgatg
[0109]
(五)工程菌e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae::p
yhao-apfab689-tolc的构建
[0110]
(1)以e.coli w3110基因组为模板，通过pcr扩增得到dna片段，基因tolc启动子上下游500bp序列(引物up-f和up-r，引物down-f(689)和down-r)，启动子p
yhao
(引物p
yhao-f和p
yhao-r)以及rbs apfab689(引物rbs689-r和rbs-f)。通过融合pcr将上述四个dna片段融合，得到dna片段donor-apfab689-tolc。
[0111]
(2)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae制备成化转感受态，将pcas质粒(addgene plasmid#62225)通过化学转化法转化到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae/pcas。
[0112]
(3)将菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae/pcas制备成电转感受态。将片段donor-apfab689-tolc电转到w3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae/pcas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行pcr验证(引物tolcjyz-vf和tolcjyz-vr)，筛选编辑成功菌株，得到e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae::p
yhao-apfab689-tolc。引物如表7所示。
[0113]
表7：引物序列
[0114]
引物名称序列(5
’‑3’
)pttb-ftaatactagtcacgtaacgccaaccttttggttttagagctagaaatagcpttb-rgctctaaaaccaaaaggttggcgttacgtgactagtattatacctaggacup-ftgccaggaaacttaacaccggup-rttactgctttccatagggcgttaatgtgcctcp
yhao-fcgccctatggaaagcagtaaacgccgcgp
yhao-rttaagtgaacttgggccctccagcacgacccgccggrbs-fgagggcccaagttcacttaaaaagrbs689-rtcattagaaacactcccccgcdown-f(689)cgggggagtgtttctaatgatgaagaaattgctccccattcdown-rttaaaacgttgggtggtttgatcpttb-vfgtcagtgagcgaggaagcggpttb-vrtagcacgatcaacggcactgtolcjyz-vfatgaacgcgaatatcttcgtolcjyz-vraatggccagtcctccgcgtgatg
[0115]
(4)挑取阳性单菌落接种到含1mm iptg和0.05mg/l卡那霉素的lb试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/l壮观霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l壮观霉素的lb平板的单菌落，其ptarget-tolc质粒成功消除。挑取ptarget-tolc质粒成功消除的单菌落于lb试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于lb平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l卡那霉素的lb平板的单菌落，其pcas质粒成功消除，最终得到无质粒e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae::p
yhao-apfab689-tolc。
[0116]
(5)将以上无抗菌株制备成化转感受态，将发酵质粒pe转化到上述菌株的化转感受态中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，得到含发酵质粒菌株e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yhao-alae::p
yhao-apfab689-tolc/pe(即eyc::dksac-1)。
[0117]
实施例7：发酵菌株的构建及发酵验证
[0118]
(1)发酵菌株的构建：以质粒ptrc99a-pe(pe)为模板，使用引物peb-lj-f和peb-lj-r对其进行线性化开环处理。pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1-3h消化处理，消化结束后，对产物进行纯化、测核酸浓度，最终得到pe线性化载体片段。以cysb
q128l
片段为模板，使用引物cysb
q128l-f和cysb
q128l-r对其进行pcr，pcr产物经核酸电泳验证后，对产物进行纯化、测核酸浓度，最终得到能够与pe线性化载体相连接的片段。
[0119]
(2)质粒ptrc99a-peb
q128l
(peb
q128l
)构建：以pe线性化载体和扩增的cysb
q128l
片段为模板，参照一步克隆试剂盒(clonexpress ultra one step cloning kit)说明书添加反应体系，于50℃温度下放置15-20min后，取出立即放置于冰上降温，即可将cysb
q128l
基因片段整合到pe质粒多克隆位点上，之后将其连接产物转化至dh5α化转感受态，菌落pcr验证成功后，通过挑菌接试管，即可得到peb
q128l
重组质粒(参见seq id no.11)
[0120]
得到线性化载体片段后，将其转化至底盘菌eyc::dksac-1(e.coliw3110eyc::p
yhao-yded::p
yhao-yfik::p
yhao-yeas::p
yha
o-alae::p
yhao-apfab689-tolc/pe)中，即得到eyc::dksac-b1/peb
q128l
菌株。
[0121]
(3)菌株eyc::dksac-b1/peb
q128l
的摇瓶验证：以eyc::dksac-1/peb为对照菌株，eyc::dksac-b1/peb
q128l
为实验菌株，将其分别接种到10ml的lb培养基中，于37℃、150-200rpm恒温摇床中培养15-17h后，以接种量为1％转接至装有50ml的发酵培养基的500ml摇瓶中，于25-30℃、150-200rpm恒温摇床中培养4-6h时，当od＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mm iptg后继续培养48h，即得发酵样品。
[0122]
取1ml发酵液于室温10000-12000rpm离心1-4min后，将上清与沉淀分离，对发酵液根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的l-半胱氨酸含量如图9所示。
[0123]
如图9所示，通过对cysb进行突变，构建重组质粒peb
q128l
，对比于eyc::dksac-1菌株，l-半胱氨酸效价提升了0.066g/l。
[0124]
(4)菌株eyc::dksac-b1/peb
q128l
的发酵罐验证：以eyc::dksac-1/peb为对照菌株，eyc::dksac-b1/peb
q128l
为实验菌株，将其分别接种到10ml的lb培养基中，于37℃、150-200rpm恒温摇床中培养15-17h后，以接种量为1％转接至装有100ml的发酵培养基的500ml摇瓶中，于25-30℃、150-200rpm恒温摇床中培养12h，即得种子液。5l发酵罐经空消、实消后，接入ph电极、溶氧电极、碱瓶、补料瓶、外加氨基酸溶液后，调节ph至7.0-7.5后接入种子液，将溶氧电极调节至100％。随后将转速与溶氧联控、稳定ph至7.0-7.5，培养12-14h后发酵罐开始补料时向其中添加终浓度为0.1m iptg，并将补料与ph联控，ph控制在7.0-7.5之间。每隔4-6h进行取样，从中取1ml发酵液测定od
600
的同时，取1ml发酵液于室温10000-12000rpm离心1-4min后，将上清与沉淀分离，对发酵液根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的l-半胱氨酸含量如图10所示。
[0125]
由图10可见，通过对cysb进行突变，构建重组质粒peb
q128l
，对比于eyc::dksac-1菌株，胱氨酸析出时间提早了4-6h，效价提升了0.26g/l，与对照菌株相比，单位时间内生长效率提高32.7％。
[0126]
摇瓶培养基：葡萄糖40g/l；(nh4)2so
4 15g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，kh2po
4 2g/l，na2hpo
4 2g/l，na2s2o
3 10g/l，微量元素溶液1ml/l，溶剂为去离子水，ph值自然。另外单独称取0.01g/ml caco3，分装到摇瓶中调节ph。
[0127]
微量元素溶液组成为：mnso4·
8h2o 5g/l，mgso4·
7h2o 500g/l，feso4·
7h2o10g/l，znso
4 5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0128]
发酵罐培养基：glucose 30g/l，(nh4)2so
4 10g/l，na2s2o310g/l，kh2po
4 3g/l；na2hpo
4 3g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉6g/l，无水甜菜碱2g/l，外加盐离子溶液1ml/l，铁离子溶液1ml/l，铁标准溶液500μl/l，消泡剂1ml/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0129]
补料培养基：glucose 300g/l，(nh4)2so415g/l，na2s2o
3 12.5g/l，kh2po
4 1g/l，
na2hpo
4 1g/l，微量元素溶液1ml/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0130]
碱瓶：配制氨水:去离子水体积比为1:1，ph值自然。
[0131]
氨基酸溶液：l-半胱氨酸1g/l，l-苏氨酸1g/l，l-异亮氨酸1g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0132]
溶液：mnso4·
8h2o 5g/l，mgso4·
7h2o 500g/l，feso4·
7h2o 5g/l，znso45g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0133]
铁离子溶液：feso4·
7h2o 2.5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

技术特征：
1.一种cysb突变体，其核苷酸序列如seq id no.10所示。2.权利要求1所述cysb突变体在构建高产l-半胱氨酸的基因工程菌中的应用。3.一种基于cysb突变体构建的高产l-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建：对调节转录因子cysb的硫酸盐结合口袋进行突变，获得核苷酸序列如seq idno.10所示的突变体cysb
q128l
，使其在底盘菌eyc::dksac-1/pe中过表达，得到eyc::dksac-b1/peb
q128l
，即所述高产l-半胱氨酸的基因工程菌。4.权利要求2所述基因工程菌在微生物发酵制备l-半胱氨酸中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有amp抗性的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养至od600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mm的iptg，之后转至30℃，150-180rpm下继续培养48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到l-半胱氨酸。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖30～50g/l，(nh4)2so
4 5～20g/l，酵母提取物5～10g/l，蛋白胨0.5～2.0g/l，kh2po
4 0.5～2.0g/l，na2hpo
4 0.5～2.0g/l，na2s2o
3 5～10g/l，微量元素溶液0.5～2.0ml/l，溶剂为去离子水，ph自然。另外单独称取caco30.01g/ml，分装到摇瓶中调节ph。

技术总结
本发明涉及一种cysB突变体，以及基于cysB突变体构建的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，以及该基因工程菌株在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。本发明在对CysB的硫酸盐结合口袋进行随机突变的同时，通过构建的荧光报告系统进行高通量筛选，筛选出对硫源结合能力更优的CysB突变体，并基于突变体构建了一种能够对cysB表达强度一株性能更优的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，相对于出发菌株，基因工程菌单位时间内生长效率提高了32.7％，最终使L-半胱氨酸的效价提高了3.3％。氨酸的效价提高了3.3％。氨酸的效价提高了3.3％。


技术研发人员：柳志强 李世蓉 张博 潘佳园 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/7/20