第1187位点发生突变的人类CMT致病基因SARS1及其应用

第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1及其应用
技术领域
1.本公开涉及基因的技术领域，尤其涉及第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1及其应用。


背景技术：

2.腓骨肌萎缩症(charcot-marie-tooth，cmt)是一组最常见的周围神经单基因遗传病，发病率约为1/2500。该类疾病的具有高度临床异质性和遗传异质性，其典型的临床特点主要表现为青少年期起病，缓慢进展的四肢远端进行性的肌无力和萎缩伴感觉障碍。
3.cmt通常于儿童期或青少年期发病，临床特点表现为进行性、对称性肢体远端肌无力和肌萎缩，足部、小腿肌肉和大腿下1/3以下肌肉无力和萎缩，形成“鹤腿”或倒置的酒瓶样畸形，常出现足内翻畸形和杵状趾，行走和跑步困难，跨阈步态，；手部骨间肌和大、小鱼际肌萎缩，呈现爪形或猿手畸形，肌萎缩一般不超过肘关节以上，手的精细动作不能；四肢呈手套-袜子型分布，区域内痛觉、温觉和振动觉减退，腱反射减弱或消失，踝反射通常消失，可伴自主神经功能障碍和营养障碍体征，常伴高弓足、脊柱侧弯等骨骼畸形。尽管cmt主要累及周围感觉和运动神经，较少一部分以轴索受累为主的患者同时会出现锥体束征的表现，包括轻度肌张力升高、下肢腱反射保留/活跃/亢进，以及病理征阳性，提示存在中枢神经系统的受累。此外，cmt中还可能出现许多其他症状，例如颅神经受累，声带麻痹，瞳孔异常，青光眼，视神经萎缩，听力下降，智能下降等非运动症状。这些特异性的伴随症状，通常可为分子诊断提供重要线索。临床异质性的严重程度也有很大差异，范围从轻度症状形式到导致严重残疾的形式。多数患者疾病进展缓慢，出现轻至中度功能损害，但不影响预期寿命。
4.根据电生理和病理特征，主要分为脱髓鞘型、轴索型以及中间型，其中最常见的cmt亚型为脱髓鞘型，其主要特点为正中神经运动传导速度(mncv)小于25m/s，病理典型改变为有髓神经纤维存在洋葱球样结构。轴索型的特点为mncv大于45m/s，病理典型改变为大量有髓纤维密度减低。中间型的特点为mncv为25～45m/s，病理改变兼具有两型的特点。随着cmt致病基因的日趋细化，目前倾向于将电生理、基因和遗传方式结合进行精确分型。这种方法可以便于患者在病史、电生理分型之后，快速进行个体化基因筛查。
5.近年来关于cmt的分子机制研究越来越深入，它的发生与特定基因变异有着密切关系，现已发现的致病基因高达100多种。此外，其遗传形式也多种多样，有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、x染色体连锁显性遗传和x染色体连锁隐性遗传，当中以常染色体显性(autosomal dominant，ad)遗传最多见，见于大部分cmt1和cmt2家系患者。通过分子遗传学方面的研究证实致病基因在维持周围神经轴索、髓鞘的结构完整性和功能完整性、蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体功能等方面发挥着重要作用。在已经确定在cmt中起作用的途径中，有转录调控，蛋白质更新，雪旺细胞轴突相互作用，轴突运输以及线粒体融合和裂变。
6.sars1是氨酰trna合成酶(aminoacyl-trna synthases，arss)的一种，由trna结合
功能域、氨酰化功能域和une-s三个功能域组成，其主要作用是将丝氨酸结合到其对应的trna上，参与机体蛋白合成。在对cmt机制研究发现，arss家族在其中起了重要作用。迄今为止，至少6种arss杂合突变导致cmt，并且大多数突变位于arss的氨酰化功能域。
7.目前，cmt致病基因sars1突变尚未见报道，本技术结合功能实验，可以为该病的解析、筛查、检测和治疗提供潜在的重要价值。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明的目的在于提供cmt新致病基因的1种基因突变形式的检测试剂在制备cmt诊断试剂盒中的用途，同时提供基于sanger测序的检测方法，并通过功能学实验验证其致病性。这些可以为未确诊的cmt患者基因筛查、发病机制的解析、药物开发及治疗方案的制定提供依据和奠定基础。
9.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
10.第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的检测试剂在制备cmt诊断试剂盒中的用途，所述第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第1187位点位于exon 9中，具体是野生型基因第11 87位的c突变为t。
11.作为实施例的优选方式，所述cmt诊断试剂盒至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq idno.3所示。
12.作为实施例的优选方式，所述cmt诊断试剂盒至少包括一扩增体系，扩增体系包括：kod one mix 12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。
13.作为实施例的优选方式，所述扩增体系进行扩增时，扩增条件为：预变性98℃ 1min；变性98℃ 5s，退火延伸68℃ 30s，30个循环。
14.作为实施例的优选方式，所述用途包括对cmt致病机理的解析及其药物开发。
15.sars1作为检测靶标在制备cmt诊断试剂盒中的应用，所述sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，其突变为第1187位的c突变为t。
16.一种cmt诊断试剂盒，包括能够检测如seq id no.1所示的sars1的第1187位的c突变为t的试剂。
17.作为实施例的优选方式，所述试剂包括pcr检测sars1是否突变的试剂。
18.作为实施例的优选方式，所述pcr所用的引物至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq id no.3所示。
19.作为实施例的优选方式，所述pcr的扩增体系包括：kod one mix12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。
附图说明
20.附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
21.图1为根据一些实施例的sars1基因c.1187c＞t突变形式的sanger测序验证局部
图谱。
22.图2为根据一些实施例的cmt患者的腓骨肌萎缩影像。
23.图3为根据一些实施例的cmt患者所在家系的遗传图谱。其中，正方形表示男性，圆形表示女性；箭头表示先证者，实心表示cmt患病个体，空心表示正常个体；i、ii、iii分别代表第1、2和3代，数字为成员编号
24.图4为根据一些实施例的是该家系的连锁分析结果。其中，共享的区间内携带有sars1基因c.1187c＞t突变。
25.图5为根据一些实施例的氨酰化功能试验结果。
26.图6为根据一些实施例的总蛋白合成速率结果。
27.图7为根据一些实施例的isr通路激活结果。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
29.需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
30.本公开提供了第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的检测试剂在制备cmt诊断试剂盒中的用途，所述第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第1187位点位于exon 9中，具体是野生型基因第1187位的c突变为t。
31.作为实施例的优选方式，所述cmt诊断试剂盒至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq id no.3所示。
32.作为实施例的优选方式，所述cmt诊断试剂盒至少包括一扩增体系，扩增体系包括：kod one mix 12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。
33.作为实施例的优选方式，所述扩增体系进行扩增时，扩增条件为：预变性98℃ 1min；变性98℃ 5s，退火延伸68℃ 30s，30个循环。
34.作为实施例的优选方式，所述用途包括对cmt致病机理的解析及其药物开发。
35.sars1作为检测靶标在制备cmt诊断试剂盒中的应用，所述sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，其突变为第1187位的c突变为t。
36.一种cmt诊断试剂盒，包括能够检测如seq id no.1所示的sars1的第1187位的c突变为t的试剂。
37.作为实施例的优选方式，所述试剂包括pcr检测sars1是否突变的试剂。
38.作为实施例的优选方式，所述pcr所用的引物至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq id no.3所示。
39.作为实施例的优选方式，所述pcr的扩增体系包括：kod one mix 12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。
40.本发明提供的基于二代测序的sars1基因检测方法包括如下主要步骤：
41.(1)二代测序pcr捕获扩增，解析基因突变谱
42.使用测序芯片进行捕获测序，通过生物信息分析找出突变位点。
43.(2)突变位点的验证
44.将分析得到的突变位点进行引物设计后，扩增突变片段后直接进行sanger测序，再通过sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况；
45.步骤(2)的扩增体系：
46.成分添加量(μl)kod one mix12.5nuclease-free water10上游引物primer f1下游引物primer r1浓度＞20μg/μl的样本基因组dna0.5
47.步骤(2)的扩增阶段和条件：
[0048][0049]
(3)连锁分析
[0050]
利用二代测序提取出患者家系的单核苷酸多态位点snps，利用生物信息学软件plink和merlin进行连锁分析，获得该家系成员共享的连锁区间。
[0051]
(4)功能验证实验
[0052]
对患者进行皮肤活检，并培养出皮肤成纤维细胞，并实施以下实验：
[0053]
i.氨酰功能检测：通过提取患者及正常对照的皮肤成纤维细胞总蛋白，在37℃温度下在反应液中持续30分钟，反应产生的焦磷酸盐被偶联酶焦磷酸酶水解，用比色法测定游离磷酸盐。
[0054]
ii.总蛋白合成速率检测：在皮肤成纤维细胞中加入5μg/ml的嘌呤霉素，于细胞培养箱中培养30分钟后，提取细胞总蛋白，进行sds-page电泳，转膜后用anti-puromycin进行孵育，随后检测灰度值。
[0055]
iii.isr通路激活检测：提取患者及正常对照的皮肤成纤维细胞总蛋白，进行bca蛋白定量后，进行sds-page电泳，用p-eif2α抗体检测蛋白表达情况，内参用vinculin。
[0056]
其中，(1)中所述的pcr捕获扩增进行的二代测序和生物信息分析，有二代测序仪和配套分析软件则按照规范操作分析进行，或可由商业化的高通量测序公司完成，最终需得到检测样本关于sars1基因突变信息。
[0057]
其中，(2)中所述是指利用特定引物扩增突变片段并进行sanger测序，验证是否同二代测序检出的突变结果一致；由sanger测序仪按规范操作进行测序或可送商业化测序公司完成，最终需得到对应的扩增子序列。所述原样本突变片段扩增是指对sars1基因的
c.1187c＞t，扩增引物对为seq id no.2和seq id no.3。
[0058]
其中，(2)中所述的患者家系相关成员必须包括cmt和非cmt患者，所述基因型-表型共分离是指基因型决定表型，由此二者符合共同对应的遗传学传递现象和规律。
[0059]
其中，(3)中通过二代测序提取的多核苷酸多态位点的质量需满足定位质量(mapping quality，mq)的平方根应大于40，组合深度(combined depth，dp)应大于10，基因型质量(genotype quality，gq)应大于80，最大缺失值(max missing)为0.8。
[0060]
其中，(4)i中的反应液体积为50μl，包括100mm tris-hcl(ph7.6)，10mm氯化镁，40mm kcl2，1mm二硫苏糖醇，40u/ml酵母trna(invitgen，am7119)，1mm atp，0.2mm色氨酸，和5u/ml酵母无机焦磷酸酶。相应试剂可由商业公司获得。
[0061]
其中，(4)ii、iii中蛋白提取的试剂、蛋白定量的bca试剂及相应抗体可由商业公司购买。
[0062]
本发明提供的关于cmt新致病基因sars1一种新的突变类型，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制订等提供依据和奠定基础；此外本发明提供的基于二代测序的检测方法，覆盖了该基因的全部外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。
[0063]
实施例：
[0064]
(1)患者信息采集
[0065]
根据详细的病史和家族史调查情况以及规范的神经系统体格检查和相关辅助检查信息，选择所在医院cmt患者在其签署了知情同意书的情况下，进行致病基因检测。
[0066]
其中，医院cmt患者的腓骨肌萎缩影像如图2所示，可见携带sars1基因c.1187c＞t突变的患者具有肢体远端肌肉萎缩，具体表现为双侧腓骨肌萎缩及双手大、小鱼际肌萎缩；cmt患者所在家系的遗传图谱如图3所示，可见该家系三代人共6人为cmt患者。
[0067]
(2)二代测序连锁分析及验证
[0068]
取患者肘静脉血10ml(edta抗凝)，用qiaamp dna mini kit(德国qiagen公司)提取基因组dna。将基因组dna送上海晶能生物技术有限公司进行测序反应，获取原始数据并进行生物信息分析获取突变信息。并对其余家系成员进行相同突变片段的sanger验证，测序结果如图1所示，可见患者在sars1基因c.1187处存在c＞t杂合突变。按规范流程提取原始数据并进一步组装，根据相关参数设定plink和merlin并分析，连锁分析结果如图4所示，可见该家系在1号染色体存在连锁共享区间，具体范围为chr1：102271774-112539061；且该连锁区间的lod值为1.8。
[0069]
(3)功能验证实验
[0070]
根据前述的氨酰功能检测、总蛋白合成速率检测及isr通路激活检测方法，对该家族cmt患者进行功能验证实验。氨酰功能检测结果如图5所示，与正常人的皮肤成纤维细胞相比，可见携带sars1基因c.1187c＞t突变患者来源的皮肤成纤维细胞氨酰功能降低。总蛋白合成速率检测结果如图6所示，与正常人的皮肤成纤维细胞相比，可见携带sars1基因c.1187c＞t突变患者来源的皮肤成纤维细胞总蛋白合成速率降低。isr通路激活检测结果如图7所示，与正常人的皮肤成纤维细胞相比，可见携带sars1基因c.1187c＞t突变患者来源的皮肤成纤维细胞isr通路明显激活。
[0071]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示
例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
[0072]
此外，在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。“和/或”仅仅是描述关联对象的关联关系，表示三种关系，例如，a和/或b，表示为：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开中的具体含义。
[0073]
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

技术特征：
1.第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的检测试剂在制备cmt诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述第1187位点发生突变的人类cmt致病基因sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第1187位点位于exon9中，具体是野生型基因第1187位的c突变为t。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述cmt诊断试剂盒至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq id no.3所示。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述cmt诊断试剂盒至少包括一扩增体系，扩增体系包括：kod one mix 12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增体系进行扩增时，扩增条件为：预变性98℃1min；变性98℃5s，退火延伸68℃30s，30个循环。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括对cmt致病机理的解析及其药物开发。6.sars1作为检测靶标在制备cmt诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述sars1的核苷酸序列如seq id no.1所示，其突变为第1187位的c突变为t。7.一种cmt诊断试剂盒，其特征在于：包括能够检测如seq id no.1所示的sars1的第1187位的c突变为t的试剂。8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂包括pcr检测sars1是否突变的试剂。9.如权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述pcr所用的引物至少包括一对引物序列，上游引物碱基序列如seq id no.2所示，下游引物碱基序列如seq id no.3所示。10.如权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述pcr的扩增体系包括：kod one mix 12.5μl，nuclease-free water 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，浓度＞20μg/μl的样本基因组dna 0.5μl。

技术总结
本发明提供了第1187位点发生突变的人类CMT致病基因SARS1的检测试剂在制备CMT诊断试剂盒中的用途，所述第1187位点发生突变的人类CMT致病基因SARS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第1187位点位于Exon 9中，具体是野生型基因第1187位的C突变为T。本发明可以为未确诊的CMT患者基因筛查、发病机制的解析、药物开发及治疗方案的制定提供依据和奠定基础。开发及治疗方案的制定提供依据和奠定基础。开发及治疗方案的制定提供依据和奠定基础。


技术研发人员：何瑾 陈万金 王柠
受保护的技术使用者：福建医科大学附属第一医院
技术研发日：2022.09.10
技术公布日：2023/7/20