一种以抑制TRIM54泛素化降解STAT2为靶点的抗病毒ADE药物筛选方法

一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法。


背景技术：

2.抗体依赖的增强效应(antibody-dependent enhancement，ade)是指由于接种疫苗或感染病毒后产生的中和能力弱或不具备中和能力的抗体与病毒颗粒形成复合物后不仅不阻断反而促进了病毒感染细胞并通过破坏干扰素信号通路致使病毒复制增加的现象。1973年halstead等科学家首先描述了在登革热感染中的ade现象，后来发现ade现象在许多黄病毒属的病毒感染中广泛存在，例如，乙型脑炎病毒、寨卡病毒和登革病毒均有引发ade的可能。在sars-cov-2的防治过程中ade效应也是需要面对的重要挑战。目前尚没有用于治疗ade的特效药上市，ade已成为病毒感染防治中的一大干扰。因此，对ade的机制进行探索以发现抑制ade的靶点对于病毒感染疾病的防治具有重要的意义。
3.信号转导与转录激活蛋白(signal transducers and activators of transcription,stat)是一种能与dna结合的蛋白质独特家族，stat家族包括7个结构和功能相关的蛋白stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b及stat6，通常对各种细胞外的细胞因子和生长因子信号做出应答，是一类含有能与磷酸化酪氨酸结合的sh2信号分子。stat是核内转录因子，但在静息细胞中，stat存在于胞质中。其中，stat2分子被激活后转入细胞核与特异性dna结合，影响基因转录，参与细胞的生长、分化、生存和凋亡。目前多项研究表明，stat2基因缺失或过表达对肿瘤发生发展有着重要影响，与肿瘤血管生成、肿瘤增殖及肿瘤凋亡密切相关。
4.三方基序蛋白(tripartite motif，trim)家族的名称是由于其具有3个保守的结构域而得来。这三个结构域从n端到c端的顺序依次是ring结构域(ring domain)、1个或2个b-box结构域、一个卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)，此外该家族还具有一个可变的c-末端。目前人类基因组已发现和鉴定近70个trim蛋白成员，并且其家族成员的功能越来越受到重视。研究表明trim家族的成员参与了细胞分化、增殖、发育、凋亡等许多重要的生物学过程。大多数trim具有e3泛素连接酶活性，且与多种生理过程有关，包括细胞增殖、dna修复、信号转导和转录，近年来大量研究发现trim与癌症的发生发展相关。
5.但目前未有关于将stat2与trim54的互作作为阻断ade效应靶标的相关报道。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法，通过将trim54和stat2分别与第一荧光蛋白(fp1)和第二荧光蛋白(fp2)融合表达形成了fp1-trim54和fp2-stat2，转染细胞后通过流式细胞仪或酶标仪检测荧光共振转移(fret)的强度评价trim54和stat2的互作情况，筛选出特异性抑制ade的
化合物
7.本发明的第一个目的是提供一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法，包括以下步骤：
8.s1、分别构建第一质粒和第二质粒，将第一质粒和第二质粒导入细胞中，检测fret信号；所述第一质粒和第二质粒上分别含有编码trim54的基因和编码stat2的基因，第一质粒和第二质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因，且所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白能够发生荧光共振能量转移；
9.s2、将待测化合物与步骤s1所述细胞共孵育，根据fret信号的变化筛选出抑制病毒ade效应的药物。
10.进一步地，所述编码trim54的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.进一步地，所述编码stat2的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.进一步地，筛选fret信号降低的待测化合物作为备选抗病毒ade效应药物。
13.进一步地，在本发明的一个实施例中，所述第一荧光蛋白为青色荧光蛋白cfp，第二荧光蛋白为黄色荧光蛋白yfp。
14.进一步地，进行药物筛选时，以导入第三质粒的细胞为阳性对照，其中，第三质粒上含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。
15.进一步地，进行药物筛选时，以导入第四质粒和第五质粒的细胞为阴性对照，其中，第四质粒和第五质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。
16.进一步地，通过流式细胞法或荧光酶标法检测fret信号。
17.进一步地，在本发明的一个实施例中，所述细胞为293t细胞。
18.本发明提供了一种抑制病毒ade效应的新靶点，所述靶点为trim54和stat2：
19.人单核-巨噬细胞主要表达三类活化型fcγrs：fcγria、fcγriia和fcγriiia。虽然有证据表明fcγriiia能够参与介导登革病毒ade，更多的证据支持fcγriia而非fcγria和fcγriiia是ade的关键受体。例如，分别在越南、古巴、巴基斯坦和墨西哥四国完成的研究表明，fcγriia多态性与登革病毒感染预后密切相关。近期来自多个实验室的证据进一步表明，fcγriia参与介导登革、寨卡及埃博拉病毒的ade。抗体的存在形式可能影响ade效应，比如抗体的岩藻糖修饰影响其与fcr的亲和力，二聚体形式的抗体较单体更容易诱导ade效应等。另外，fcγriia胞桨区的itam基序是介导病毒ade效应的关键结构域，而fcγriib中的itim基序则发挥保护作用。
20.申请人在研究中发现，免疫复合物通过膜表面fcγriia作用于人单核细胞会增强其对病毒的易感性，在此过程中trim54表达量显著升高，并且其可通过降解stat2抑制ifn-i信号通路，导致单核巨噬细胞对病毒易感性升高。干扰trim54表达可以显著地逆转ade效应，因此认为trim54和stat2的互作可能是免疫复合物诱导单核细胞对病毒敏感性的增强的一个环节，提示其可作为阻断ade效应的靶标。由于trim54非组成性表达，仅表达于免疫复合物作用的单核巨噬细胞，特异性干预trim54与stat2的互作不会带来细胞对ifn-i相关信号通路的广泛影响，具有较高的特异性。因此，筛选出靶向trim54/stat2互作并且抑制ade效应的小分子化合物，对有ade效应的病毒防治有重要的生物学意义。
21.本发明的第二个目的是提供一种抑制trim54和stat2相互作用的物质在制备抗病
毒ade效应药物中的应用。
22.本发明的第三个目的是提供一种表征trim54和stat2相互作用的物质在抗病毒ade效应药物筛选中的应用。
23.本发明的第四个目的是提供baricitinib或rivaroxaban在制备抑制病毒ade效应药物中的应用。
24.进一步地，所述baricitinib或rivaroxaban用于阻断trim54和stat2相互作用。
25.本发明的第五个目的是提供一种抗病毒ade效应的药物，所述药物中包括baricitinib或rivaroxaban。
26.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
27.本发明公开了一种抑制病毒ade效应的新靶点，并提供了抑制e3泛素连接酶trim54泛素化降解底物stat2为靶点的治疗ade的应用。本发明通过将研究对象trim54和stat2分别与第一荧光蛋白(fp1)和第二荧光蛋白(fp2)融合表达形成了fp1-trim54和fp2-stat2，转染细胞后通过流式细胞仪或酶标仪检测荧光共振转移(fret)的强度评价trim54和stat2的互作情况。通过这一平台大规模筛选获得特异性抑制trim54/stat2互作的小分子化合物。并进一步利用分子生物学验证小分子对trim54/stat2互作的抑制效应，最后验证化合物对ade效应的抑制作用，最终筛选出了一系列靶向trim54/stat2互作并且抑制ade效应的小分子化合物，对有ade效应的病毒防治有重要的生物学意义。
28.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
29.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
30.图1为真核质粒的构建；其中，a为载体pcmv-n-cfp示意图；b为trim54基因的扩增产物(左)，质粒pcmv-n-cfp-trim54经ecori和xhoi酶切结果；c为yfp基因的扩增产物(左),质粒pcmv-n-cfp-yfp经ecori和xhoi酶切结果；d为载体pcmv-c-yfp示意图；e为stat2基因的扩增产物(左)，质粒pcmv-c-yfp-stat2经bamh i和hind iii酶切结果；
31.图2为cfp-trim54和yfp-stat2在293t细胞内的表达情况；其中，a为免疫印迹分析yfp-stat2和cfp-trim54的表达情况；b为流式细胞仪分析yfp-stat2和cfp-trim54的荧光强度；
32.图3为流式细胞仪对trim54和stat2结合效率的检测分析：cfp和yfp的结合率、cfp-yfp的结合率以及cfp-trim54和yfp-stat2的结合率；
33.图4为酶标仪对荧光共振能量转移强度的检测分析：cfp和yfp的结合率、cfp-yfp的集合率以及cfp-trim54和yfp-stat2的结合率；
34.图5为小分子化合物初筛结果；其中，a为酶标仪分析结果；b为流式细胞仪分析结果；
35.图6为小分子化合物复筛结果；其中，a为酶标仪分析结果；b为流式细胞仪分析结果；
36.图7为化合物对trim54降解stat2的抑制作用结果；将编码flag-trim54的质粒转
染到293t细胞中，9h后实验组加入化合物，对照组加入相同稀释度的dmso(med)，24h后收集细胞，然后进行免疫印迹实验(western blotting)检测细胞裂解液中stat2的蛋白水平；
37.图8为化合物对trim54与stat2互作的抑制作用结果；将编码flag-trim54的质粒转染到293t细胞中，24h后收集细胞并取细胞裂解液与anti-flag affinity gel以及化合物(10μm)在4℃的条件下孵育12h，对照组加入相同稀释度的dmso(med)。然后用免疫印迹实验(western blotting)检测免疫沉淀复合物中stat2的表达水平；
38.图9为化合物对ade的作用分析；其中，a代表分别向k562细胞中加入rpmi、4g2、denv2或ic(denv2+4g2)孵育培养72h后利用流式细胞仪进行检测；b代表分别向用denv2或ic处理的k562细胞中加入化合物(10μm)对照组加入相同稀释度的dmso(med)孵育培养72h后利用流式细胞仪进行检测；c代表向用ic处理的k562细胞中加入化合物(1,3,10,30μm)孵育培养72h后用流式细胞仪进行检测；
39.图10为荧光共振能量转移原理示意图；其中，a为293t细胞中共表达荧光蛋白cfp和yfp；b为293t细胞中表达融合蛋白cfp-yfp；c为293t细胞中共表达cfp-trim54和yfp-stat2。
具体实施方式
40.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
41.本发明的目的是提供一种基于荧光共振能量转移技术为基础的靶向trim54/stat2互作的药物筛选平台。荧光共振能量转移(fret)指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。简言之，当两个荧光蛋白靠近时，其中一个荧光蛋白在激发光的激发下所发出的发射光可以作为另一个荧光蛋白的激发光，激发其发出发射光。荧光共振能量转移原理示意图见图10。在本发明的体系中，选择的是cfp(ex:405nm；em:440/50nm)和yfp(ex:488nm；em:530/30nm)这一组荧光蛋白。在两个荧光蛋白都存在但二者不靠近的情况下，两个荧光蛋白分别只能被各自的激发光激发，发出各自的发射光(图10a)。但是，当两个荧光蛋白受到外力作用足够接近时，我们用cfp的激发光violet(405nm)激发后，不仅可以激发出cfp的发射光vl1(440/50nm)，还可激发出yfp的发射光vl2(620/15nm)。由此本发明构建了cfp与yfp的融合蛋白(cfp-yfp)(图10b)作为检测fret信号的阳性对照。同时还分别构建了编码cfp-trim54以及yfp-stat2的质粒，并通过检测细胞内fret通道的荧光强度，评价trim54与stat2的互作效率(图10c)。
42.实验过程中，将待筛选的化合物加入到共表达cfp-trim54和yfp-stat2的细胞中至终浓度为10μm，并用药物作用24h后分别利用酶标仪和流式细胞仪进行检测，并通过荧光共振能量转移的强度分析药物对trim54和stat2互作的抑制作用。
43.将化合物加入到过表达trim54的293t细胞中，通过免疫印迹试验(western blot，wb)分析该化合物逆转trim54降解stat2的效果。将该化合物加入到含有trim54和stat2的细胞裂解液中，通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-ip)分析该化合物阻断trim54/stat2互作的效果。将denv2和单克隆抗体4g2(denv1 e蛋白的特异性单抗)形成的免疫复合物感染k562细胞以此构建ade模型，并将化合物作用于该ade模型中，通过流式细
胞仪检测k562细胞中的病毒载量，以此分析该化合物对ade的抑制作用。
44.实施例1构建编码cfp-yfp、cfp-trim54和yfp-stat2的质粒
45.首先，我们分别以人单核细胞mrna、pcmv-c-yfp质粒作为模板进行pcr扩增编码trim54(图1b左)和yfp(图1c左)的dna片段。将pcr产物经ecori和xhoi酶切后，插入到表达载体pcmv-n-cfp(图1a)上。获得质粒pcmv-n-cfp-trim54(以下均简化为cfp-trim54)和pcmv-n-cfp-yfp(以下均简化为cfp-yfp)。经酶切鉴定(图1bc右)后进行测序，序列比对无误。其次，我们以人单核细胞mrna作为模板进行pcr扩增编码stat2的dna片段(图1e左)。将pcr产物经bamh i和hind iii酶切后，插入到表达载体pcmv-c-yfp(图1d)上。获得质粒pcmv-c-yfp-stat2(以下均简化为yfp-stat2)。经酶切鉴定(图1e右)后进行测序，序列比对无误。
46.实施例2融合表达蛋白cfp-trim54和yfp-stat2的验证
47.将编码cfp-trim54和yfp-stat2的两质粒分别单独转染到293t细胞里培养48h后进行western blot分析和流式分析。cfp-trim54的理论分子量为67kda，yfp-stat2的理论分子量为121kda，如图2a所示，western blot的结果与理论值相符，表明融合蛋白表达成功。进一步用流式细胞仪检测两融合表达蛋白的荧光蛋白cfp以及yfp的荧光强度。如图2b所示，在vl1通道和bl1通道分别检测到了cfp蛋白的荧光和yfp蛋白的荧光且荧光强度符合后续实验的要求。
48.实施例3流式细胞仪检测细胞内trim54与stat2互作
49.为了用流式细胞仪确定fret信号的强度，我们制备了fret阴性对照以及阳性对照。将质粒pcmv-n-cfp(cfp)和pcmv-c-yfp(yfp)同时转染到293t细胞中作为阴性对照(cfp+yfp)，该对照组cfp通道(ex:405nm；em:440/50nm)以及yfp(ex:488nm；em:530/30nm)通道均能检测到荧光，由于cfp与yfp不能互作，fret通道(ex:405nm；em:512/25nm)应无信号。将质粒pcmv-n-cfp-yfp(cfp-yfp)转染到293t细胞中作为阳性对照，该对照组cfp通道(ex:405nm；em:440/50nm)以及yfp(ex:488nm；em:530/30nm)通道均能检测到荧光，并且由于cfp-yfp中两个荧光蛋白的空间距离足够近，理论上所有表达cfp-yfp的细胞都可产生fret信号。流式细胞仪分析结果如图3所示，去除死细胞、去黏连细胞后，圈cfp以及yfp双阳性细胞，并调整fret信号通道的门，阴性对照组(cfp+yfp)应为0％(图中为0.07％)，阳性对照组(cfp-yfp)应为100％(图中为93.16％)。同时，我们将质粒pcmv-n-cfp-trim54(cfp-trim54)和pcmv-c-yfp-stat2(yfp-stat2)共转染到293t细胞中(cfp-trim54+yfp-stat2)，并用流式细胞仪检测，利用阴性(cfp+yfp)/阳性对照(cfp-yfp)设置的门进行分析。如图3所示，cfp-trim54+yfp-stat2组fret通道阳性细胞比例为42.98％，也就是说trim54与stat2的结合率大约为42.98％，利用这一体系我们可以对trim54以及stat2互作的程度进行量化，便于后续对小分子药物抑制trim54和stat2互作的效率进行量化分析。
50.实施例4荧光酶标仪检测细胞内trim54与stat2互作
51.流式细胞仪检测可以从单个细胞水平评价trim54/stat2的互作，并且可以排除转染效率差异带来的影响，但是作为筛药手段，检测效率较低，因此，我们还探讨了通过荧光酶标仪的检测fret信号的药物筛选方法。
52.我们将质粒pcmv-n-cfp(cfp)、pcmv-c-yfp(yfp)、pcmv-n-cfp和pcmv-c-yfp(cfp+yfp)、pcmv-n-cfp-yfp(cfp-yfp)、pcmv-n-cfp-trim54(cfp-trim54)、pcmv-c-yfp-stat2
(yfp-stat2)、pcmv-n-cfp-trim54和pcmv-c-yfp-stat2(cfp-trim54+yfp-stat2)分别转染到293t细胞中，培养48h后将细胞分别铺到全黑96孔细胞培养板中，每组细胞各三个复孔，每孔各5
×
104个细胞。其中表达cfp、yfp和cfp+yfp的细胞被用作检测计算表达cfp+yfp的细胞中cfp和yfp的结合率；表达cfp、yfp、cfp-yfp的细胞被用作检测计算表达cfp-yfp的细胞中cfp和yfp的结合率；表达cfp-trim54+his-stat2、yfp-stat2+flag-trim54和cfp-trim54+yfp-stat2的细胞被用作检测计算表达cfp-trim54+yfp-stat2的细胞中cfp-trim54和yfp-stat2的结合率。于是我们用酶标仪分别在cfp通道(ex:430nm；em:480nm)，yfp通道(ex:485nm；em:530nm)，fret通道(ex:430nm；em:530nm)扫描读取荧光强度，利用公式计算两种带荧光标签的蛋白互作的效率。公式为：e％＝1-(d
da
/(d
da
+(f
da-(d
da
×
d)-(a
da
×
a))
×
qd/qa))。(d＝fd/dd，a＝fa/aa。dd：donor通道中检测到的表达cfp蛋白的读值；d
da
：donor通道中检测到的同时表达cfp和yfp蛋白的读值；aa：acceptor通道的检测到的表达yfp蛋白的读值；a
da
：acceptor通道中检测到的表达cfp和yfp蛋白的荧光值；fa：fret通道中检测到的表达yfp蛋白的荧光值；fd：fret通道中检测到的表达cfp蛋白的荧光值；f
da
：fret通道中检测到的同时表达cfp和yfp蛋白的荧光值；qd＝0.4和qa＝0.61分别为荧光供体和荧光受体的量子产率)。如图4所示通过酶标仪检测的结果经计算，阴性对照cfp+yfp的结合率约为0；阳性对照cfp-yfp的结合率约为50％；cfp-trim54+yfp-stat2的结合率约为30％。
53.实施例5筛选靶向trim54/stat2互作的小分子化合物
54.我们选取的靶向蛋白互作的小分子库购自med chem express公司，包含了167个小分子化合物。药物以冻干粉的形式分别用相应的溶剂(dmso、乙醇、水)溶解，浓度为10mm，长期保存于-80℃冰箱。将小分子药物库中的药物用dmem以1:10的比例稀释至1mm并将其冻存于-20℃冰箱用于后续实验。
55.我们将质粒pcmv-n-cfp(cfp)、pcmv-c-yfp(yfp)、pcmv-n-cfp和pcmv-c-yfp(cfp+yfp)、pcmv-n-cfp-yfp(cfp-yfp)、pcmv-n-cfp-trim54(cfp-trim54)、pcmv-c-yfp-stat2和p3xflag-cmv-10-trim54(yfp-stat2)、pcmv-n-cfp-trim54和pcmv-c-yfp-stat2(cfp-trim54+yfp-stat2)分别转染到293t细胞中，培养48h后将细胞分别铺到全黑96孔细胞培养板中，每组细胞各三个复孔，每孔各5
×
104个细胞。随后，我们将化合物加到共表达cfp-trim54和yfp-stat2的细胞中至终浓度为10μm作为实验组，将相同稀释度的dmso加到共表达cfp-trim54和yfp-stat2的细胞中。培养24h后用酶标仪扫描，并根据各组的荧光强度读值，用公式e％＝1-(d
da
/(d
da
+(f
da-(d
da
×
d)-(a
da
×
a))
×
qd/qa))计算不同化合物处理后的cfp-trim54和yfp-stat2之间的结合效率。并将结合率的值代入公式：“(对照组-实验组)/对照组”计算化合物的抑制效率，以便更直观地展示化合物抑制效果。
56.在fret筛药体系中筛选出的抑制率大于20％的药物被认为是有效药物，初筛结果显示(图5a)抑制率大于20％的化合物有4个，即9、64、86、159号化合物，其中159的抑制率超过40％。
57.随即我们用流式细胞仪对被酶标仪筛选过的细胞进行检测，得到不同化合物处理后的cfp-trim54和yfp-stat2之间的结合效率。并将结合率的值代入公式：“(对照组-实验组)/对照组”计算化合物的抑制效率，以更直观地展示化合物抑制效果。如图5b所示，抑制率高于20％的化合物有6个，即9、64、66、86、87、159号化合物。其中，9、159号化合物的抑制率超过40％。
58.实施例6小分子化合物复筛
59.小分子药物的初筛结果表示，第9、64、66、86、87、159号化合物对trim54和stat2的互作具有明显的抑制效果。由于我们检测的是fret通道的荧光强度，对细胞活力有抑制作用的化合物也会抑制fret信号，将相应化合物作为假阳性筛选进来。因此我们通过考察化合物对cfp-yfp融合蛋白组fret通道的抑制来排除假阳性的化合物。我们向实验组(转染表达cfp-trim54和yfp-stat2质粒的细胞)中加入上述化合物至终浓度为10μm，同时在对照组(转染融合表达cfp-yfp质粒的细胞)中加入相同的化合物至终浓度为10μm，培养24h后用酶标仪读取各通道荧光强度，计算化合物对实验组以及对照组蛋白结合率的影响(图6a)。进一步用流式细胞仪检测化合物对fret通道阳性率的影响(图6b)。结果表明筛选出的药物不影响对照组的fret信号，其对trim54和stat2的抑制是特异性的。
60.实施例7化合物逆转trim54降解stat2的性能
61.为了验证化合物是否可以抑制trim54诱导的stat2的降解作用。我们将编码flag-trim54的质粒转染到293t细胞中，9h后加入化合物(9、64、66、86、87、159)至终浓度为10μm。24h后收集并裂解细胞，离心取细胞裂解液进行western blot。我们通过考察胞内stat2的蛋白表达量，以验证该药物对trim54介导降解stat2的抑制效果。如图7所示，trim54可以诱导stat2的降解，而化合物9、64、66、87、159可以逆转stat2的降解。
62.实施例8化合物阻断trim54/stat2互作的性能
63.为了验证化合物对trim54/stat2互作真实的抑制效果，我们利用免疫共沉淀实验进行验证。将编码flag-trim54的质粒转染到293t细胞中，24h后裂解细胞，离心取细胞裂解液加入化合物(9、64、66、86、87、159)至终浓度为10μm，对照组加入相同稀释浓度的dmso，与anti-flag affinity gel在4℃的条件下一同孵育12h后对附着在凝胶上的蛋白进行western blot。如图8所示，flag-trim54能与内源性stat2结合，co-ip体系中加入靶向trim54/stat2互作的化合物后，化合物均可抑制trim54和stat2的互作。
64.实施例9化合物对denv2和抗体4g2感染k562的抑制作用
65.k562细胞是人单核细胞系，表达fcγriia，具备建立ade模型的条件。我们利用denv2与单克隆抗体4g2(denv1 e蛋白的特异性单抗)形成的免疫复合物感染单核细胞。首先，我们分别将denv2和4g2抗体(终浓度为1μg/ml)在25℃的条件下孵育1h形成复合物。按moi＝1感染k562细胞(5
×
105)。对照组分别加入等量的rpmi、4g2或denv2孵育培养72h后，收集细胞，固定、破膜、用alexa fluor 647标记的4g2抗体标记胞内denv2后，利用流式细胞仪检测感染denv2的细胞比例和病毒载量。在进行去死细胞、去黏连后在rl1通道检测病毒感染k562细胞的效率。如图9a所示，对照组(加入rpmi、4g2或denv2)的感染率分别为1％(理论上为0)、1％(理论上为0)和10％。而实验组(denv2+4g2)的感染率为70％。以上结果表明，由denv2和4g2形成的免疫复合物可以促进denv2感染，该ade模型构建成功。
66.本发明探究了化合物对k562细胞构建的ade的抑制作用。我们将ade模型的k562细胞加入10μm化合物。孵育培养72h后收集细胞。在进行固定、破膜、染色后，我们将细胞通过流式细胞仪分析。如图9b所示，加入化合物的k562细胞的病毒感染率有下降的趋势。提示其可能可以作为抑制病毒ade效应的潜在药物。进一步选择抑制作用较强的化合物(64，86，159)考察其对ade效应抑制作用的剂量依赖性。我们将denv2和抗体4g2(终浓度为1μg/ml)在25℃的条件下孵育1h后感染k562细胞(moi＝1)，并将化合物(终浓度为1、3、10和30μm)分
别加到细胞中，以探究不同剂量的化合物对ade效应的抑制作用，对照组加入相同稀释度的med(dmso)。在进行固定、破膜、染色后，我们将细胞通过流式细胞仪分析。结果如图9c所示，64(baricitinib)和159(rivaroxaban)对ade效应的抑制作用较为明显，且具有剂量依赖性。
67.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、分别构建第一质粒和第二质粒，将第一质粒和第二质粒导入细胞中，检测fret信号；所述第一质粒和第二质粒上分别含有编码trim54的基因和编码stat2的基因，第一质粒和第二质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因，且所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白能够发生荧光共振能量转移；s2、将待测化合物与步骤s1所述细胞共孵育，根据fret信号的变化筛选出抑制病毒ade效应的药物。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述编码trim54的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述编码stat2的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：以导入第三质粒的细胞为阳性对照，其中，第三质粒上含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：以导入第四质粒和第五质粒的细胞为阴性对照，其中，第四质粒和第五质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：通过流式细胞法或荧光酶标法检测fret信号。7.抑制trim54和stat2相互作用的物质在制备抗病毒ade效应药物中的应用。8.表征trim54和stat2相互作用的物质在抗病毒ade效应药物筛选中的应用。9.baricitinib或rivaroxaban在制备抑制病毒ade效应药物中的应用。10.一种抗病毒ade效应的药物，其特征在于：所述药物中包括baricitinib或rivaroxaban。

技术总结
本发明涉及一种以抑制TRIM54泛素化降解STAT2为靶点的抗病毒ADE药物筛选方法，并基于该筛选体系筛选出了一系列抗病毒ADE效应的药物：Baricitinib、Rivaroxaban等，为这些药物拓展了新的应用领域，且对于目前尚无针对ADE治疗方案的空白提供了候选药物，对有ADE效应的病毒防治有重要的生物学意义。病毒防治有重要的生物学意义。病毒防治有重要的生物学意义。


技术研发人员：龚方苑 高晓明 韩朝杰 花盛浩 王洪民
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2022.08.30
技术公布日：2023/7/20