一种促生长作用的植物提取物组合制剂及其制备方法和应用

1.本发明属于植物提取物，具体涉及一种促生长作用的植物提取物组合制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物提取物是经过溶剂浸提法、超临界高压法或生物发酵法等相关工艺处理后，从植物中提取的天然物质，主要化学成分为植物多糖类、黄酮类、皂苷类和多酚类等，以上物质具有调节免疫能力、提高动物采食量、改善肉质及风味、抗氧化、抑菌消炎和杀灭寄生虫等功效。因其资源丰富、来源广泛、功能全面、安全性高、副作用小、不易产生耐药性、残留少等独特优势，受到了广大学者和从业人员的青睐。由于养殖企业在过往实际生产中常常采用亚治疗剂量抗生素添加(integration of pharmacokinetic and pharmacodynamic indices of valnemulin in broiler chickens after a single intravenous and intramuscular administration.vet j.2014 jul；201(1):109-15.)，以达到增强畜禽体质、促进畜禽生长、缩短养殖周期和降低饲料成本等目的，由此引发的细菌耐药性增强、有害物质残留，以及威胁人类健康等问题日趋增重，“饲料无抗化”已然成为了畜牧业发展的必然趋势。禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物饲料添加剂，并明确禁止在市面流通产品中该类物质的检出，因此寻找安全高效的“替抗促生长”类添加剂已成为当前行业发展的重中之重。橙皮苷作为一种植物活性提取物，具有改善胃肠机能、促进动物生长性能和调节免疫的作用，现有技术中，相关研究(individual and combined effects of genistein and hesperidin supplementation on meat quality in meat-type broiler chickens.j sci food agric.2013 oct；93(13):3362-7.)均已证明橙皮苷的促生长等作用。
3.橙皮苷为二氢黄酮衍生物，能够促进胞外信号调节激酶(erk)和核因子e2相关因子2(nrf2)的基因表达，上调血红素加氧酶-1(ho-1)的表达，增加抗氧化物质的合成与分泌，同时黄酮类化合物还能够调节小肠上皮细胞中分泌细胞与吸收细胞的动态平衡，促进肠道发育，增强消化吸收功能。在动物生产中应用橙皮苷改善畜禽生产性能的报道较多，据王海良等的研究表明，饲粮添加橙皮苷比例为50mg/kg～150mg/kg时，可以显著提高育雏阶段肉鸡体重，同时对降低肉鸡死亡率、提高免疫器官指数亦呈现出一定积极效果。在饲粮中添加橙皮苷能够显著提高肉仔鸡体重，改善全期饲料转化率，促进机体免疫器官生长。
4.由于植物提取物在动物体内发挥功效的过程与机体生理生化代谢密切相关，单一植物提取物添加模式会受到消化酶降解、微生物酵解、吸收入血阻碍等生物体天然屏障的干扰作用，往往会引起功效降低、活性成分损耗偏高等现象，这与植物提取物有效活性成分自身分子结构、机体生理调节、药理代谢效应等诸多因素相关。而应用复合植物提取物不仅能够促进动物生长速率、提升动物生产性能，同时由于复合植物提取物中多种有效成分彼此间的辅佐效应，相比于单一模式添加会显著提升药理效果。为了提高植物提取物应用效果，增加植物提取物的功能，使它们某些活性成分或功能性成分对促进肉鸡生长具有叠加
和协同作用效果。
5.复合植物提取物制剂作为一种“非抗生素类”促生长饲料添加剂，虽然现有技术中橙皮苷可以提高育雏阶段肉鸡体重，同时对降低肉鸡死亡率、提高免疫器官指数亦呈现出一定积极效果。但是其单独使用时由于橙皮苷自身的水溶性与脂溶性均较差，难以被机体有效吸收利用，同时易受到胃酸及一些降解酶的分解而失去活性。如果开发出有效的复合植物提取物制剂进一步提高橙皮苷促生长的功效，同时解决其单独使用时产生的问题，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种促生长作用的植物提取物组合制剂，该植物提取物组合制剂包括橙皮苷和百里香酚，其可以实现在较低的剂量下显著提高肉鸡的各项指标。
7.本发明还提供所述促生长作用的植物提取物组合制剂的制备方法和应用。
8.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种促生长作用的植物提取物组合制剂，所述植物提取物组合制剂包括橙皮苷和百里香酚。
9.作为优选，所述植物提取物橙皮苷和百里香酚的质量比为1-6:1-3。
10.本发明所述促生长作用的植物提取物组合制剂的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)橙皮苷的提取：橙皮苷采用溶剂浸提法进行提取，陈皮粉碎后过筛；过筛后的陈皮粉末加入乙醇中，进行热溶剂提取，提取样品真空冷冻保存；
12.(2)百里香酚的提取：百里香叶片粉碎后通过筛分离；过筛后的百里香粉末加入乙醇进行高压处理，收集提取液进行提纯；先使用微滤膜对提取液进行过滤，将滤液调整ph用正丁醇进行萃取，回收萃取液加水溶解，调整ph用乙酸乙酯萃取，洗脱萃取液，过大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥；
13.(3)提取物应用液的制备：将两种植物提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，稀释后按比例混合制成植物提取物应用液，即为促生长作用的植物提取物组合制剂。
14.其中，步骤(1)所述热溶剂提取反应条件为：在100～120℃条件下进行，提取时间为30～45min。
15.作为优选，步骤(1)所述热溶剂提取反应条件为：在120℃条件下进行，提取时间为45min。
16.其中，步骤(1)所述陈皮粉末和乙醇溶液料液比为1:50～70g/ml。
17.作为优选，步骤(1)所述陈皮溶液和乙醇溶液料液比为1:70g/ml；其中乙醇为浓度为60％的乙醇溶液。
18.其中，步骤(2)所述百里香粉末和乙醇溶液料液比为1：40～50g/ml，其浓度为83％～97％的乙醇溶液。
19.作为优选，步骤(2)所述百里香粉末和乙醇溶液料液比为1：50g/ml，其浓度为85％的乙醇溶液。
20.其中，步骤(2)所述高压设备条件为：350mpa～400mpa下高压5min～10min。
21.作为优选，步骤(2)所述萃取时间为每次20min。
22.本发明所述促生长作用的植物提取物组合物制剂在动物饲料中的应用。
23.其中，所述促生长作用的植物提取物组合物制剂制备在肉鸡饲料中的应用。
24.其中，所述肉鸡饲料为基础饲粮、20-30mg/kg的橙皮苷和10-15mg/kg的百里香酚。
25.作为优选，所述肉鸡饲料为基础饲粮、30mg/kg的橙皮苷和15mg/kg的百里香酚，其中橙皮苷和百里香酚按肉鸡体重添加，橙皮苷为30mg/kg，百里香酚为15mg/kg。
26.本发明的设计原理是立足于橙皮苷具有促进胃肠蠕动，影响激素分泌，促进饲粮消化吸收进程这一特点但不易被机体吸收来发挥作用，结合百里香酚对消化道微生态的改善作用，推测二者联合使用会产生协同作用。百里香酚对消化道微生物组成的改善作用，刚好可以促进橙皮苷向小分子物质的次级代谢产物分解这一过程，同时橙皮苷对动物机体消化吸收过程的促进效果也积极推进了百里香酚具有的抗氧化功效。百里香酚对消化道微生物组成的改善作用，使得有益菌相对丰度升高，进而促进了消化道微生物对橙皮苷的分解代谢作用，使由橙皮苷产生的次级代谢物更好的被机体消化吸收来发挥促进胃肠蠕动，影响激素分泌，促进饲粮消化吸收的作用，同时橙皮苷对机体消化、吸收等生理生化反应的促进作用，也有助于百里香酚更好地发挥其抗氧化功能。
27.橙皮苷在体内经过消化、吸收、代谢与分布后，由于存在肝肠循环，在小肠部位停留时间较长，并且能够刺激脑肠肽ghrelin的分泌，而ghrelin的分泌与胃动素密切相关，能够呈现出增强胃肠动力的作用，但由于橙皮苷结晶形态的水溶性及脂溶性均较差，不易被机体吸收，易受到胃酸和部分消化酶的破坏而降解失活，必须经过相关修饰后才能完成在体内的代谢过程，其在肠道的消化吸收主要依靠肠道益生菌协助完成，益生菌合成分泌的α-鼠李糖酶和β-鼠李糖酶能够脱去橙皮苷c7位的芸香糖链，转变为苷元，被相关酶降解后，经由肠壁上皮细胞吸收从而发挥功效。而百里香酚对肠道微生态环境具有调控作用，能够提高有益菌的相对丰度，两者配合使用，能够明显促进橙皮苷的消化吸收效率，增强胃肠动力，同时还可以发挥百里香酚的抗氧化功效，增强机体免疫力。
28.综上，本发明中由于橙皮苷本身分子量大，水溶性及脂溶性均较差，不易被机体吸收，借助于百里香酚的微生态改善肠道微生物组成，由微生物代谢橙皮苷生成次级代谢物其具有影响激素分泌，有效促进饲粮消化吸收进程。
29.此外，本发明中发现在使用特定低剂量的橙皮苷(30mg/kg)和百里香酚(15mg/kg)组合条件下可以显著提升肉鸡育雏阶段和育成阶段的生长性能，同时也提高饲料转化效率，增强肉鸡屠宰性能；而该特定低剂量的橙皮苷和百里香酚单独使用时完全没有任何的功效，并且按现有技术中一般起到作用的橙皮苷剂量至少为60mg/kg，而百里香酚为30mg/kg，需求量高，而本发明降低橙皮苷和百里香酚用量有效降低成本。
30.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31.(1)橙皮苷和百里香酚组合制剂添加剂量小、活性强且生产成本较低，对肉鸡生产性能起到了更好的改善效果，组合制剂相比于单一模式植物提取物的添加，在生产性能、屠宰性能和免疫指标等方面均呈现出更好的作用效果。
32.(2)提高了生长性能、增强动物机体免疫力，本发明显著提升肉鸡育雏阶段和育成阶段的生长性能，同时也提高饲料转化效率，增强肉鸡屠宰性能。
33.(3)提高了肉鸡回肠抗氧化能力，具有增强肉鸡自身免疫力的作用，本发明作为一种“非抗生素类”促生长饲料添加剂，在提高肉鸡生长性能、防止生产周期延长、提高饲料转
化率等方面具有良好的应用前景。
34.(4)本发明制备简单，使用方便，生物利用率高，可以大规模生产应用，并有效降低成本。
附图说明
35.图1为本发明中肉鸡体重变化图：(a)育雏阶段和育成阶段肉鸡体重变化趋势图；(b)肉鸡1-21日龄平均日增重柱状图；(c)肉鸡22-42日龄平均日增重柱状图；(d)肉鸡1-42日龄平均日增重柱状图；
36.图2为本发明中肉鸡不同阶段平均日采食量对比图：(a)肉鸡1-21日龄平均日采食量柱状图；(b)肉鸡22-42日龄平均日采食量柱状图；(c)肉鸡1-42日龄平均日采食量柱状图；
37.图3为本发明中肉鸡不同阶段料重比对比图：(a)肉鸡1-21日龄料重比柱状图；(b)肉鸡22-42日龄料重比柱状图；(c)肉鸡1-42日龄料重比柱状图；
38.图4为本发明中低剂量(橙皮苷30mg/kg、百里香酚15mg/kg)橙皮苷或百里香酚添加剂模式下肉鸡不同阶段平均日增重对比图(a)肉鸡1-21日龄平均日增重柱状图；(b)肉鸡22-42日龄平均日增重柱状图；(c)肉鸡1-42日龄平均日增重柱状图；
39.图5为本发明中低剂量(橙皮苷30mg/kg、百里香酚15mg/kg)橙皮苷或百里香酚添加剂模式下肉鸡不同阶段平均日采食量对比图(a)肉鸡1-21日龄平均日采食量柱状图；(b)肉鸡22-42日龄平均日采食量柱状图；(c)肉鸡1-42日龄平均日采食量柱状图；
40.图6为本发明中低剂量(橙皮苷30mg/kg、百里香酚15mg/kg)橙皮苷或百里香酚添加剂模式下肉鸡不同阶段料重比对比图(a)肉鸡1-21日龄料重比柱状图；(b)肉鸡22-42日龄料重比柱状图；(c)肉鸡1-42日龄料重比柱状图；
41.图7为本发明中橙皮苷-百里香酚组与橙皮苷-6-姜酚肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日增重对比图；
42.图8为本发明中橙皮苷-百里香酚组与橙皮苷-6-姜酚肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日采食量对比图。
具体实施方式
43.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
44.实施例1
45.植物提取物的获得与鉴定
46.1、橙皮苷的提取与鉴定
47.橙皮苷采用溶剂浸提法进行提取。陈皮粉碎后过250目分离筛后用于提取有效成分，样本储存在-20℃待用。具体步骤为：(1)称量0.20g过250目筛后的陈皮粉末于25ml聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，按照1:70(g/ml)的料液比加入体积分数为60％的乙醇溶液，在120℃条件下进行热溶剂提取，提取时间为45min。(2)提取结束后4000r/min离心5min，取上清，立即旋转蒸发除去乙醇，剩余样品真空冷冻保存，用于后续鉴定。
48.为明确所提取橙皮苷是否成功，本发明采用了高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示其纯度在98％以上。
49.橙皮苷的鉴定采用高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析。具体步骤为：(1)标准工作曲线的绘制，精确称量橙皮苷标准品10.00mg，使用50％的甲醇溶液定容到200ml容量瓶中。采用逐级稀释的方法将标准溶液稀释成2.50、5.00、10.00、15.00、20.00μg/ml的溶液。(2)使用液相色谱仪测定标准溶液和样品。色谱条件为：kromasil c18柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为：乙睛-水-磷酸(20:80：0.024，v/v)；流速：1.0ml/min；检测波长：283nm；进样量：20μl；柱温：室温。(3)先测定不同浓度标准品，绘制标准品曲线，再计算样品中橙皮苷的含量，通过hplc与标样对比证明提取物为橙皮苷，其纯度在98％以上。
50.2、百里香酚的提取与鉴定
51.百里香叶片粉碎后通过80目筛分离，用于提取有效成分，样本储存在-20℃待用。百里香酚的提取采用超临界高压提取法。具体步骤为：(1)称量100.0g过80目筛后的百里香粉末于聚乙烯袋中，加入其体积为50倍体积、体积分数为85％的乙醇溶液，密封后放入高压设备中400mpa下高压5min，收集用于后续分离提纯。(2)百里香酚的分离与纯化：先使用微滤膜对提取液进行预处理，过滤三次，除去提取液中的悬浮颗粒(果胶、蛋白等)。将上一步滤液用盐酸调整ph至3.0，以1.5倍体积正丁醇进行萃取，萃取条件为：萃取两次，每次时间20min，回收正丁醇用于下一步操作。将正丁醇加13倍体积水溶解，记录体积，用盐酸调整ph至2.0～2.5，用体积比为10:6的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取20min。使用75％的乙醇溶液洗脱萃取液，然后通过x-5大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥。
52.为明确所提取百里香酚是否成功，本发明采用了高效液相色谱法(hplc)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示其纯度在98％以上。
53.百里香酚含量的测定采用高效液相色谱法(hplc)，对提取物产品进行定量分析。具体步骤为：(1)标准样品溶液的制备。使用分析出天平准确称量出4.950mg的百里香酚标准品，使用乙腈定容至10ml，浓度为0.495mg/ml。(2)使用液相色谱仪测定。色谱条件：sunfire c18(4.6mm
×
150.0mm，3.5μm)；流动相为乙腈-水(3：2，v/v)；流速为1.0ml/min；检测器为紫外光谱检测器，检测波长为274nm；灵敏度为0.1afus；柱温为30
±
5℃；溶解介质为乙腈。(3)以标准品为参比，计算提取物中百里香酚的含量，通过hplc与标样对比证明提取物为百里香酚，其纯度在98％以上。
54.3、两种植物提取物储备液制备
55.(1)橙皮苷提取物制备：称取4.00g橙皮苷于离心管中，加入10ml二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床2h(37℃，150rpm)，每隔30min取出混匀30s。取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的储存液，于4℃冰箱保存备用。
56.(2)百里香酚提取物：称取4.00g百里香酚于离心管中，加入10ml二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床2h(37℃，150rpm)，每隔30min取出混匀30s。取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的储存液，于4℃冰箱保存备用。
57.(3)将两种植物提取物储备液分别稀释，橙皮苷稀释成20mg/ml、30mg/ml、60mg/ml；百里香酚稀释成10mg/ml、15mg/ml、30mg/ml，将两种组合制剂按质量浓度2：1混合后涡旋30s，置于摇床2h(37℃，150rpm)，每隔30min取出混匀30s，制成植物提取物应用液。
58.实施例2
59.试验设计：
60.采用完全随机试验设计，选取1日龄、平均体重为(44.65
±
1.45)g的健康白羽肉鸡
(aa)肉仔鸡公鸡雏200只，随机分成4个组，分别为对照组(con group)、橙皮苷组(hes group)、百里香酚组(thy group)和橙皮苷-百里香酚组(hes+thy group)，每组5个重复，每个重复10只鸡，各组体重无显著差异(p》0.05)。每个重复置于同一笼(0.9m
×
0.6m)中。基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，参照《鸡饲养标准》(ny/t 33-2004)配制成粉状配合饲粮。对照组饲喂基础饲粮，橙皮苷组饲喂基础饲粮+60mg/kg比例的橙皮苷制剂，百里香酚组饲喂基础饲粮+30mg/kg比例的百里香酚制剂，橙皮苷-百里香酚组饲喂基础饲粮+30mg/kg比例的橙皮苷制剂+15mg/kg比例的百里香酚制剂(橙皮苷制剂与百里香酚制剂预先制成橙皮苷-百里香酚促生长制剂)。试验于南京农业大学动物实验中心进行，时间为2021年4月～2021年6月，试验期间肉鸡自由采食和饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。肉鸡采用三层笼养方式进行饲养，鸡舍内采用23h人工光照，1h黑暗处理，温度由1日龄时的34℃逐步降低至21日龄时的24℃，然后保持大致稳定。试验期42d，分为育雏期(1-21日龄)和育成期(22-24日龄)2个阶段。试验第42天，以重复为单位，空腹12h后称重，随后从每组中选取10只肉鸡(即每个重复依据平均体重选取2只)进行屠宰及后续样本采集工作。
61.实施例3
62.生长性能指标测定：
63.试验开始时对1日龄肉仔鸡以每个重复为单位称取其初始体重，并记录。试验期间分别于21和42日龄，空腹3h后以每个重复为单位测定肉仔鸡的体重，同时统计各组给料量和剩余料量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比，用以评价橙皮苷-百里香酚促生长制剂对肉鸡各项生长性能指标的影响效果。
64.(1)对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡育雏阶段和育成阶段体重结果分析如图1(a)所示，从图中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷制剂、百里香酚制剂，以及橙皮苷-百里香酚促生长制剂均能提高育雏阶段肉鸡体重。与对照组相比，在饲粮中添加百里香酚制剂或橙皮苷-百里香酚促生长制剂均能提高育成阶段肉鸡体重，且橙皮苷-百里香酚促生长制剂提高肉鸡体重效果优于单一添加组，但单独添加橙皮苷制剂对育成阶段肉鸡体重无显著性影响(p《0.05)。
65.(2)对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日增重结果分析如图1(b)、图1(c)和图1(d)所示。从图中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加百里香酚制剂或橙皮苷-百里香酚促生长制剂均能显著提高肉鸡1-21日龄平均日增重(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡1-21日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够显著提高肉鸡22-42日龄平均日增重(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡22-42日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够显著提高肉鸡1-42日龄平均日增重(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡1-42日龄平均日增重无显著性影响(p》0.05)。
66.(3)对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日采食量结果分析如图2(a)、图2(b)和图2(c)所示，从图中可以看出，与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂能够极显著提高肉鸡1-21日龄平均日采食量(p《0.01)，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够显著提高肉鸡1-21日龄平均日采食量(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡1-21日龄平均日采食量无
显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够显著提高肉鸡22-42日龄平均日采食量(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡22-42日龄平均日采食量无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够显著提高肉鸡1-42日龄平均日采食量(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡1-42日龄平均日采食量无显著性影响(p》0.05)。
67.(4)对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的料重比结果分析如图3(a)、图3(b)和图3(c)所示，从图中可以看出，与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均对肉鸡1-21日龄料重比无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够极显著降低肉鸡22-42日龄料重比(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡22-42日龄料重比无显著性影响(p》0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂能够极显著降低肉鸡1-42日龄料重比(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡1-42日龄料重比无显著性影响(p》0.05)。
68.(5)虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(橙皮苷60mg/kg，百里香酚30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(橙皮苷30mg/kg、百里香酚15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如图4-6所示，从图4中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡1-21日龄平均日增重、对肉鸡22-42日龄平均日增重，以及对肉鸡1-42日龄平均日增重均无显著性影响(p》0.05)。从图5中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡1-21日龄平均日采食量、对肉鸡22-42日龄平均日采食量，以及对肉鸡1-42日龄平均日采食量均无显著性影响(p》0.05)。从图6中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或橙皮苷制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡1-21日龄料重比、对肉鸡22-42日龄料重比，以及对肉鸡1-42日龄料重比均无显著性影响(p》0.05)。
69.以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对提高育雏阶段肉鸡的平均日采食量和平均日增重具有重要作用，同时能够显著降低育成阶段及肉鸡整个生产过程中的料重比，对提高饲料转换率具有重要意义，并且对肉鸡生产性能的提升作用优于单一提取物添加模式。
70.实施例4
71.屠宰性能指标检测：
72.屠宰前对每只试验鸡分别进行称重，记录为活重；肉鸡屠宰脱毛后称取屠体重记为w1，用于测定屠宰率；去除气管、食管、嗦囊、肠、脾脏、胆囊、胰腺、生殖器官、心脏、肝脏、腺胃、肌胃、腹脂，以及头和脚后称重记为w2，用于测定全净膛率，其中屠宰率＝(屠体重/屠宰前活重)
×
100％，全净膛率＝(w1
–
w2)/屠宰前活重
×
100％；同时称取心脏、肝脏、腹脂重量，分别记录后用以计算不同器官指数，其中心脏器官指数＝[心脏器官重量(g)/屠宰前活重(g)]
×
100％，肝脏器官指数＝[肝脏器官重量(g)/屠宰前活重(g)]
×
100％，腹脂率＝[腹脂重量(g)/屠宰前活重(g)]
×
100％。
百里香酚促生长制剂可以显著提高肉鸡42日龄屠宰率(p《0.03)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡42日龄屠宰率无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均可以提高肉鸡42日龄全净膛重(p《0.01)，且添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂的作用效果极显著高于单独添加百里香酚制剂(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡42日龄全净膛重无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均对肉鸡42日龄全净膛率无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均可以提高肉鸡42日龄胸肌重(p《0.01)，且添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂的作用效果极显著高于单独添加百里香酚制剂(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂对肉鸡42日龄胸肌重无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂可以极显著提高肉鸡42日龄胸肌率(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡42日龄胸肌率无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均可以提高肉鸡42日龄腿肌重(p《0.01)，且添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂的作用效果极显著高于单独添加橙皮苷制剂或单独添加百里香酚制剂(p《0.01)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均对肉鸡42日龄腿肌率无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂可以显著提高肉鸡42日龄腹脂重(p《0.01)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡42日龄腹脂重无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均对肉鸡42日龄腹脂率无显著性影响(p》0.05)。
[0077]
以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对提高肉鸡42日龄的活重、屠体重、全净膛重、胸肌重、腿肌重和腹脂重具有重要作用，同时能够显著增加肉鸡屠宰率和胸肌率，并且对肉鸡屠宰性能的提升作用明显优于单一提取物添加模式；同时若单独采用低剂量的橙皮苷或者百里香酚，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂(30mg/kg)或者单独添加百里香酚制剂(15mg/kg)，其结果基本均无影响，与对照组类似。
[0078]
实施例5
[0079]
免疫指标的测定：
[0080]
完整取出肉鸡脾脏、法氏囊和胸腺，剪去周边组织，用滤纸擦干后称重，同时计算免疫器官指数，其中免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/屠宰前活重(g)。同时在屠宰后采集肉鸡回肠部位中段，于-80℃分装保存，其中总抗氧化能力(t-aoc)，总超氧化物歧化酶(t-sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和丙二醛(mda)含量的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照试剂盒说明书要求进行操作，并用biotech酶标仪进行检测，用以评价橙皮苷-百里香酚促生长制剂对肉鸡各项屠宰性能指标和自身免疫能力的影响效果。
[0081]
对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡42日龄器官指数结果如表2所示：
[0082]
表2饲粮添加橙皮苷制剂、百里香酚制剂和橙皮苷-百里香酚促生长制剂对42日龄肉鸡器官指数的影响
[0083][0084]
从表2中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚(30mg/kg、15mg/kg)促生长制剂可以显著提高肉鸡42日龄胸腺指数(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂(60mg/kg)或添加百里香酚制剂(30mg/kg)对肉鸡42日龄胸腺指数均无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对肉鸡42日龄脾脏指数、法氏囊指数、肝脏指数和心脏指数均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对提高肉鸡42日龄的胸腺指数具有重要作用。同时若单独采用低剂量的橙皮苷或者百里香酚，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂(30mg/kg)或者单独添加百里香酚制剂(15mg/kg)，其结果基本均无影响，与对照组类似。
[0085]
对照组、橙皮苷组、百里香酚组，以及橙皮苷-百里香酚组肉鸡42日龄回肠抗氧化能力结果如表3所示：
[0086]
表3饲粮添加橙皮苷制剂、百里香酚制剂和橙皮苷-百里香酚促生长制剂对42日龄肉鸡回肠抗氧化能力的影响
[0087]
[0088]
从表3中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚(30mg/kg、15mg/kg)促生长制剂可以显著提高肉鸡42日龄回肠总抗氧化能力(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂(60mg/kg)或添加百里香酚制剂(30mg/kg)对肉鸡42日龄回肠总抗氧化能力均无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂可以显著提高肉鸡42日龄回肠总超氧化物歧化酶含量(p《0.05)，但单独添加橙皮苷制剂或添加百里香酚制剂对肉鸡42日龄回肠总超氧化物歧化酶含量均无显著性影响(p》0.05)；与对照组相比，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对肉鸡42日龄回肠谷胱甘肽过氧化物酶含量和丙二醛含量均无显著性影响(p》0.05)。以上结果表明，饲粮添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂对提高肉鸡42日龄回肠总抗氧化能力具有重要作用，同时能够显著增加肉鸡42日龄回肠总超氧化物歧化酶含量，对提高肉鸡自身抗氧化能力具有重要意义。同时若单独采用低剂量的橙皮苷或者百里香酚，在饲粮中单独添加橙皮苷制剂(30mg/kg)或者单独添加百里香酚制剂(15mg/kg)，其结果基本均无影响，与对照组类似。
[0089]
对比例1
[0090]
采用等量的6-姜酚代替实施例2中的百里香酚，并按本发明后续的实施例进行各个测定实验，橙皮苷-百里香酚组与橙皮苷-6-姜酚肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日增重结果分析如图7所示，从图中可以看出，与在饲粮中添加橙皮苷-6-姜酚组相比，添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均能显著提高肉鸡在1-21日龄、22-42日龄、1-42日龄平均日增重(p《0.05)。
[0091]
对比例2
[0092]
采用等量的6-姜酚代替实施例2中的百里香酚，并按本发明后续的实施例进行各个测定实验，橙皮苷-百里香酚组与橙皮苷-6-姜酚肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的平均日日采食量结果分析如图8所示，从图中可以看出，与在饲粮中添加橙皮苷-6-姜酚组相比，添加橙皮苷-百里香酚促生长制剂均能显著提高肉鸡在1-21日龄、22-42日龄、1-42日龄平均日增重(p《0.05)。
[0093]
对比发现，两种组合制剂的叠加与协同作用在本试验中产生了较为理想的实际效果，但并非任意两两组合均可产生叠加及协同效应，同时也不是任何可以通过微生态改善肠道微生物组成的物质如6-姜酚，可以与橙皮苷组合促进肉鸡的各项生理指标。

技术特征：
1.一种促生长作用的植物提取物组合制剂，其特征在于，所述植物提取物组合制剂包括橙皮苷和百里香酚。2.根据权利要求1所述的促生长作用的植物提取物组合制剂，其特征在于，所述橙皮苷和百里香酚的质量比为1-6:1-3。3.一种利用权利要求1所述的促生长作用的植物提取物组合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)橙皮苷的提取：陈皮粉碎后过筛；过筛后的陈皮粉末加入乙醇中，进行热溶剂提取，提取样品真空冷冻保存；(2)百里香酚的提取：百里香叶片粉碎后过筛分离；过筛后的百里香粉末加入乙醇进行高压处理，收集提取液进行提纯；先使用微滤膜对提取液进行过滤，将滤液调整ph用正丁醇进行萃取，回收萃取液加水溶解，调整ph用乙酸乙酯萃取，洗脱萃取液，过大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥；(3)提取物应用液的制备：将两种植物提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，稀释后按比例混合制成植物提取物应用液，即为促生长作用的植物提取物组合制剂。4.根据权利要求3所述的植物提取组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述热溶剂提取反应条件为：在100～120℃条件下进行，提取时间为30～45min。5.根据权利要求3所述的植物提取组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述陈皮粉末和乙醇溶液料液比为1:50～70g/ml。6.根据权利要求3所述的植物提取组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述百里香粉末和乙醇溶液料液比为1：40～50g/ml，其浓度为83％～97％的乙醇溶液。7.根据权利要求3所述的植物提取组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述高压设备条件为：350mpa～400mpa下高压5min～10min。8.一种利用权利要求1所述的促生长作用的植物提取物组合物制剂制备在动物饲料中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促生长作用的植物提取物组合物制剂制备在肉鸡饲料中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肉鸡饲料包括基础饲粮、20-30mg/kg的橙皮苷和10-15mg/kg的百里香酚。

技术总结
本发明涉及一种促生长作用的植物提取物组合制剂及其制备方法和应用，该植物提取物组合制剂植物提取物包括橙皮苷和百里香酚，其质量比为1-6:1-3；所述制备方法包括：(1)橙皮苷的提取、(2)百里香酚的提取、(3)百里香酚的分离与纯化、(4)提取物应用液的制备。本发明采用橙皮苷和百里香酚组合，并且可以在特定的低剂量组合下显著提升肉鸡育雏阶段和育成阶段的生长性能，同时也提高饲料转化效率，增强肉鸡屠宰性能，可以作为一种“非抗生素类”促生长饲料添加剂，在提高肉鸡生长性能、防止生产周期延长、提高饲料转化率等方面具有良好的应用前景。景。


技术研发人员：汪晶 吴建民 赵文轩 朱伟云
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2022.01.07
技术公布日：2023/7/20