一种N-MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法与流程

一种n-mid骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法
技术领域
1.本发明涉及免疫学测定技术领域，尤其涉及一种n-mid骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法。


背景技术：

2.骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，占骨基质中非胶原蛋白成分的25﹪，骨总蛋白的2﹪。完整的骨钙素有49个氨基酸组成，相对分子质量为5800。血清中的骨钙素具有多样性，约三分之一为完整骨钙素，三分之一为n-mid骨钙素(n-mid osteocalcin)片段，三分之一为氨基酸短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，作为骨转换标志物逐渐被临床应用。
3.目前，市场上n-mid骨钙素测定试剂盒以免疫学方法为主，但是现有的检测方法存在一定的缺陷，检测步骤繁琐，操作难度较大，且检测的效率低，精密性不佳，检测的结果受操作的影响，并且价格较高。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法的n-mid骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法，可实现全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低。
5.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
6.一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；
7.所述试剂r1包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖10～50g/l，genapol x-080 1～5g/l，羟乙基纤维素10～30g/l，蛋白保护剂5～30g/l，防腐剂0.5～1.5g/l；
8.所述试剂r2包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖5～10g/l，genapol x-080 0.1～5g/l，n-mid骨钙素单克隆抗体50～100mg/l，乳胶微球颗粒0.5％～3％，蛋白保护剂1～20g/l，防腐剂0.1～5g/l。
9.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或多种。
10.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300中的一种或多种。
11.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中，n-mid骨钙素单克隆抗体为鼠抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、羊抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、兔抗人n-mid骨钙素单克隆抗体中的至少一种。
12.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中，乳胶微球颗粒的粒径为150～400nm；所述乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。
13.作为本发明的优选方式之一，所述包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球的
制备方法为：
14.①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
15.②
加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
16.③
加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
17.④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
18.⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
19.⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w。
20.一种n-mid骨钙素测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
21.(1)配制试剂r1：
22.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
23.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
24.按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、蛋白保护剂、防腐剂进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
25.(3)配制试剂r2：
26.①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
27.②
加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
28.③
加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
29.④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
30.⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
31.⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
32.⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散30～40min，温度：30～37℃，制得试剂r2。
33.一种n-mid骨钙素测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
34.(1)吸取5μl样本，加入60μl试剂r1，37℃孵育3～5min；
35.(2)再加入180μl试剂r2，置于37℃孵育；
36.(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；
37.(4)按照
△
a＝a2-a1来计算吸光度变化值δa，并根据δa计算出样本中n-mid骨钙素含量。
38.本发明基于胶乳增强免疫比浊法测定的n-mid骨钙素试剂盒，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合
后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。可以使用全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，根据吸光度增加量，即可在特定波长处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的n-mid骨钙素含量，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响并且价格上会有很大的优势
39.重要成分功效：
40.海藻糖：海藻糖是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖，对生物活性分子有非特异性保护作用，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在生物活性物质表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质等生物分子结构不被破坏，对酸碱也具有良好的稳定性，使抗原抗体保持天然构象。
41.羟乙基纤维素(hec)：羟乙基纤维素为白色至淡黄色纤维状或粉状固体，无毒、无味、易溶于水，不溶于一般有机溶剂，具有增稠、悬浮、粘合、乳化、分散、保持水分等性能，可制备不同粘度范围的溶液，对电解质具有异常好的盐溶性，在胶乳试剂中作乳胶增稠剂、胶体保护剂具有良好的增敏作用。
42.genapol x-080：相较于应用于生化试剂的传统表面活性剂，genapol x-080作为一种非离子表面活性剂，具有更好的稳定性、抗脂浊性、分散性、低泡性，不会对胶乳的结合反应产生干扰的同时有很强的抗干扰作用。
43.本发明相比现有技术的优点在于：
44.(1)本发明基于胶乳增强免疫比浊法，可实现全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低；
45.(2)本发明在试剂配方中增加海藻糖，可有效保护蛋白质等生物分子结构不被破坏，对酸碱也具有良好的稳定性，使抗原抗体保持天然构象，从而提高试剂的稳定性；
46.(3)本发明在试剂配方中增加羟乙基纤维素，具有有效的增敏作用，进而大大提高试剂的检测灵敏度、重复性；
47.(4)本发明在试剂配方中增加genapol x-080作为表面活性剂，其相对于传统的吐温-20等表面活性剂，genapol x-080具有更好的稳定性、抗脂浊性、分散性、低泡性，不会对胶乳的结合反应产生干扰的同时有很强的抗干扰作用。
具体实施方式
48.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
49.实施例1
50.本实施例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
51.试剂r1包括：tris缓冲液10mmol/l，海藻糖10g/l，genapol x-080 1g/l，羟乙基纤维素10g/l，甘油5g/l，叠氮化钠0.5g/l，ph 7.0。
52.试剂r2包括：tris缓冲液10mmol/l，海藻糖5g/l，genapol x-080 0.1g/l，鼠抗人n-mid骨钙素单克隆抗体50mg/l，150nm乳胶微球颗粒0.5％，甘油1g/l，叠氮化钠0.1g/l，ph 7.0。
53.其中，试剂r2中，乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包
被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。
54.本实施例试剂盒的具体制备方法：
55.(1)配制试剂r1：
56.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1。
57.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
58.按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、甘油、叠氮化钠进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液。
59.(3)配制试剂r2：
60.①
取150nm粒径的胶乳微球加入到偶联缓冲液(10mmol/l hepes缓冲液，ph 7.5)中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15min，温度：30℃；
61.②
加入同体积的活化剂edc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(50mg/l)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10min，温度：30℃；
62.③
加入对应的n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100min，温度：30℃；
63.④
加入封闭液(100g/l bsa)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25h，温度：30℃；
64.⑤
置于高速离心机中10000rpm离心10min，温度：0℃；
65.⑥
加入稀释缓冲液(30mmol/l gly缓冲液)，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3min，功率200w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
66.⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散30min，温度：30℃，制得试剂r2。
67.实施例2
68.本实施例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
69.试剂r1包括：tris缓冲液20mmol/l，海藻糖20g/l，genapol x-080 2g/l，羟乙基纤维素15g/l，酪蛋白10g/l，庆大霉素0.8g/l，ph 7.4。
70.试剂r2包括：tris缓冲液20mmol/l，海藻糖7g/l，genapol x-080 2g/l，羊抗人n-mid骨钙素单克隆抗体60mg/l，200nm乳胶微球颗粒1.5％，酪蛋白5g/l，庆大霉素2g/l，ph 7.4。
71.其中，试剂r2中，乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。
72.本实施例试剂盒的具体制备方法：
73.(1)配制试剂r1：
74.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1。
75.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
76.按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、酪蛋白、庆大霉素进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液。
77.(3)配制试剂r2：
78.①
取200nm粒径的胶乳微球加入到偶联缓冲液(10mmol/l hepes缓冲液，ph 7.5)
中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热20min，温度：35℃；
79.②
加入同体积的活化剂edc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(50mg/l)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应15min，温度：35℃；
80.③
加入对应的n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应110min，温度：35℃；
81.④
加入封闭液(100g/l bsa)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应30h，温度：35℃；
82.⑤
置于高速离心机中12000rpm离心15min，温度：4℃；
83.⑥
加入稀释缓冲液(30mmol/l gly缓冲液)，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散5min，功率220w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
84.⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散33min，温度：35℃，制得试剂r2。
85.实施例3
86.本实施例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
87.试剂r1包括：tris缓冲液30mmol/l，海藻糖30g/l，genapol x-080 5g/l，羟乙基纤维素12g/l，牛血清白蛋白20g/l，proclin300 1.0g/l，ph 7.5。
88.试剂r2包括：tris缓冲液30mmol/l，海藻糖8g/l，genapol x-080 5g/l，鼠抗人n-mid骨钙素单克隆抗体80mg/l，250nm乳胶微球颗粒2％，牛血清白蛋白10g/l，proclin300 2.5g/l，ph 7.5。
89.其中，试剂r2中，乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。
90.本实施例试剂盒的具体制备方法：
91.(1)配制试剂r1：
92.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1。
93.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
94.按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、牛血清白蛋白、proclin300进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液。
95.(3)配制试剂r2：
96.①
取250nm粒径胶乳微球加入到偶联缓冲液(10mmol/l hepes缓冲液，ph7.5)中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热20min，温度：37℃；
97.②
加入同体积的活化剂edc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(50mg/l)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应15min，温度：37℃；
98.③
加入对应的n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应120min，温度：37℃；
99.④
加入封闭液(100g/l bsa)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应30h，温度：37℃；
100.⑤
置于高速离心机中15000rpm离心20min，温度：4℃；
101.⑥
加入稀释缓冲液(30mmol/l gly缓冲液)，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散5min，功率250w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
102.⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲
液中，并置于恒温搅拌器中充分分散35min，温度：37℃，制得试剂r2。
103.实施例4
104.本实施例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
105.试剂r1包括：tris缓冲液100mmol/l，海藻糖50g/l，genapol x-080 5g/l，羟乙基纤维素10～30g/l，小牛血清15g/l，蔗糖15g/l，硫柳汞1.5g/l，ph 8.0。
106.试剂r2包括：tris缓冲液100mmol/l，海藻糖10g/l，genapol x-080 5g/l，兔抗人n-mid骨钙素单克隆抗体100mg/l，400nm乳胶微球颗粒3％，小牛血清10g/l，蔗糖10g/l，硫柳汞5g/l，ph 8.0。
107.其中，试剂r2中，乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。
108.本实施例试剂盒的具体制备方法：
109.(1)配制试剂r1：
110.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1。
111.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
112.按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、小牛血清、蔗糖、硫柳汞进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液。
113.(3)配制试剂r2：
114.①
取400nm粒径胶乳微球加入到偶联缓冲液(10mmol/l hepes缓冲液，ph 7.5)中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热25min，温度：37℃；
115.②
加入同体积的活化剂edc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(50mg/l)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应20min，温度：37℃；
116.③
加入对应的n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应140min，温度：37℃；
117.④
加入封闭液(100g/l bsa)，混匀，并置于恒温搅拌器中反应35h，温度：37℃；
118.⑤
置于高速离心机中20000rpm离心30min，温度：10℃；
119.⑥
加入稀释缓冲液(30mmol/l gly缓冲液)，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散10min，功率300w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
120.⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散40min，温度：37℃，制得试剂r2。
121.实施例5
122.本实施例的一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的n-mid骨钙素测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
123.(1)吸取5μl样本，加入60μl试剂r1，37℃孵育3～5min；
124.(2)再加入180μl试剂r2，置于37℃孵育；
125.(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；
126.(4)按照
△
a＝a2-a1来计算吸光度变化值δa，并将δa代入“吸光度变化值与n-mid骨钙素浓度的线性关系公式”来确定n-mid骨钙素含量。
127.其中，“吸光度变化值与n-mid骨钙素浓度的线性关系公式”通过如下方法获得：
128.(1)校准品缓冲液配方为：
[0129][0130]
用校准品缓冲液稀释纯化好的n-mid骨钙素，配置校准品浓度点依次为：125ng/ml，250ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml。
[0131]
(2)分别向得到的5μl n-mid骨钙素标准品中加入60μl试剂r1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入180μl试剂r2，置于37℃孵育；孵育20s后，采用全自动生化分析仪，570nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2(反应方法为终点法，反应方向为正反应，比色杯光径为1.0cm条件下)；分别计算标准品的吸光度变化值
△
a＝a2-a1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与n-mid骨钙素浓度的线性关系公式。
[0132]
对比例1
[0133]
本对比例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，与实施例3试剂盒基本相同，主要不同之处在于：试剂r1和试剂r2中不添加海藻糖，其它与实施例3相同。
[0134]
对比例2
[0135]
本对比例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，与实施例3试剂盒基本相同，主要不同之处在于：试剂r1和试剂r2中不添加genapol x-080，其它与实施例3相同。
[0136]
对比例3
[0137]
本对比例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，与实施例3试剂盒基本相同，主要不同之处在于：试剂r1和试剂r2中用吐温-20代替其中的genapol x-080，其它与实施例3相同。
[0138]
对比例4
[0139]
本对比例的一种n-mid骨钙素测定试剂盒，与实施例3试剂盒基本相同，主要不同之处在于：试剂r1中不添加羟乙基纤维素，其它与实施例3相同。
[0140]
实施例6
[0141]
本实施例用以评价本发明n-mid骨钙素测定试剂盒的使用效果。
[0142]
一、准确度分析
[0143]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0144]
检测样本：20例n-mid骨钙素浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本和靶值为160ng/ml的质控品。
[0145]
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家n-mid骨钙素检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(包括试剂r1和r2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
[0146]
分别使用本发明试剂盒(以实施例3为例)和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同
时对n-mid骨钙素浓度浓度分布较为均匀的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定，重复3遍，计算均值、cv和偏差。偏差范围在
±
10％以内视为无干扰，偏差范围超过
±
10％视为干扰。结果如表1所示。
[0147]
同时，使用本发明试剂盒(以实施例3为例)和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)对靶值为160ng/ml的质控品样本进行测定。结果如表2所示。
[0148]
表1本发明与对照试剂盒样品检测结果
[0149][0150]
[0151]
表2质控品样本检测结果
[0152][0153]
结果显示：根据表1本发明试剂检测结果，计算出20例样品检查结果平均值为197.18，计算出的相对偏差为0.13％；根据表2本发明、对照试剂检测结果，靶值为160ng/ml的质控品10次测定结果平均值分别为159.904、160.532，计算出的相对偏差分别为-0.06％、0.33％，变异系数分别为1.12％、4.33％；表明本发明检测试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
[0154]
二、灵敏度分析
[0155]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0156]
检测样本：1份纯化水、1份浓度为90ng/ml的n-mid骨钙素抗原低值样本。
[0157]
分别使用本发明试剂盒(以实施例3为例)和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同
时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(sd)；水的吸光度平均值加上2sd作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和90ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2sd)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表3。
[0158]
表3实施例1试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果(单位：ng/ml)
[0159]
[0160][0161]
结果显示：本发明试剂盒检测n-mid骨钙素抗原的灵敏度为7.20ng/ml，对照试剂的灵敏度为19.13ng/ml，表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
[0162]
三、精密度分析
[0163]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0164]
检测样本：2份临床血清样本(90ng/ml)(低值样本)、(410ng/ml)(高值样本)。
[0165]
分别使用本发明试剂盒(以实施例3为例)和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。
[0166]
表4实施例1试剂盒精密度分析结果(单位：ng/ml)
[0167][0168]
结果显示：本发明试剂盒的精密度：cv低值为4.09％、cv高值为1.04％，均小于等于10％；而对照试剂盒cv低值为7.97％、cv高值为6.64％，表明本发明试剂盒比对照试剂盒具有更高的精密度。
[0169]
四、线性分析
[0170]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0171]
检测样本：高n-mid骨钙素抗原血清样本(800ng/ml)。
[0172]
将高n-mid骨钙素抗原血清样本(2000ng/ml)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度，分别为0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml，采用本发明试剂盒(以实施例3为例)对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数r值，检测结果见表5。
[0173]
表5试剂盒线性分析结果
[0174][0175]
结果显示：本发明试剂盒检测结果得到的回归方程为y＝1.0259x-11.618，相关系数r2＝0.9996，表明本发明试剂盒在2000ng/ml范围内具有良好的线性度。
[0176]
实施例7
[0177]
本实施例用以验证海藻糖、genapol x-080、羟乙基纤维素对本发明n-mid骨钙素测定试剂盒性能的影响。
[0178]
一、海藻糖对稳定性的影响
[0179]
对实施例3和对比例1提供的试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例3(添加有海藻糖)和对比例1(不添加海藻糖)提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测低值质控(靶值90ng/ml)、中值质控(靶值200ng/ml)、高值质控(410ng/ml)，并监测质控品测定值的变化。具体检测结果如表6所示。
[0180]
表6试剂热稳定性验证结果
[0181][0182]
由表6可以看出：本发明提供的实施例3试剂在37℃水浴条件下12天内基本无变化，稳定性较好，而对比例1：试剂在37℃水浴条件下12天内较实施例3检测值存在较明显降低。综合来看，r1中添加海藻糖作为稳定剂，可以有效提高测定试剂盒的稳定性。
[0183]
二、genapol x-080对准确度的影响
[0184]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0185]
检测样本：20例n-mid骨钙素浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本和靶值为160ng/ml的质控品。
[0186]
分别使用实施例3和对比例2、3提供的试剂进行照试剂盒灵敏度分析试验。
[0187]
试验方案为：分别使用实施例3(添加genapol x-080作为表面活性剂)、对比例2(不添加任何表面活性剂)、对比例3(添加吐温-20作为表面活性剂)试剂盒同时对n-mid骨钙素浓度浓度分布较为均匀的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定，重复3遍，计算均值、cv和偏差。偏差范围在
±
10％以内视为无干扰，偏差范围超过
±
10％视为干扰。结果如表7所示。
[0188]
同时，使用实施例3(添加genapol x-080作为表面活性剂)、对比例2(不添加任何表面活性剂)、对比例3(添加吐温-20作为表面活性剂)试剂盒对靶值为160ng/ml的质控品样本进行测定。结果如表8所示。
[0189]
表7实施例3与对比例2、3试剂盒样品检测结果
[0190][0191]
[0192]
表8质控品样本检测结果
[0193][0194][0195]
结果显示：表7、表8检测结果表明，genapol x-080的加入可提高检测准确度，且相对传统的吐温-20这类表面活性剂而言，genapol x-080具有更为显著的效果。
[0196]
三、羟乙基纤维素对样本检测结果灵敏度的影响
[0197]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0198]
检测样本：1份纯化水、1份浓度为90ng/ml的n-mid骨钙素抗原低值样本。
[0199]
分别使用实施例3和对比例4提供的试剂进行照试剂盒灵敏度分析试验。
[0200]
试验方案为：分别使用实施例3(添加羟乙基纤维素)、对比例4(不添加羟乙基纤维素)同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(sd)；水
的吸光度平均值加上2sd作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和90ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。检测结果见表9。
[0201]
表9实施例3与对比例4试剂盒灵敏度分析结果(单位：ng/ml)
[0202]
[0203]
[0204][0205]
结果显示：本发明试剂盒检测n-mid骨钙素抗原的灵敏度为6.66ng/ml，对比例4为54.91ng/ml。这表明，羟乙基纤维素对本发明试剂盒的灵敏度提高具有重要影响。
[0206]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖10～50g/l，genapol x-080 1～5g/l，羟乙基纤维素10～30g/l，蛋白保护剂5～30g/l，防腐剂0.5～1.5g/l；所述试剂r2包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖5～10g/l，genapol x-080 0.1～5g/l，n-mid骨钙素单克隆抗体50～100mg/l，乳胶微球颗粒0.5％～3％，蛋白保护剂1～20g/l，防腐剂0.1～5g/l。2.根据权利要求1所述的n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2中的蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r2中，n-mid骨钙素单克隆抗体为鼠抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、羊抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、兔抗人n-mid骨钙素单克隆抗体中的至少一种。5.根据权利要求1所述的n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r2中，乳胶微球颗粒的粒径为150～400nm；所述乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。6.根据权利要求5所述的n-mid骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球的制备方法为：
①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
②
加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
③
加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w。7.一种如权利要求1～6任一所述的n-mid骨钙素测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)配制试剂r1：按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、蛋白保护剂、防腐剂进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；(3)配制试剂r2：
①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
②
加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
③
加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
⑦
将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散30～40min，温度：30～37℃，制得试剂r2。8.一种如权利要求1～6任一所述的n-mid骨钙素测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)吸取5μl样本，加入60μl试剂r1，37℃孵育3～5min；(2)再加入180μl试剂r2，置于37℃孵育；(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；(4)按照
△
a＝a2-a1来计算吸光度变化值δa，并根据δa计算出样本中n-mid骨钙素含量。

技术总结
本发明提供了一种N-MID骨钙素测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括：Tris缓冲液、海藻糖、Genapol X-080、羟乙基纤维素、蛋白保护剂、防腐剂；试剂R2包括：Tris缓冲液、海藻糖、Genapol X-080、N-MID骨钙素单克隆抗体、乳胶微球颗粒、蛋白保护剂、防腐剂。本发明还提供了上述N-MID骨钙素测定试剂盒的制备与检测方法。本发明基于胶乳增强免疫比浊法，可实现全自动生化分析仪检测N-MID骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低。成本低。


技术研发人员：芮双印 侯珂
受保护的技术使用者：安徽大千生物工程有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/21