TRIM65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用

trim65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及trim65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用。


背景技术：

2.目前，心血管疾病死亡率仍居我国城乡居民总死亡原因的首位，农村为46.66％，城市为43.81％，而且处于持续上升阶段。目前推算全国有心血管病患者3.30亿，高于肿瘤及其他疾病；世界卫生组织也预测，到2030年全世界约有2.36亿人将死于心血管相关疾病。心血管疾病已经成为重大的公共卫生问题，是人类健康的头号杀手。
3.动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是一种脂代谢异常驱动的血管慢性炎症性疾病，是心血管疾病发生的重要病理基础。目前临床治疗心血管疾病患者的一线手段依然是利用他汀类降脂药物降低ldl-c(低密度脂蛋白胆固醇)，但是流行病学研究显示，他汀类药物降低ldl-c水平治疗心血管疾病的疗效不到50％。虽然，非他汀类药物如靶向pcsk9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)的sirna药物inclisiran和pcsk9单克隆抗体evolocumab、alirocuma等也在临床治疗中发挥着重要作用，但中国居民心血管死亡率仍居高不下并呈现逐年增加的趋势。因此，探索新的治疗靶点并阐明其影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制将为临床上抗动脉粥样硬化新药物的开发提供理论和实验依据。
4.trim65是trim(tripartite motif-containing protein)家族的重要成员之一，具有e3泛素连接酶的活性。研究发现，tirm65在癌症发生、先天免疫和炎症反应等中发挥重要的调节作用，但其在动脉粥样硬化中的作用目前尚未有研究。因此，在本发明中将利用全身性trim65基因敲除小鼠通过高脂饮食诱导构建动脉粥样硬化模型以探究trim65在动脉粥样硬化中的作用，同时从trim65介导巨噬细胞m1/m2分型调控炎症的角度阐明其在动脉粥样硬化中发挥作用的分子机制。本发明将揭示trim65在心血管疾病中的新功能，为临床上动脉粥样硬化疾病的防治及相关药物研发分子靶标的选择提供新思路和理论依据。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供trim65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：
7.trim65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用。
8.优选地，所述药物作用于trim65基因，防止血清炎症因子tnfa、il-1β和il-6的水平增加，抑制炎症的发生以防治动脉粥样硬化。
9.优选地，所述药物作用于trim65基因，通过调控jak/stat信号通路，抑制巨噬细胞向m1型极化，进而防治动脉粥样硬化。
10.优选地所述药物作用于trim65基因，同时通过调控pi3k-akt/erk1/2/nf-κb信号通路，防止该信号通路介导巨噬细胞向m1型极化，进而防治动脉粥样硬化。
11.与现有技术相比，本发明有益效果包括：
12.1.本发明首次利用全身性trim65敲除小鼠制备的动脉粥样硬化模型，采用多种研究手段系统探究trim65在动脉粥样硬化中的作用；
13.2.本发明提出trim65通过影响炎症反应进程进而改善动脉粥样硬化的分子机制；
14.3.本发明揭示trim65在心血管疾病中的新功能，为临床上动脉粥样硬化的防治和相关药物研发分子靶标的选择提供理论依据和新思路。
附图说明
15.图1为本发明trim65作为靶点在防治动脉粥样硬化中的作用与机制。
16.图2为本发明小鼠主动脉中trim65的表达水平随着动脉粥样硬化发展的变化图。
17.图3为本发明敲除trim65基因对小鼠主动脉和主动脉根部的损伤的影响图。
18.图4为本发明敲除trim65基因对小鼠清炎症因子tnfα、il-1β和il-6的水平的影响图。
19.图5为本发明敲除trim65基因对小鼠巨噬细胞极化的影响图。
20.图6为本发明敲除trim65基因调控jak/stat信号通路的变化图。
21.图7为本发明敲除trim65基因调控pi3k-akt/erk1/2/nf-κb信号通路的变化图。
具体实施方式
22.下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
23.如图1所示，本发明以小鼠为对象建立trim65作为靶点在防治动脉粥样硬化的作用和机制。
24.1.trim65在动脉粥样硬化进展中的表达变化分析：
25.全身性apoe基因敲除(apoe-/-)小鼠分别喂食高脂食物0、8、16周，分离小鼠主动脉，采用western blot和qrt-pcr方法检测主动脉中trim65的表达变化情况。
26.由图2可以看出，高脂饮食诱导apoe-/-小鼠后，随着动脉粥样硬化的发展，小鼠主动脉中trim65的蛋白和mrna表达水平均下降，提示trim65可能在动脉粥样硬化中发挥作用。
27.2.trim65基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的制备及其表型分析：
28.全身性trim65基因敲除(trim65-/-)小鼠与apoe-/-小鼠杂交得到apoe和trim65双基因敲除小鼠(apoe-/-trim65-/-，即为本实施例的实验鼠)。采用8周大的apoe-/-小鼠(对照组)和apoe-/-trim65-/-小鼠(实验组)喂食高脂食物13周后，分离小鼠主动脉和主动脉根部，通过油红o染色和h&e染色检测主动脉的损伤情况，通过天狼星红染色检测斑块稳定性；同时分离小鼠血清检测炎症因子以及分离腹腔巨噬细胞和骨髓衍生的巨噬细胞。
29.由图3a-d可以看出，与对照组小鼠相比，敲除trim65基因明显增加高脂饮食诱导的小鼠全主动脉和主动脉根部的损伤；由图3e-h可以看出，与对照组小鼠相比，敲除trim65基因明显降低了斑块的稳定性。该结果表明trim65缺失促进动脉粥样硬化发展同时降低斑块稳定性。
30.3.敲除trim65基因促进动脉粥样硬化发展的机制研究：
31.动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，因此我们首先检测了trim65敲除对炎症的
影响。通过elisa技术检测两组小鼠血清中炎症因子(tnfα、il-1β、il-6)的含量，如图4所示，敲除trim65基因明显增加高脂饮食诱导的小鼠血清炎症因子tnfα、il-1β和il-6的水平；巨噬细胞极化在调控炎症方面发挥重要作用，研究表明m1型会促进炎症的发生而m2型具有抗炎的作用，因此我们通过qrt-pcr技术进一步检测了两组小鼠分离的腹腔巨噬细胞中m1型标志物(tnfα、il-1β和il-6)和m2型标志物(il-10、cd206和arg-1)的表达水平；如图5所示，敲除trim65基因明显促进巨噬细胞向m1型极化。
32.进一步为了探究trim65敲除调控巨噬细胞m1型极化的分子机制，我们分别从动物水平和细胞水平上检测了敲除trim65基因对调控巨噬细胞m1/m2型极化的相关信号通路(jak/stat和pi3k-akt/mapk/nf-κb)的影响。如图6所示，敲除trim65基因可以激活jak1/stat1信号通路，介导巨噬细胞向m1型极化，同时抑制jak2/stat6信号通路减少巨噬细胞向m2型极化，从而促进炎症的发生进而加剧动脉粥样硬化的发展；如图7所示，敲除trim65基因还可以调控pi3k-akt/erk1/2/nf-κb信号通路促进巨噬细胞向m1型极化从而促进炎症的发生进而加剧动脉粥样硬化的发展
33.综合本发明各个研究机制以及实验分析，表明trim65可作为动脉粥样硬化的治疗靶点。
34.以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.trim65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物作用于trim65基因，防止血清炎症因子tnfα、il-1β和il-6的水平增加。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物防止血清炎症因子增加，以防治动脉粥样硬化。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物作用于trim65基因，通过调控jak/stat信号通路，防治动脉粥样硬化。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物抑制jak1/stat1信号通路介导抑制巨噬细胞向m1型极化、激活jak2/stat6信号通路增加巨噬细胞向m2型极化。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物作用于trim65基因，通过调控pi3k-akt/erk1/2/nf-κb信号通路防治动脉粥样硬化。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物调控pi3k/akt/erk1/2/nf-κb信号通路抑制巨噬细胞向m1型极化。

技术总结
本发明公开了TRIM65作为靶点在筛选用于防治动脉粥样硬化药物中的应用。所述药物作用于TRIM65基因，通过防止血清炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6的水平增加、调控JAK/STAT信号通路、PI3K-AKT/ERK1/2/NF-κB信号通路进而防治动脉粥样硬化。本发明首次利用敲除TRIM65的动脉粥样硬化模型小鼠探究TRIM65在动脉粥样硬化发生发展中的作用；提出TRIM65敲除通过调控JAK/STAT和PI3K-AKT/ERK1/2/NF-κB信号通路促进巨噬细胞M1型极化，从而增加炎症并加剧动脉粥样硬化发展的分子机制；首次揭示其在血管疾病中的新作用，提出其有望成为防治动脉粥样硬化的有效靶点，为动脉粥样硬化相关药物的开发提供理论依据和新思路。发提供理论依据和新思路。发提供理论依据和新思路。


技术研发人员：姜玫秀 辛洪波 曾旭芳 毕洪峰 姜玫玲 王丹 陈茵妮
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/7/21