一种PfuDNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用与流程

一种pfu dna聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物抗体开发领域，具体涉及一种pfu dna聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.链式聚合反应(polymerase chainreaction，pcr)是分子生物学研究最基本的工具，在dna酶的催化下，以母链dna为模板，以引物为起点通过变性、退火和延伸等循环步骤，在体外对dna分子进行扩增，从而实现dna的复制。
3.pfu dna聚合酶是从激烈火球菌(pyrococcus furiosus,pfu)分离出的dna聚合酶，被广泛应用于pcr，由于其高保真性和稳定性广受科研人员的青睐。但是通常和大多数dna聚合酶一样，面临着如下问题：在低温条件下，酶仍然具有一定聚合活性，从而产生非特异性扩增或者引物二聚体。
4.热启动pcr技术是解决该问题的方法之一，通过基因工程对酶进行突变或者改造，或者使用配体抑制dna聚合酶在低温条件下的聚合活性，又或对引物进行修饰，从而达到热启动控制pcr反应的目的。通过基因工程改造聚合酶通常是比较困难的，而修饰引物的成本比较高。传统抗体尽管在低温条件下能抑制聚合酶的活性，降低反应的非特异性扩增，但由于其体积相对较大，在加入到反应体系中后，也可能会影响酶的长期稳定性，导致整体的扩增能力下降。纳米抗体是骆驼科动物血清中重链抗体的抗原结合域，由于其体积小，亲和力高，常被用作传统抗体的替代品。因此需要开发一种新型纳米抗体封闭系统，最大程度降低pfu dna聚合酶非特异性扩增的同时，还能保证聚合酶长期热稳定性。


技术实现要素：

5.为克服上述缺陷，本发明目的在于提供一种pfu dna聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种pfu dna聚合酶的纳米抗体，所述纳米抗体与pfu dna聚合酶特异性结合以封闭所述pfu dna聚合酶的活性，所述纳米抗体命名为nb-pf1，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。
8.进一步的，所述纳米抗体包括cdr1、cdr2和cdr3，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.3所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.4所示。
9.进一步的，所述纳米抗体还包括fr1、fr2、fr3和fr4，所述纳米抗体的fr1的氨基酸序列如seq id no.5所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.6所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.7所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.8所示。
10.进一步的，所述纳米抗体与pfu dna聚合酶的平衡解离常数kd为(5.9
±
2.4)
×
10
‑8。
11.本发明提供一种如上述的pfu dna聚合酶的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)动物免疫：用pfu dna聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫，采集多次免疫后的羊驼的外周血；
13.(2)提取(1)中采集的外周血的mrna，并进行反转录，得到cdna文库，再利用巢式pcr技术扩增得到抗体基因序列；
14.(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收，然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上，将所述载体进行转化，之后涂平板，得到质粒文库；
15.(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中，经过诱导之后离心，得上清液，elisa检测上清液，采用类似限制稀释法，逐步稀释富集，筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。
16.进一步的，其特征在于，在所述步骤(4)之后还包括步骤(5)：使用itc技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述pfu dna聚合酶的亲和力。
17.进一步的，在所述步骤(5)之后还包括步骤(6)：采用毛细管电泳验证所述纳米抗体对pfu dna聚合酶活性的封闭作用。
18.进一步的，所述步骤(2)中利用巢式pcr技术扩增中所使用的引物对为call001和call002、vhh-ecori-for和vhh-hindiii-rev，所述call001的序列组成为gtcctggctgctcttctacaagg(seq id no.9)，所述call002的序列组成为ggtacgtgctgttgaact-gttcc(seq id no.10)，所述vhh-ecori-for的序列组成为cttgaattccatcaccatcaccatcacsaggtg-cagctggtggagtctgg rggag(seq id no.11)，所述vhh-hindiii-rev的序列组成为gggaagcttttagct-ggagacggtgacctgggt(seq id no.12)。
19.本发明还提供一种如上述的pfu dna聚合酶的纳米抗体在降低pcr非特异性扩增中的用途。
20.进一步的，所述纳米抗体降低pcr非特异性扩增是通过与所述pfu dna聚合酶结合、在低温下抑制所述pfu dna聚合酶的聚合活性而实现的。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22.本发明提供一种pfu dna聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用，纳米抗体与pfu dna聚合酶有较高的亲和力，并且能够在低温下有效抑制pfu dna聚合酶的聚合活性，从而降低pcr技术中在低温条件下产生非特异性扩增或者引物二聚体等问题并同时能够保证其热稳定性，为pfu dna酶热启动技术提供了新的途径。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为实施例1中免疫羊驼的血清效价检测结果图；
25.图2为实施例3中纳米抗体nb-pf1和pfu dna聚合酶的亲和力数据；
26.图3为实施例4中在30℃和40℃下的实验组的毛细管电泳测定结果；
27.图4为实施例4中95℃热激后分别在30℃和40℃下的实验组的毛细管电泳测定结果；
28.图5为实施例4中在30℃和40℃下的对照组的毛细管电泳测定结果。
具体实施方式
29.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
30.本发明实施例提供一种pfu dna聚合酶的纳米抗体，所述纳米抗体与pfu dna聚合酶特异性结合以封闭所述pfu dna聚合酶的活性，所述纳米抗体命名为nb-pf1，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。
31.seq id no.1的序列组成为：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs syvmswyraqpgkerelvavitsaggstnyadsvkgrisftrdnakntvyl qmnslkpedtavyycnavyysgsyyspsrpyeydywgqgtqvtvss。
32.具体的，所述置换为保守置换。
33.具体的，所述纳米抗体包括cdr1、cdr2和cdr3，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列如seq id no.2(序列组成为：evqlvesggglvqpggslrlscaas)所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.3(序列组成为：mswyraqpgkerelvav)所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.4(序列组成为：nyadsvkgrisftrdnakntvylqmnslkpedtavyyc)所示。
34.其中，cdr1、cdr2和cdr3为3个互补决定区(complementarity determining region，cdr)，是抗体识别及结合抗原的部位，决定抗体的特异性。
35.具体的，所述纳米抗体还包括fr1、fr2、fr3和fr4，所述纳米抗体的fr1的氨基酸序列如seq id no.5(序列组成为：wgqgtqvtvss)所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.6(序列组成为：gftfssyv)所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.7(序列组成为：itsaggst)所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.8(序列组成为：navyysgsyyspsrpyeydy)所示。
36.其中，在v区(可变区)中，cdr之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(frameworkregion，fr)。vh或vl各有四个骨架区，分别用fr1、fr2、fr3和fr4表示。
37.具体的，所述纳米抗体与pfu dna聚合酶的平衡解离常数kd为(5.9
±
2.4)
×
10-8
。
38.其中，亲和力(affinity ofantibodies)系指单个分子与其配体结合的强度。kd是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即抗原解离的速率k
off
与抗体与抗原缔合的速率k
on
之间的比值。kd与亲和力成反比。kd值与抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)有关，因此kd值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。
39.本发明实施例提供一种如上述的pfu dna聚合酶的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
40.(1)动物免疫：用pfu dna聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫，采集多次免疫后的羊驼的外周血；
41.(2)提取(1)中采集的外周血的mrna，并进行反转录，得到cdna文库，再利用巢式pcr技术扩增得到抗体基因序列；
42.(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收，然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上，将所述载体进行转化，之后涂平板，得到质粒文库；
43.(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中，经过诱导之后离心，得上清液，elisa检测上清液，采用类似限制稀释法，逐步稀释富集，筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。
44.具体的，在所述步骤(4)之后还包括步骤(5)：使用itc技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述pfu dna聚合酶的亲和力。
45.其中，等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，itc)近年来迅速发展并广泛应用于分子生物学及其相关领域的研究分子相互作用的生物物理技术，它是在恒定温度下唯一能够直接测量复合物形成过程中的热量变化的方法。它可以简单地通过测量两个溶液相互作用时吸收或放出的热量来提供分子相互作用的重要信息，如结合常数、结合位点数、自由能、焓和熵。
46.具体的，在所述步骤(5)之后还包括步骤(6)：采用毛细管电泳验证所述纳米抗体对pfu dna聚合酶活性的封闭作用。
47.具体的，所述步骤(2)中利用巢式pcr技术扩增中所使用的引物对为call001和call002、vhh-ecori-for和vhh-hindiii-rev，所述call001的序列组成为gtcctggctgctcttctacaagg(seq id no.9)，所述call002的序列组成为ggtacgtgctgttgaact-gttcc(seq id no.10)，所述vhh-ecori-for的序列组成为cttgaattccatcaccatcaccatcacsaggtg-cagctggtggagtctgg rggag(seq id no.11)，所述vhh-hindiii-rev的序列组成为gggaagcttttagct-ggagacggtgacctgggt(seq id no.12)。
48.本发明实施例还提供一种如上述的pfu dna聚合酶的纳米抗体在降低pcr非特异性扩增中的用途。
49.具体的，所述纳米抗体降低pcr非特异性扩增是通过与所述pfu dna聚合酶结合、在低温下抑制所述pfu dna聚合酶的聚合活性而实现的。
50.以下结合具体实施例说明：
51.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本技术中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。
52.实施例1 pfu dna聚合酶的羊驼免疫
53.用4mgpfu dna聚合酶对一只3岁的雌性羊驼进行免疫，在羊驼的颈下靠近淋巴结附近位置，进行多点皮下注射，每次免疫之前，收集3ml血液用于效价检测，首次免疫将1mg抗原稀释到150ul pbs缓冲液中，并与等体积的gerbu佐剂进行乳化，之后每隔一周将0.5mg抗原进行乳化注射，总共免疫7次。测定的血清效价如图1所示，在经过约104稀释之后，仍能检测出部分信号，说明免疫良好。在最后一次免疫后的第3天，采集外周血50ml，用于构建纳米抗体免疫文库。
54.实施例2 pfu dna聚合酶的纳米抗体的制备和筛选
55.将实施例1新鲜采集的外周血，先经过leukolock
tm
total rna isolation kit
(thermo fisher)从10ml血液中的淋巴细胞提取总mrna。经过transscriptr-unione-step gdna removal and cdna synthesis supermix(北京全式金生物)反转录得到cdna文库之后，再利用巢式pcr技术先后经过call001(seq id no.9：gtcctggctgctcttctacaagg)、call002(seq id no.10：ggtacgtgctgttgaact-gttcc)和vhh-ecori-for(seq id no.11：cttgaattccatcaccatcaccatcacsaggtg-cagctggtggagtctg grggag)、vhh-hindiii-rev(seq id no.12：gggaagcttttagct-ggagacggtgacctgggt)扩增得到多样化抗体基因序列(包括vhh基因片段)，反应体系及条件如下表1和表2：
56.表1 pcr反应体系
57.组分体积模板50ng正向引物(10um)2μl反向引物(10um)2μl2xfashifipcrsupermix25μl去核酸酶超纯水补齐至50μl总体积50μl
58.表2 pcr反应条件
[0059][0060]
先后经过两次凝胶回收得到700bp和400bp的片段。经过限制性内切酶ecori和hindⅲ双酶切，酶切反应体系如下表3：
[0061]
表3酶切反应体系
[0062][0063][0064]
之后用t4连接酶连接，将vhh融合到修饰改造的pet-22b(+)载体(噬菌体载体)上，
位于pelb信号肽和his(6x)的c端。连接反应体系如下表4：
[0065]
表4 t4 dna连接酶连接反应体系
[0066]
成分体积vhh片段100ngpet22b质粒25ng10xt4dnaligasereaction缓冲液2μlt4dnaligase1μlddh2o补齐至20μl总体积20μl
[0067]
取约10ng的质粒文库进行转化(转化至tg1感受态细胞(电转))，涂平板(含有氨苄抗性的lb培养板)。然后随机挑选10～20个克隆测序，将测序结果中纳米抗体片段翻译成氨基酸序列后进行序列比对，检测细菌文库中序列多样性。最终得到多样性》107/ug的质粒文库(噬菌体库)。
[0068]
将质粒文库(噬菌体库)转化至t7菌株(表达菌株如bl21)中，接种方式为96孔板中每孔接种1000个克隆，经过iptg诱导(诱导蛋白表达)之后离心，elisa检测上清，采用类似限制稀释法，逐步稀释富集，具体操作为：将阳性克隆孔放大培养，挑取10000个克隆，平均分配到新的96孔板中，每孔接种约100个克隆，经过iptg诱导(诱导蛋白表达)之后离心，elisa检测上清，将阳性克隆孔放大培养，挑取1000个克隆，平均分配到新的96孔板中，每孔接种约10个克隆，经过iptg诱导(诱导蛋白表达)之后离心，elisa检测上清，将阳性克隆孔放大培养，挑取100个克隆，平均分配到新的96孔板中，每孔接种约1个克隆，从而筛选出阳性纳米抗体单克隆以及阳性纳米抗体单克隆表达的nb-pf1。
[0069]
实施例3 pfu dna聚合酶与纳米抗体的亲和力的测定
[0070]
将实施例2筛选出的与pfu dna聚合酶特异性结合的纳米抗体nb-pf1和pfu dna聚合酶置于hepes缓冲液(包括25mm hepes和150mm nacl，ph为8.0)中透析过夜，调节各个蛋白的浓度到合适大小。使用microcal itc200微量量热仪器(ge healthcare)进行itc实验，反应池中含有10～100μm的抗原或抗体，注射器中含有约10倍浓度的对应的抗原或抗体，搅拌速率为750rpm，温度为25℃，使用affinimeter itc软件进行数据拟合，得到亲和力数据，结果见图2，从图2可看出，纳米抗体nb-pf1与pfu dna聚合酶的平衡解离常数kd为(5.9
±
2.4)
×
10-8
。
[0071]
实施例4纳米抗体封闭pfu dna聚合酶的聚合活性的测定
[0072]
毛细管电泳验证纳米抗体nb-pf1对pfu dna聚合酶活性的封闭作用。用1upfu dna聚合酶进行单链dna扩增实验。实验组加入1μm的pfu dna聚合酶单克隆纳米抗体，分别在30℃、40℃(图3)以及95℃热激后在30℃和40℃(图4)下重复进行实验，对照组(图5)加入1μm非特异性纳米抗体，分别在在30℃和40℃下重复进行实验，所得产物进行毛细管电泳。图3显示主要产物出峰在50bp，pfu聚合酶没有引起dna片段的延伸，而图5和图4显示在超过50bp的位置有多个位置出峰，表明pfu聚合酶具有延伸dna片段的活性，这说明纳米抗体nb-pf1在低温下对pfu dna聚合酶活性具有封闭作用。
[0073]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种pfudna聚合酶的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体与pfudna聚合酶特异性结合以封闭所述pfudna聚合酶的活性，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。2.如权利要求1所述的pfudna聚合酶的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括cdr1、cdr2和cdr3，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.3所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.4所示。3.如权利要求1所述的pfudna聚合酶的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括fr1、fr2、fr3和fr4，所述纳米抗体的fr1的氨基酸序列如seq id no.5所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.6所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.7所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.8所示。4.如权利要求1所述的pfudna聚合酶的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体与pfudna聚合酶的平衡解离常数k
d
为(5.9
±
2.4)
×
10-8
。5.一种如权利要求1-4任一所述的pfudna聚合酶的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)动物免疫：用pfudna聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫，采集多次免疫后的羊驼的外周血；(2)提取(1)中采集的外周血的mrna，并进行反转录，得到cdna文库，再利用巢式pcr技术扩增得到抗体基因序列；(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收，然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上，将所述载体进行转化，之后涂平板，得到质粒文库；(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中，经过诱导之后离心，得上清液，elisa检测上清液，逐步稀释富集，筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤(5)：使用itc技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述pfudna聚合酶的亲和力。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)之后还包括步骤(6)：采用毛细管电泳pcr验证所述纳米抗体对pfudna聚合酶活性的封闭作用。8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中利用巢式pcr技术扩增中所使用的引物对为call001和call002、vhh-ecori-for和vhh-hindiii-rev，所述call001的序列组成为gtcctggctgctcttctacaagg，所述call002的序列组成为ggtacgtgctgttgaact-gttcc，所述vhh-ecori-for的序列组成为cttgaattccatcaccatcaccatcacsaggtg-cagctggtggagtctg grggag，所述vhh-hindiii-rev的序列组成为gggaagcttttagct-ggagacggtgacctgggt。9.如权利要求1-4任一所述的pfudna聚合酶的纳米抗体在降低pcr非特异性扩增中的用途。10.如权利要求9的用途，其特征在于，所述纳米抗体降低pcr非特异性扩增是通过与所述pfudna聚合酶结合、在低温下抑制所述pfudna聚合酶的聚合活性而实现的。

技术总结
本发明公开了一种PfuDNA聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用，所述纳米抗体与PfuDNA聚合酶特异性结合以封闭所述PfuDNA聚合酶的活性。本发明公开的纳米抗体与PfuDNA聚合酶有较高的亲和力，并且能够在低温下有效抑制PfuDNA聚合酶的聚合活性，从而降低PCR技术中在低温条件下产生非特异性扩增或者引物二聚体等问题并同时能够保证其热稳定性，为Pfu DNA酶热启动技术提供了新的途径。DNA酶热启动技术提供了新的途径。DNA酶热启动技术提供了新的途径。


技术研发人员：赵小玲 刘景文 刘子明
受保护的技术使用者：亲和（武汉）生命科技有限责任公司
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/7/21