一种中性巴楚蘑菇多糖及其制备方法与应用

1.本发明属于天然多糖制备技术领域，具体涉及一种中性巴楚蘑菇多糖及其制备方法与应用。


背景技术：

2.食用真菌多糖由于其多种生物活性而倍受关注。诸多研究阐明，食用真菌多糖具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化剂、抗炎、降血糖、降血脂、保肝、免疫调节等作用。巴楚蘑菇主要生长在塔里木盆地北缘自然胡杨林中，是药食兼用的大型野生真菌。从系统分类的角度上来看，巴楚蘑菇属于马鞍菌属(heivella)真菌，被称为白柄马鞍菌(helvella leucopus)。从外形上来看，巴楚蘑菇表面呈黑色，有较多绒毛和马鞍状裂片，菌柄中空并且大多为乳白色，菌盖直径约3.0～6.0cm，菌柄直径约1.0～3.0cm，菌柄高2.0～7.0cm。由于其主要生长于天然胡杨林区，如莎车县、巴楚县等，尤其多产于巴楚县，因此也被称为巴楚蘑菇，其子实体香味浓郁、美味鲜美、口感独特，其营养价值远远高于同盘羊肚菌。目前国内外有关巴楚蘑菇的报道主要集中在探讨巴楚蘑菇的基本成分及营养价值，巴楚蘑菇生物学特性与生态环境条件之间的关系等方面，而有关巴楚蘑菇含有的特定的活性物质的生物活性以及相关机制研究寥寥无几，尤其是在巴楚蘑菇均一多糖的体内外抗炎活性及对肠道菌群组成的影响方面的研究仍然处于空白状态。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供一种中性巴楚蘑菇多糖及其制备方法与应用。通过进行提取、纯化以及结构表征对巴楚蘑菇多糖进行分析鉴定，并研究了均一多糖改善和缓解溃疡性结肠炎小鼠临床特征相关抗炎活性，以及其对肠道菌群丰度与组成的影响。本发明的技术方案为：
4.第一个方面，本发明提供一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
5.s1、将干燥巴楚蘑菇粉碎过40目筛后于沸水中提取一段时间，过滤，滤液于50～60℃浓缩至原体积的1/4，得到一次浓缩液；
6.s2、将一次浓缩液除去游离蛋白质，进一步浓缩至原体积的1/3，得到二次浓缩液，二次浓缩液中加入其2～4倍体积的无水乙醇混合均匀；
7.s3、于50～60℃蒸除乙醇，浓缩物真空冷冻干燥，得到巴楚蘑菇粗多糖；
8.s4、采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化；
9.s4、再将离子交换色谱法纯化后的产品用蒸馏水在纤维素膜(5kda)中透析，收集产率最高的洗脱峰组分并浓缩、冻干，得到精制多糖；
10.s5、将精制多糖通过凝胶纯化法进一步纯化，收集单一对称峰为中性巴楚蘑菇多糖p-hlp。
11.进一步地，所述步骤s1中干燥巴楚蘑菇与沸水的重量体积比为1：(15～20)。
12.进一步地，所述步骤s2中将一次浓缩液除去游离蛋白质采用的试剂为体积比4:1
的二氯甲烷与正丁醇混合液。
13.优选地，所述步骤s4中采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化是采用deae-cellulose fast flow凝胶柱。
14.进一步地，采用deae-cellulose fast flow凝胶柱进行纯化的过程包括：将巴楚蘑菇粗多糖溶于去离子水中，配制成1～2mg/ml的溶液，装样至deae-cellulose fast flow凝胶柱中；随后依次以超纯水和浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.5moi/l的nacl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，洗脱流速设定为1～2ml/min，收集洗脱液。
15.第二个方面，本发明提供一种中性巴楚蘑菇多糖，是采用上述制备方法获得。
16.进一步地，所述中性巴楚蘑菇多糖的数均分子量为39.14
×
108；单糖组成包括：甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸和阿拉伯糖，前述几种多糖的摩尔比率为43.68:38.16:9.34:4.35:0.88:0.84:0.79:0.74:0.72:0.50；多糖组成包括：t-d-glc、t-d-rha、t-d-man、t-d-gal、1,4-glcp、1,2-manp、1,6-manp、1,3,6-manp、1,4,6-galp、1,6-glcp和1,3-glcp，其相对摩尔比分别为8.48：6.05：5.50：0.70：31.60:28.71:8.22:4.29:2.74:2.15:1.58。
17.第三个方面，本发明提供上述中性巴楚蘑菇多糖在制备抗炎药物上的应用。
18.进一步地，所述抗炎药物包括炎性肠病药物以及结肠炎药物。
19.第四个方面，本发明提供上述中性巴楚蘑菇多糖在制备饲料添加剂上的应用。
20.第五个方面，本发明提供一种动物饲料，包括上述的饲料添加剂。
21.本发明的有益效果为：本发明的巴楚蘑菇多糖p-hlp是一种新型多糖，至今还未报到提取出这种结构特征的巴楚蘑菇多糖。动物实验表明，巴楚蘑菇多糖p-hlp对dss诱导的炎症性肠病小鼠炎症指标具有显著调节和干预效应。不同剂量巴楚蘑菇多糖p-hlp通过调节炎症相关细胞因子和酶而调节宿主免疫。此外，本发明还研究了不同剂量p-hlp对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有很好的缓解或改善作用，能回调溃疡性结肠炎小鼠体重、降低dai指数、缓解病理组织损伤、抑制结肠粘膜促炎症因子和介质的表达、促进抗炎细胞因子的表达，尤其是高剂量p-hlp效果明显而独特。因此，该中性巴楚蘑菇多糖可开发为临床上治疗炎性肠病以及结肠炎相关疾病的疗效确切、毒副作用低的药物，还有望通过饲料添加剂而应用于动物饲料中。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中巴楚蘑菇均一多糖洗脱图。
23.图2为本发明实施例2中不同种类的标准单糖与获得的p-hlp的离子色谱对比图，其中图a为标准品单糖离子色谱图(1-fuc，2-rha，3-ara，4-gal，5-glc，6-xyl，7-man，8-fru，9-rib，10-gal-ua，11-gul-ua，12-glc-ua，13-man-ua，*-溶剂峰)。图b为p-hlp离子色谱图。
24.图3为本发明实施例2中巴楚蘑菇均一多糖绝对分子量分析图。
25.图4为本发明实施例2中p-hlp的分子构型图。
26.图5为本发明实施例3中采用p-hlp干预对dss诱导的uc小鼠体重的影响结果图，其中图a为小鼠平均体重；图b为体重变化率；图c为平均体重损失。#与nc组相比，p《0.05；##与nc组相比，p《0.01；；*与dss组相比，p《0.05，**与dss组相比，p《0.01。
27.图6为本发明实施例3中p-hlp改善uc小鼠结肠长度的缩短情况，其中a图为各组小鼠结肠长度对比图；b图为各组小鼠结肠平均长度。数值以平均值
±
sd表示(n＝5)。###表示与nc相比，p《0.001；*表示与dss组比，p《0.05，**表示与dss组比，p《0.01；***表示与dss组比，p《0.001。
28.图7为本发明实施例3中p-hlp对uc小鼠脾脏指数的影响情况。
29.图8为本发明实施例3中采用p-hlp改善uc小鼠病理组织学评分结果图，其中图a为nc组的结肠组织病理学图片，图b为dss组的结肠组织病理学图片，图c为dss+p-hlp(l)组的结肠组织病理学图片，图d为dss+p-hlp(h)组的结肠组织病理学图片，图e为空白+p-hlp组的结肠组织病理学图片，图f为统计病理学评分。图片中，黑色箭头表示炎症细胞浸润对结肠组织肌层的严重损害，灰色箭头表示炎症细胞浸润；浅灰色箭头表示水肿；灰棕色箭头表示溃疡缩小，表面粘膜上皮增多。
30.图9为本发明实施例3中p-hlp对结肠组织中炎症细胞因子mrna表达水平的影响情况。不同剂量p-hlp灌胃降低了dss诱导增加的促炎细胞因子(il-1β，il-6和tnf-α)mrna表达水平。同时，增加了抗炎细胞因子(il-10)的含量。其中，高剂量p-hlp(50mg/kg)调节炎症相关细胞因子mrna表达水平至正常水平，并具有极显著差异(p《0.01)。此外，dss处理升高了促炎介质(inos和cox-2)mrna的表达水平，不同剂量p-hlp组(10和50mg/kg)结肠组织中inos和cox-2mrna水平降低，并均有极显著差异(p《0.01)。空白+p-hlp组(100mg/kg)炎症相关细胞因子和介质mrna表达水平与nc组水平一致。
具体实施方式
31.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
32.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
33.实施例1
34.本实施例提供一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
35.s1、将干燥巴楚蘑菇粉碎过40目筛后于沸水中提取一段时间，干燥巴楚蘑菇与沸水的重量体积比为1：15，过滤，滤液于50～60℃浓缩至原体积的1/4，得到一次浓缩液。
36.s2、将一次浓缩液除去游离蛋白质，采用的试剂为体积比4:1的二氯甲烷与正丁醇混合液，进一步浓缩至原体积的1/3，得到二次浓缩液，二次浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇混合均匀。
37.s3、于50～60℃蒸除乙醇，浓缩物真空冷冻干燥，得到巴楚蘑菇粗多糖。
38.s4、采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化；具体是采用deae-cellulose fast flow凝胶柱，纯化过程包括：将巴楚蘑菇粗多糖溶于去离子水中，配制成1～2mg/ml的溶液，装样至deae-cellulose fast flow凝胶柱中；随后依次以超纯水和浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.5moi/l的nacl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，洗脱流速设定为1～2ml/min，收集洗脱液。
39.s4、用蒸馏水在纤维素膜(5kda)中透析48h，收集产率最高的洗脱峰组分并浓缩、
冻干，得到精制多糖。
40.s5、将精制多糖通过gpc-autopurify全自动凝胶纯化系统进行进一步纯化，并结合示差检测器(ri-502shodex)在线检测收集，收集单一对称峰为中性巴楚蘑菇多糖p-hlp，结果如图1所示。
41.实施例2
42.本实施例提供一种中性巴楚蘑菇均一多糖的鉴定方法，包括以下步骤：
43.s1、巴楚蘑菇均一多糖单糖的组成测定
44.(1)标准品配制：取干净的15ml ep管，加入8ml无菌水，依次加入岩藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖各100mg，溶解后用容量瓶定容至10ml，配制成10mg/ml的标准液母液。将上述混标母溶液先稀释100倍，制备成100μg/ml工作液，将取上述溶液按照以下梯度稀释，装入1.5ml的ep管中。标准品与单糖混标梯度浓度信息见表1-1，1-2。
45.表1-1标准品信息
46.tab.1-1 standard information
[0047][0048]
表1-2单糖混标梯度浓度信息(μg/ml)
[0049]
tab.1-2 gradient concentration information of mixed standard
[0050][0051]
(2)样本提取：取干净的色谱瓶，精确称量5mg(
±
0.05mg)纯化的均一多糖样品，将其加入到烧瓶中并缓慢加入适量tfa进行酸溶，将混匀的溶液放在121℃的条件下处理2小时。再使用氮气将剩余固体吹干。缓慢加入适量的甲醇，然后再次吹干，重复这一操作2-3次。再向烧瓶中加入无菌水，使样品溶解，即可转移至色谱瓶中，进行后续的检测。
[0052]
(4)单糖组分的色谱定性：主要是先通过分析柱分离不同的化合物，再利用电化学检测器进行检测，随后通过出峰时间确定目标化合物。
[0053]
(5)单糖组分的色谱定量：主要是利用不同浓度的标准品，横坐标、纵坐标分别为标准品浓度、标准品峰面积，绘制曲线图，已获得靶向化合物与其峰面积的数学关系(线性、二次方程、对数等)，进而根据未知样品中相应化合物的峰面积计算其浓度。
[0054]
(6)单糖组分标准曲线的绘制：采用外标法定量，通过配制不同浓度标样来制定标准曲线。保留时间对应单糖标准曲线，从而可确定多糖的单糖组成。根据各导数的峰面积计算出不同单糖的摩尔量。
[0055]
通过比较单糖标准品气相色谱图和p-hlp气相色谱图，推断p-hlp由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸和阿拉伯糖组成，摩尔比率为43.68:38.16:9.34:4.35:0.88:0.84:0.79:0.74:0.72:0.50(图2)。结果表明，甘露糖、葡萄糖和鼠李糖是p-hlp的骨干单糖组分，占总单糖含量的91.18％。
[0056]
s2、巴楚蘑菇均一多糖分子量的测定
[0057]
(1)样品的提取：精确称量纯化的多糖样品5mg(
±
0.05mg)，加入1ml90％的dmso溶解样品，于100℃水浴孵育过夜。加入3ml无水乙醇，充分混匀。1000
×
g离心5min，取上清。剩余的沉淀物用无水乙醇冲洗两次，加入3ml 0.1m nano3(含0.02％ nan3221341)，在121℃孵育20分钟。12000
×
g离心10min，收集上清液，过0.45um滤膜，准备上机。
[0058]
巴楚蘑菇均一多糖绝对分子量分析如图3所示，经计算，p-hlp的mw、mn和mz分别为39.14
×
108da、18.95
×
108da和93.84
×
108da。
[0059]
此外，图4提供了p-hlp分子构型图，图中p-hlp斜率为0.18
±
0.00，说明p-hlp构型接近于球状。
[0060]
s3、巴楚蘑菇均一多糖甲基化分析
[0061]
(1)糖醛酸的还原：称取纯化的多糖样品(5
±
0.05毫克)在1.0毫升蒸馏水稀释，加入1ml碳二亚胺(100mg/ml)，在室温下孵化2h。加入1ml 2m的咪唑在冰上反应30min，将反应混合物平均分为两份，第一份加入1ml 30mg/ml的nabh4，第二份加入1ml 30mg/ml的nabd4，室温静置3h。加入100ul冰醋酸终止反应。透析48h，冻干，最后进行甲基化处理。
[0062]
(2)甲基化分析：冻干品中加入500μl dmso溶解。加入1mg naoh，反应30min。加入50μl碘甲烷溶液反应1h。加入1ml水和2ml二氯甲烷，涡旋混匀，离心后弃水相。重复水洗3次。吸取下层二氯甲烷相并蒸干。步骤(1)-步骤(5)重复3次以上。加入100μl 2m tfa，121℃反应90min。反应结束后，于30℃蒸干。加入50μl 2m氨水，50μl 1m nabd4，混匀，室温下反应2.5h。加入20μl乙酸终止反应，氮气吹干，250μl甲醇洗两次，氮气吹干。加入乙酸酐250μl，涡旋混匀，100℃反应2.5h。加入1ml水静置10min。加入500μl二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次。取下层二氯甲烷相，上机检测。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例提供巴楚蘑菇多糖p-hlp对dss诱导的炎症性肠病小鼠炎症作用，包括以下步骤：
[0065]
s1、小鼠dai指数评价
[0066]
采用盲法并根据粪便评分标准进行dai评估，dai指数计算为以下三项相加得数：
[0067]
(1)体重损失：无损失-0；1-5％-1；5-10％-2；10-20％-3；》20％-4。
[0068]
(2)粪便粘稠度：正常-0；轻度软-1；软-2；轻度腹泻；水样腹泻-4。
[0069]
(3)便血：无-0；轻微便血-1；潜血阳性-2；大量便血-3；严重便血-4。
[0070]
为确定p-hlp是否具有改善或缓解ibd的作用，本部分给予小鼠3％ dss溶液诱导溃疡性结肠炎小鼠模型，联合/不联合p-hlp低、高剂量处理后，每日监测小鼠体重变化，后者可用于判断ibd严重程度。与nc组小鼠相比，小鼠dss模型组小鼠饮用3％ dss溶液四天后体重开始降低，并且随着时间延长，降低程度愈加明显并有统计学意义(p《0.01)(图5)。给予不同剂量p-hlp后，与dss模型组相比，高剂量p-hlp组(dss+p-hlp(h))体重显著增加(p《0.01)，而低剂量p-hlp组(dss+p-hlp(l))小鼠的体重有改善趋势，但无统计学意义(图5)。此外，空白+p-hlp组小鼠体重变化与空白对照组保持一致，均为稳步增长(图5)。
[0071]
s2、结肠长度的测量
[0072]
第8天结束造模，处死动物前4小时禁食。处死小鼠后，首先分离出盲肠，保留盲肠并向下延伸至肛门剪断结肠，剪下后整齐平铺在白纸并用直尺测量长度并拍照留干预前后对比图。
[0073]
测量5组所有小鼠的结肠长度可见，与nc组相比，dss组小鼠结肠显著缩短(p《0.01)(图6)。同时，观察到结肠水肿以及粘膜充血等现象。不同剂量p-hlp干预后，dss+p-hlp(l)及dss+p-hlp(h)组小鼠的结肠变长于dss组小鼠(组间对比结果分别为(p《0.05，p《0.01)(图6)。除此之外，nc小鼠和空白+p-hlp组小鼠结肠长度与形态并不存在明显差异，表明100mg/kg的p-hlp对正常小鼠无毒副作用(图6)。
[0074]
s3、脾脏重量的称量及脾脏指数计算
[0075]
剪下脾脏后称量每一只小鼠脾脏重量，并做好记录。按照以下公式计算小鼠脾脏指数：
[0076]
脾脏指数(g/kg)＝脾重/体重
[0077]
脾脏指数可以反映肠道炎症严重程度。按照脾脏指数计算方法(脾重/体重比值)，统计5个组，25只小鼠的脾脏指数。可见与对照组相比，dss组的脾脏指数显著升高，而dss+p-hlp(l)及dss+p-hlp(h)组的脾脏指数均恢复到接近正常水平(p《0.01)。而nc及空白+p-hlp两组之间脾脏指数无显著差异(图7)。
[0078]
s4、组织病理分析
[0079]
剪下1cm结肠组织，并将其放置在10％的中性福尔马林溶液中进行保存，对组组织进行包埋、制片后，用苏木精-伊红溶液进行染色，在显微镜下进行观察组织，记录炎性细胞浸润及粘膜损伤情况等。
[0080]
对照组和空白+p-hlp组结肠病理形态正常，黏膜层完整，隐窝排列整齐，肠腺体丰富，杯状细胞丰富。图8b，为dss模型组，dss导致杯状细胞丧失、隐窝结构严重损伤、中重度水肿(黄色箭头)、结肠组织肌层炎症细胞浸润(红色箭头)，甚至破壁(黑色箭头)。然而，经过p-hlp治疗，尤其是高剂量的p-hlp缓解上述病理损伤，包括上皮相对完整、腺体结构或隐窝的再生、溃疡缩小(蓝色箭头)、水肿轻度，接近正常结肠组织病理形态，表明p-hlp对于ibd小鼠具有治疗作用(图8c-d)。采用盲法进一步对进行病理组织学评分，结果显示dss组组织学指数明显高于空白对照组(p《0.01)。与dss组相比，dss+p-hlp(h)组显著降低组织学指数(p《0.01)，虽然低剂量p-hlp在一定程度上减少组织损伤，但无统计学差异(图8f)。
[0081]
s5、qrt-pcr测定炎症相关基因mrna的表达
[0082]
匀浆器用depc清洗后121℃灭菌，超净台吹干；取1cm结肠组织，depc水清洗，加入1ml trizol试剂，在匀浆器中冰上匀浆后开始提取结肠组织rna。根据测定的rna浓度，向不同样品中加入不同量的rnase-free h2o使其浓度均达到40ng/μl，并于-20℃保存用于后续反转录制备cdna。反应程序为：25℃，10min；48℃，40min；95℃，5min；4℃，∞；
[0083]
不同剂量p-hlp灌胃降低了dss诱导增加的促炎细胞因子(il-1β，il-6和tnf-α)mrna表达水平。同时，增加了抗炎细胞因子(il-10)的含量。其中，高剂量p-hlp(50mg/kg)调节炎症相关细胞因子mrna表达水平至正常水平，并具有极显著差异(p《0.01)。此外，dss处理升高了促炎介质(inos和cox-2)mrna的表达水平，不同剂量p-hlp组(10和50mg/kg)结肠组织中inos和cox-2mrna水平降低，并均有极显著差异(p《0.01)。空白+p-hlp组(100mg/kg)炎症相关细胞因子和介质mrna表达水平与nc组水平一致(图9)。
[0084]
综上所述，本发明的巴楚蘑菇多糖p-hlp是一种新型多糖，至今还未报到提取出这种结构特征的巴楚蘑菇多糖。动物实验表明，巴楚蘑菇多糖p-hlp对dss诱导的炎症性肠病小鼠炎症指标具有显著调节和干预效应。不同剂量巴楚蘑菇多糖p-hlp通过调节炎症相关细胞因子和酶而调节宿主免疫。此外，本发明还研究了不同剂量p-hlp对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有很好的缓解或改善作用，能回调溃疡性结肠炎小鼠体重、降低dai指数、缓解病理组织损伤、抑制结肠粘膜促炎症因子和介质的表达、促进抗炎细胞因子的表达，尤其是高剂量p-hlp效果明显而独特。因此，该中性巴楚蘑菇多糖可开发为临床上治疗炎性肠病以及结肠炎相关疾病的疗效确切、毒副作用低的药物，还有望通过饲料添加剂而应用于动物饲料中。
[0085]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1、将干燥巴楚蘑菇粉碎过40目筛后于沸水中提取一段时间，过滤，滤液于50～60℃浓缩至原体积的1/4，得到一次浓缩液；s2、将一次浓缩液除去游离蛋白质，进一步浓缩至原体积的1/3，得到二次浓缩液，二次浓缩液中加入其2～4倍体积的无水乙醇混合均匀；s3、于50～60℃蒸除乙醇，浓缩物真空冷冻干燥，得到巴楚蘑菇粗多糖；s4、采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化；s4、再将离子交换色谱法纯化后的产品用蒸馏水在纤维素膜(5kda)中透析，收集产率最高的洗脱峰组分并浓缩、冻干，得到精制多糖；s5、将精制多糖通过凝胶纯化法进一步纯化，收集单一对称峰为中性巴楚蘑菇多糖p-hlp。2.根据权利要求1所述的一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中干燥巴楚蘑菇与沸水的重量体积比为1：(15～20)。3.根据权利要求1所述的一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中将一次浓缩液除去游离蛋白质采用的试剂为体积比4:1的二氯甲烷与正丁醇混合液。4.根据权利要求1所述的一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化是采用deae-cellulose fast flow凝胶柱。5.根据权利要求4所述的一种中性巴楚蘑菇多糖的制备方法，其特征在于：采用deae-cellulose fast flow凝胶柱进行纯化的过程包括：将巴楚蘑菇粗多糖溶于去离子水中，配制成1～2mg/ml的溶液，装样至deae-cellulose fast flow凝胶柱中；随后依次以超纯水和浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.5moi/l的nacl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，洗脱流速设定为1～2ml/min，收集洗脱液。6.一种中性巴楚蘑菇多糖，其特征在于：是采用权利要求1～5任意一项所述的制备方法获得。7.根据权利要求6所述的一种中性巴楚蘑菇多糖，其特征在于：所述中性巴楚蘑菇多糖的数均分子量为39.14
×
108；单糖组成包括：甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸和阿拉伯糖，前述几种多糖的摩尔比率为43.68:38.16:9.34:4.35:0.88:0.84:0.79:0.74:0.72:0.50；多糖组成包括：t-d-glc、t-d-rha、t-d-man、t-d-gal、1,4-glcp、1,2-manp、1,6-manp、1,3,6-manp、1,4,6-galp、1,6-glcp和1,3-glcp，其相对摩尔比分别为8.48：6.05：5.50：0.70：31.60:28.71:8.22:4.29:2.74:2.15:1.58。8.权利要求1～5任意一项所述的制备方法获得的中性巴楚蘑菇多糖或者权利要求6或7所述的中性巴楚蘑菇多糖在制备抗炎药物上的应用。9.权利要求1～5任意一项所述的制备方法获得的中性巴楚蘑菇多糖或者权利要求6或7所述的中性巴楚蘑菇多糖在制备饲料添加剂上的应用。10.一种动物饲料，其特征在于：采用权利要求1～5任意一项所述的制备方法获得的中性巴楚蘑菇多糖或者权利要求6或7所述的中性巴楚蘑菇多糖制备的饲料添加剂。

技术总结
本发明提供一种中性巴楚蘑菇多糖及其制备方法与应用，其制备方法包括：将干燥巴楚蘑菇粉碎过筛后于沸水中提取，过滤，滤液于50～60℃浓缩至原体积的1/4；将一次浓缩液除去游离蛋白质，进一步浓缩至原体积的1/3，二次浓缩液中加入无水乙醇混合均匀；于50～60℃蒸除乙醇，浓缩物真空冷冻干燥，得到巴楚蘑菇粗多糖；采用离子交换色谱法对巴楚蘑菇粗多糖进行纯化；再用蒸馏水在纤维素膜(5kDa)中透析，收集产率最高的洗脱峰组分并浓缩、冻干；将精制多糖通过凝胶纯化法进一步纯化，收集单一对称峰为中性巴楚蘑菇多糖p-HLP。该中性巴楚蘑菇多糖可开发为临床上治疗炎性肠病以及结肠炎相关疾病的疗效确切、毒副作用低的药物，还有望通过饲料添加剂而应用于动物饲料中。通过饲料添加剂而应用于动物饲料中。通过饲料添加剂而应用于动物饲料中。


技术研发人员：祖母拉提
受保护的技术使用者：新疆医科大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/7/21