一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针YSQ及其制备方法和应用

一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铅是应用最为广泛的重金属之一，也是环境中主要的重金属污染物。随着汽油、蓄电池、金属制品、化学涂料等产品使用量的不断增加以及工农业三废的排放，铅以多种途径广泛进入到人们的生活环境中，并呈加剧趋势，不仅直接影响农作物的生长发育、产量、品质等，而且间接通过食物链对人体健康造成严重的危害，铅污染已经引起了广泛的社会关注。目前虽然对pb
2+
的检测技术已经有了较大的进展，但是还存在一系列的问题。传统检测铅离子的技术包括电化学方法、原子吸收法、离子色谱法、催化示波极谱法等，操作步骤繁琐、检出限较高、响应时间过长、肉眼变化不明显以及吸收波长较短不利于细胞成像等问题。近几年来，荧光化学传感器检测法发展迅猛，尤其是近红外荧光探针，肉眼可见的荧光变化，可实现生物体内成像，为医学界带来便利。
3.目前荧光探针的设计备选物主要有嘌呤环、香豆素、荧光素和卟啉等，大多数研究者设计与开发的pb
2+
检测荧光探针多为淬灭型的，由于荧光淬灭型探针检测的背景信号大、灵敏度较低且不适合生物样品检测。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种“关-开”型铅离子检测荧光探针ysq，该荧光探针ysq对铅离子具有很高的选择性、低检出限、响应时间短，可以快速、实时现场检测环境系统中微量的铅离子。
5.本发明还提供了所述铅离子检测荧光探针ysq的制备方法和应用。
6.技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq，所述铅离子检测荧光探针ysq以二氰基异佛尔酮和异喹啉酰肼为荧光基团，其结构如下式i所示：
[0007][0008]
本发明所述的“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
以异佛尔酮和丙二腈为原料反应得到2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈；再与对羟基苯甲醛反应制得(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈；加入乌洛托品，三氟乙酸制得二氰基异佛尔酮醛；
[0010]
将异喹啉羧酸通过酯化反应和酰胺化两步反应得到原料异喹啉酰肼；以异喹啉酰肼和二氰基异佛尔酮醛为原料，通过席夫碱缩合反应得到“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq。
[0011]
其中，所述铅离子检测荧光探针ysq制备的反应路线如下所示：
[0012][0013]
所述反应路线中：中间体为二氰基异佛尔酮醛(a)；异喹啉酰肼(b)；(n
’‑
((e)-5-((e)-2-(3-(二氰亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-2-羟基苄叉)异喹啉-1-碳酰肼(ysq)为本发明所述检测铅离子荧光探针分子。
[0014]
其中，步骤(1)中在n2保护下将异佛尔酮和丙二腈溶解在甲醇中，加入哌啶，以及冰醋酸和乙酸酐，待反应完全，反应液冷却至室温后倒入冰水中，抽滤，所得固体用乙醇重结晶得到中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈。
[0015]
其中，步骤(1)中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈溶解在乙醇溶液中，加入对羟基苯甲醛以及哌啶，回流搅拌反应，待反应完全后减压除去有机溶剂，通过层析柱得到中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈。
[0016]
其中，步骤(1)中将中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈溶解在三氟乙酸中，加入乌洛托品，回流搅拌，反应完全后，加入到冰水中，用萃取，干燥，通过柱层析得到最终产物为二氰基异佛尔酮醛。
[0017]
其中，步骤(2)中异喹啉羧酸溶于有机溶剂甲醇中，然后加浓硫酸，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，调节ph至中性，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到异喹啉羧酸甲酯；将中间体异喹啉羧酸甲酯溶于有机溶剂甲醇中，然后加入水合肼，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到异喹啉酰肼。
[0018]
其中，步骤(2)中异佛尔酮醛和异喹啉酰肼溶解于有机溶剂甲醇中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针ysq。
[0019]
本发明所述的铅离子检测荧光探针ysq与pb
2+
作用机理的理论计算。
[0020]
本发明所述的铅离子检测荧光探针ysq在检测铅离子中的应用。
[0021]
本发明所述的铅离子检测荧光探针ysq在实时、快速地现场检测溶液和细胞中痕量铅离子中的应用。
[0022]
作为优选，所述ysq的制备过程包括：
[0023]
(1)二氰基异佛尔酮醛(a)的制备
[0024]
在n2保护下将异佛尔酮和丙二腈溶解在甲醇中，加入哌啶，以及微量得冰醋酸和乙酸酐，待反应完全，将反应液冷却至室温后倒入到冰水中，抽滤，所得固体用乙醇重结晶得到中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈。
[0025]
中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈溶解在乙醇溶液中，加入对羟基苯甲醛以及少量哌啶，回流搅拌反应。待反应完全后减压除去有机溶剂，通过层析柱(乙酸乙酯:石油醚＝5:1)得到中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈。
[0026]
将中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈溶解在三氟乙酸中，加入乌洛托品，100℃下回流搅拌，反应完全后，加入到冰水中，用二氯甲烷萃取，干燥。通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝5:1)得到最终产物二氰基异佛尔酮醛(a)。
[0027]
(2)异喹啉酰肼(b)得制备
[0028]
异喹啉羧酸溶于有机溶剂甲醇中，然后加浓硫酸，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，用氢氧化钠调节ph至中性，用乙酸乙酯，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，得到粗产物异喹啉羧酸甲酯。然后将粗产物异喹啉羧酸甲酯溶于有机溶剂甲醇中，然后加入水合肼，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)得到最终目标原料异喹啉酰肼(b)。
[0029]
(3)制备基于二氰基异佛尔酮为母体的铅离子荧光探针
[0030]
将二氰基异佛尔酮醛和异喹啉酰肼溶解于有机溶剂甲醇中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针ysq。
[0031]
所述铅离子检测荧光探针ysq制备的优选反应路线如下所示：
[0032][0033]
本发明探针中采用的二氰基异佛尔酮是一种良好的荧光母体，具有stokes位移大、近红外发光、易合成等特点。异喹啉衍生物作为荧光基团具有诸多优点，且具有很好的生物相容性以及生物毒性低。因此，本发明设计并开发了一种全新结构的以基于二氰基异佛尔酮为母体的席夫碱型荧光探针ysq。该探针分子拥有近红外的发射波长(》600nm)，不仅具有细胞毒性低、能够很好地与生态环境和生物兼容性和强的组织穿透力，小的细胞组织损伤性等优点，而且具有较大的stokes位移，有效地避免吸收光谱和发射光谱之间光谱重叠较大，提高荧光辐射在荧光发射中能量耗散中的比例。此外，本探针与现有技术中以嘌呤结构为母体的探针相比，合成路线短，产率高，原料成本低，而且对pb
2+
具有独特的灵敏度、检出限低，可以成功地制备荧光试纸检测环境中的微量pb
2+
。
[0034]
与此同时，本发明还通过密度泛函理论(dft)计算验证了pb
2+
检测荧光探针ysq与pb
2+
的络合机理。通过最优构型理论计算，探针分子(ysq)与pb
2+
通过酚羟基中的氧原子，烯胺上的氮原子,以及异喹啉环上的氮原子相结合，而且键长分别为络合后ysq-pb
2+
的最高占据分子轨道(homo)和最低未占分子轨道(lumo)的轨道能量能级差为1.9116ev远远低于探针自身分子ysq的轨道能级差(2.8934ev),说明ysq-pb
2+
络合物更稳定。从理论基础上，说明了探针分子ysq对pb
2+
具有很强的选择性和灵敏度。
[0035]
本发明以二氰基异氟尔酮为母体设计了近红外荧光探针对铅离子的检测。与传统检测铅离子的技术相比，本发明的“关-开”型近红外铅离子荧光探针检测法检测铅离子更加便捷，实现了低成本、高效率，而且可以实时、快速地现场检测，有效解决了现有荧光淬灭型pb
2+
检测荧光探针检测的背景信号大、灵敏度较低且不适合生物样品检测等问题。
[0036]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0037]
本发明通过利用一步法通过二氰基异佛尔酮醛和异喹啉酰肼缩合制备具有二氰基异佛尔酮为母体的荧光探针。该荧光探针对铅离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中pb
2+
表现出高灵敏度，高选择性以及低检出限(18nm)，更重要的是该探针制备方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好，可以实现实时、快速地现场检测溶液
和细胞中痕量铅离子。
附图说明
[0038]
图1为实施例1中制得的铅离子荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同浓度锌离子(pb
2+
)的紫外吸收光谱图以及颜色变化图(图1插图中左边为无色，右边紫红色)；
[0039]
图2为实施例1中制得的铅离子荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图；
[0040]
图3为实施例1中制得的荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同浓度铅离子(pb
2+
)的荧光光谱响应图以及颜色变化图；
[0041]
图4为实施例1中制得的荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；
[0042]
图5为实施例1中制得的荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)与铅离子(pb
2+
)络合比的job-plot曲线；
[0043]
图6为实施例1中制得的荧光探针检测铅离子时的响应时间图；
[0044]
图7为实施例1中制得的荧光探针在(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)与铅离子(pb
2+
)在不同ph值(2至12)范围内荧光响应图；
[0045]
图8为实施例1制得的荧光探针以及荧光探针与铅离子络合后的最优构型图；
[0046]
图9为实施例1制得的荧光探针在生物细胞中的毒性测试图；
[0047]
图10为实施例1制得的荧光探针在生物细胞中的细胞成像图；
[0048]
图11为实施例1制得的荧光探针制备的荧光试纸，在测试不同浓度铅离子的颜色变化图；
[0049]
图12为实施例1中制得的荧光探针的质谱1h nmr谱图；
[0050]
图13为实施例1中制得的荧光探针的质谱
13
c nmr谱图；
[0051]
图14为实施例1中制得的荧光探针的质谱ms谱图；
[0052]
图15为实施例1中制得的荧光探针的红外ir谱图。
具体实施方式
[0053]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0054]
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
[0055]
其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化锌、无水氯化铁、无水氯化铝等或者硝酸盐化学试剂如pb(no3)2加去离子水配置而成的。
[0056]
基于二氰基异佛尔酮为母体的荧光探针ysq的具体合成路线：
[0057]
(1)制备中间体二氰基异佛尔酮醛(a)
[0058]
在n2保护下将异佛尔酮(4.3g,31.13mmol)和丙二腈(1.87g,28.3mmol)溶解在甲醇(15ml)中，加入哌啶(0.5ml)，以及冰醋酸(0.2ml)和乙酸酐(0.2ml)，待反应完全，将反应液冷却至室温后倒入到冰水中，抽滤，所得固体用乙醇重结晶得到中间体2-(3,5,5-三羟基
环己烷-2-烯亚基)丙二腈(5g,86％)。
[0059]
所得到的中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈结构式为:
[0060][0061]
中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈(4.65g,25mmol)溶解在乙醇(20ml)溶液中，加入对羟基苯甲醛(3.35g,27.5mmol)以及哌啶(0.5ml)，70℃回流搅拌反应2小时。待反应完全后减压除去有机溶剂，通过层析柱(乙酸乙酯：石油醚＝5:1)得到中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈(3.62g,50％)。
[0062]
所得到的中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈结构式为:
[0063][0064]
将中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈(2.9g,10mmol)溶解在三氟乙酸(30ml)中，加入乌洛托品(1.68g,12mmol)，100℃下回流搅拌2小时，反应完全后，产物全部加入到冰水中，用二氯甲烷萃取，干燥。通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝5:1)得到中间体产物异佛尔酮醛(a)(2.23g,55％)。
[0065]
所得到的中间体二氰基异佛尔酮醛结构式为:
[0066][0067]
(2)制备中间体异喹啉酰肼(b)
[0068]
将异喹啉-1-羧酸(1.73g,10mmol)溶解于甲醇溶剂(50ml)中，搅拌溶解直至溶液澄清的条件下，滴加市售浓硫酸(98％)(1ml)作为催化剂，然后将反应体系升温至70℃搅拌回流12个小时。将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗产物异喹啉羧酸甲酯。向含有粗产品的圆底烧瓶加入水合肼(0.1g,20mmol)和有机溶剂甲醇(30ml)，继续升温至70℃搅拌回流3个小时。反应结束后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，粗产物通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(1.45g，78％)。
[0069]
所得到的中间体异喹啉酰肼结构式为：
[0070]
[0071]
(3)制备基于二氰基异佛尔酮为母体的铅离子荧光探针ysq
[0072]
在50ml含有20ml有机溶剂甲醇的圆底烧瓶中，分别加入二氰基异佛尔酮醛(a)(0.318g,1mmol)和异喹啉酰肼(b)(0.187g,1mmol)，搅拌溶解后，将反应体系升温至80℃回流搅拌3个小时。tlc跟踪反应检测，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶(meoh:pe＝1:20)纯化，得到红色固体荧光探针分子ysq(0.414g,85％)。
[0073]
所得到的荧光探针化合物结构式为：
[0074][0075]
本荧光探针的表征数据1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.65(s,1h),11.76(s,1h),8.92(d,j＝0.84hz,1h),8.71(s,1h),8.61(d,j＝0.84hz,1h),8.09
–
8.05(m,2h),7.84
–
7.81(m,2h),7.75(t,j＝0.84hz,1h),7.67(d,j＝0.84hz,1h),7.25(s,2h),6.96(d,j＝0.84hz,1h),6.78(s,1h),2.54(s,2h),2.48(s,2h),0.96(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ169.25,160.22,154.07,145.92,137.67,136.07,130.91,130.31,129.62,127.51,127.39,127.26,125.69,122.90,118.33,118.12,113.65,112.90,78.01,42.97,39.21,32.03,28.05.esi-ms m/z:[m+k]
+
calcd for c
30h25
n5o2k 526.1640,found 526.1662；ir(kbr cm-1
):2956,2218,1687,1551,1521,1495,1341.
[0076]
实施例1中制得的荧光探针的氢谱(1h nmr),碳谱(
13
c nmr),质谱ms，红外ir分别如图12，图13，图14，图15所示，说明本发明的荧光探针制备成功。
[0077]
实施例2
[0078]
将实施例1制得的铅离子检测荧光探针ysq用dmso配置成1mm的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mm的金属离子储备液，向3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μl的探针储备液和50μl的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为490nm，最大发射波长为678nm，具体测试结果如下：
[0079]
取两个比色皿，分别加入3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)和30μl的探针储备液，向其中一个比色皿再加入50μl的铅离子储备液，另外一个比色皿不加铝离子储备液，进行紫外光谱测试。如图1所示，荧光探针本身在波长λ＝490nm处几乎无紫外吸收，一旦加入铅离子后，紫外吸收峰逐渐增强；而且，添加铅离子使探针溶液的颜色由无色变为紫红色。结果表明探针对pb
2+
具有很高的灵敏度和选择性。肉眼可见的颜色变化可能是由于探针和铅离子之间形成了新的配合物。
[0080]
如图2所示，铅离子检测荧光探针对各种常见金属离子选择性荧光光谱图。向3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μl的探针储备液和50μl的金属离子储备液，实验结果表明只有加入铅离子，荧光光谱在678nm处荧光强度才发生明显的增强。而且，荧光强度明显优于加入其他金属离子时的荧光强度，说明本发明的荧光探针对铅
离子有很好的选择性。
[0081]
如图3所示，锌离子检测荧光探针对不同浓度铅离子(pb
2+
)的荧光光谱响应图。向3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μl的探针储备液和0～50μl(0、1、2、3
……
10、15
……
50μl)的锌离子溶液(3mm的铅离子储备液)，该荧光探针在溶液中本身几乎无荧光，但随着铅离子浓度的增加，在678nm处荧光随着铅离子浓度的增加也不断的增强，即荧光强度随着铅离子浓度的增加而增加，并且伴随着明显的颜色变化。说明本发明实施例1制备的探针ysq与铅离子络合后，抑制了c＝n双键旋转，从而抑制了电子转移，从而说明探针ysq是荧光增强型探针。
[0082]
如图4所示，铅离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与铅离子反应后的荧光强度柱状图。向3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μl的探针储备液和50μl的其他任意一种金属离子(al
3+
，co
2+
，pd
2+
，ni
2+
，cu
2+
，cr
3+
，cu
+
，mn
2+
，mg
2+
，ba
2+
，pd
2+
，sn
2+
，fe
2+
，k
+
，sr
2+
，ca
2+
，sr
2+
，na
+
，ag
+
和cd
2+
)储备液，最后向空白液加入50μl的pb
2+
储备液，测试其荧光强度。结果表明，除了具有抗磁性的钴，镍，铝，铜，铬，铁，锡离子，其他金属离子对本发明铅离子荧光探针识别锌离子没有明显的干扰，说明本发明制备的探针专一性好。
[0083]
如图5所示，通过job's plot方法研究了探针与pb
2+
的结合率，向3ml的空白溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入一定体积探针储备液(1mm)和pb
2+
储备液(3mm)，使得铅离子检测荧光探针和铅离子的浓度总和为50μm，通过改变二者的浓度比(铅离子检测荧光探针和铅离子物质的量比依次为1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1)得到678nm处的荧光强度与该浓度下铅离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图5可知，当铅离子所占比例为0.5时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针与锌离子之间以1:1比例络合形成稳定的络合物[ysq-pb
2+
]。
[0084]
如图6所示，向3ml的空白缓冲液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μl的探针储备液和50μl的pb
2+
储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并在2min内达到稳定值。此外，探针的荧光强度在随后的30min内基本保持不变，这说明探针对于pb
2+
检测足够稳定。
[0085]
如图7所示，用1m hcl和1m naoh调节分别含有探针ysq储备液(10μl)以及[ysq-pb
2+
]储备液(10μl)的meoh/h2o的缓冲溶液(meoh:h2o:hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)(1ml)，其中[ysq-pb
2+
]储备液由探针、氯化铅溶于二次蒸馏水分别配成浓度10um和50um，使其具有不同的ph变化值。然后，测试这两个体系在不同ph值范围内的荧光强度。探针ysq本身在ph值从2到7的范围内几乎没有荧光强度，但是在7-12范围内探针ysq本身荧光增强很明显。这是由于碱性条件下羟基去质子化抑制了原有的esipt效应，另一方面由于氧原子带负电荷，使ict效应开启，荧光增强。但是[ysq-pb
2+
]体系在ph为7.0-10.0的范围内，荧光(678nm)强度明显增强，且在ph＝10时荧光强度达到最大值。[ysq-pb
2+
]在酸性条件下(ph《7.0)，荧光信号比较弱，可能原因是荧光探针ysq络合点被质子化，不容易与铅离子络合。[ysq-pb
2+
]在中性或碱性条件下(ph》7.0)，荧光信号变强，可能碱性条件下羟基去质子化抑制了原有的esipt效应，另一方面由于氧原子带负电荷，使ict效应开启，荧光增强。因此，ysq最适合的ph范围是7.0-10.0，ysq具有可在生物环境中具有检测pb
2+
的能力。
[0086]
如图8所示，荧光探针以及[ysq-pb
2+
]络合物的最优构型图以及其相应的轨道能级
图，dft计算结果进一步证明了探针ysq与铅离子是通过-c＝n,-oh以及c＝o形成的四配位配合物，而且探针ysq与pb
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形成络合物后更加稳定。
[0087]
如图9所示，通过mtt实验对不同浓度(0-10μm)的铅离子检测荧光探针进行了hela细胞毒性研究。在96孔板中，首先接种含有10μm的铅离子溶液(100μl/孔)，然后将含有10μl 0-10μm(0、2、4、6、8、10μm)的ysq探针的细胞悬液接种到孔板中，最后将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5％co2的条件下)。其次，向每孔注射10μl的mtt溶液，将培养板在培养箱内继续孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。hela细胞生存力结果表明24小时后，hela细胞存活率超过90％。这mtt实验结果表明本发明的铅离子探针在实验环境中具有较低的细胞毒性，说明探针在检测活细胞中的铅离子具有潜在应用价值。
[0088]
如图10所示，荧光探针与铅离子结合前后在hela细胞中的成像图。将1
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105hela细胞接种到35毫米玻璃底组织培养皿中，当细胞密度达到60％时，用含有8μm硝酸铅的无血清培养基替换dmem培养基在37℃下培育30分钟，并将细胞用pbs洗涤3次。接着，用加入含有ysq的新的dmem培养基(探针终浓度为8μm)，继续孵化30分钟，随后将所获得的细胞用pbs洗涤3次。然后，将未经硝酸铅处理的含有ysq的dmem培养基培养的细胞(孵化30min),用pbs洗涤3次，作为对照。通过激光共聚焦显微镜成像实验(激发波长488nm)结果表明，加入ysq探针和pb
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的细胞可以观察到细胞的蓝色荧光显着增加，可能原因是ysq-pb
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络合物的形成。因此，细胞成像实验结果表明，探针ysq是可透过细胞膜的，可以有效地用于活细胞中痕量pb
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的细胞成像，进一步表明本发明的铅离子荧光探针ysq可以应用于生物体实验。
[0089]
如图11所示，将滤纸浸入含有荧光探针(1mm)的meoh:h2o:hepes(v/v/v＝9:1:0.1)储备液中，浸泡半小时，然后将测试条取出在空气中干燥，得到干燥的含有探针的试纸条。将试纸条分别浸泡在0mm、0.1mm、3.0mm铅离子浓度溶液中，浸泡30分钟后，晾干，在紫外灯下，测定用荧光探针ysq溶液制备的荧光试纸以及其在测试不同浓度铅离子时的颜色变化，说明探针ysq的颜色随着铅离子浓度变化而变化，并且可以以固体状态定量检测环境中痕量铅离子。
[0090]
上述实验说明以二氰基异佛尔酮醛和异喹啉酰肼为荧光基团，通过缩合反应制备具有二氰基异佛尔酮为母体的荧光探针ysq，该探针对溶液中pb
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表现出高灵敏度和高选择性。同时由于其具有结构稳定、毒性低以及细胞渗透能力强，又成功用于检测活体hela细胞中的痕量金属铅离子；该荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储，具有较高的应用发展前景。

技术特征：
1.一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq，其特征在于，所述铅离子检测荧光探针ysq以二氰基异佛尔酮和异喹啉酰肼为荧光基团，其结构如下式i所示：2.一种权利要求1所述的“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以异佛尔酮和丙二腈为原料反应得到2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈；再与对羟基苯甲醛反应制得(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈；加入乌洛托品，三氟乙酸制得二氰基异佛尔酮醛；(2)将异喹啉羧酸通过酯化反应和酰胺化两步反应得到原料异喹啉酰肼；以异喹啉酰肼和二氰基异佛尔酮醛为原料，通过席夫碱缩合反应得到“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针ysq。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述铅离子检测荧光探针ysq制备的优选反应路线如下所示：4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)在n2保护下将异佛尔酮和丙二腈溶解在甲醇中，加入哌啶，以及冰醋酸和乙酸酐，待反应完全，反应液冷却至室温后倒入冰水中，抽滤，所得固体用乙醇重结晶得到中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中间体2-(3,5,5-三羟基环己烷-2-烯亚基)丙二腈溶解在乙醇溶液中，加入对羟基苯甲醛以及哌啶，回流搅拌反应，待反应完全后减压除去有机溶剂，通过层析柱得到中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二
甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中间体(e)-2-(3-(4-氢氧苯乙烯基)-5,5-二甲基-2-环己烯基-1-亚基)丙二腈溶解在三氟乙酸中，加入乌洛托品，回流搅拌，反应完全后，加入到冰水中，萃取，干燥，通过柱层析得到最终产物为二氰基异佛尔酮醛。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中异喹啉羧酸溶于有机溶剂甲醇中，然后加浓硫酸，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，调节ph至中性，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到异喹啉羧酸甲酯；将中间体异喹啉羧酸甲酯溶于有机溶剂甲醇中，然后加入水合肼，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到异喹啉酰肼。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中异佛尔酮醛和异喹啉酰肼溶解于有机溶剂甲醇中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针ysq。9.一种权利要求1所述的铅离子检测荧光探针ysq在检测铅离子中的应用。10.一种权利要求1所述的铅离子检测荧光探针ysq在实时、快速地现场检测溶液和细胞中痕量铅离子中的应用。

技术总结
本发明公开了一种“关-开”型近红外铅离子检测荧光探针YSQ及其制备方法和应用，该近红外铅离子检测荧光探针YSQ对铅离子拥有很强的选择性，响应时间快，络合后可见的明显荧光增强以及低检出限，其结构如下式I所示。本发明以二氰基异佛尔酮和异喹啉酰肼为荧光基团，通过简单的缩合反应制备希夫碱型荧光探针YSQ。该“关-开”型近红外荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储。易于存储。易于存储。易于存储。


技术研发人员：许海燕 朱军宇 肖银铃 刘泽玉
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/21