一种WNT2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的新用途

一种wnt2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的新用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种wnt2用于提高外受精胚胎发育效率和质量的的新用途。


背景技术：

2.过去几十年，哺乳动物体外胚胎生产技术广泛应用于家畜遗传改良、良种扩繁和人类辅助生殖等。但是，由于体外胚胎发育培养液成分不完善导致体外胚胎发育能力低、质量差的难题，极大限制体外胚胎生产技术。因此优化体外胚胎培养液成分是目前改善体外胚胎发育效率和质量，完善体外胚胎生产技术最直接有效的策略。目前，体外胚胎培养液外源添加因子的筛选策略耗时耗力，成本高，盲目性强、效率低的难题。
3.本发明基于体内外早期胚胎和输卵管的转录组数据，解析了早期胚胎与输卵管之间的受配体表达模式，结合体外胚胎中wnt信号通路活性不足的表型。首次发现并证明在体外胚胎培养液中添加wnt2能够显著增加囊胚总细胞数和内细胞团细胞数，显著提高体外胚胎囊胚率、胚胎移植后附植率和活胎儿率，改善体外受精胚胎的发育效率和质量。
4.在本发明之前，本领域人员尚没有发现wnt2对体外胚胎发育的有益作用。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种wnt2用于提高体外受精(in vitro fertilization,ivf)胚胎发育效率和质量的新用途。
6.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
7.一种wnt2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的应用，具体是通过增强体外受精胚胎中wnt信号通路活性来提高体外受精胚胎的发育效率和质量。
8.如上所述的应用，优选地，所述增强体外受精胚胎中wnt信号通路活性是通过在胚胎培养液中添加wnt2蛋白来实现。
9.如上所述的应用，优选地，使用含有wnt2蛋白的体外培养液对体外受精后的胚胎进行培养。
10.如上所述的应用，优选地，所述wnt2蛋白的作用浓度为10-100ng/ml。
11.进一步地，在体外胚胎培养液中添加工作浓度优选为50ng/ml的wnt2。
12.如上所述的应用，优选地，体外培养液为ksom+aa。
13.如上所述的应用，优选地，体外胚胎的培养条件为37℃、5％ co2和100％湿度。
14.如上所述的应用，优选地，所述体外受精胚胎为哺乳动物体外受精胚胎。
15.本发明还提供了wnt2蛋白在改善哺乳动物体外受精胚胎发育效率和质量中的应用。
16.wnt2蛋白在制备用于提高哺乳动物体外受精胚胎发育效率和质量的体外培养基中的应用。
17.如上所述的应用，所述wnt2蛋白在体外培养基中的浓度为10-100ng/ml。
18.本发明的有益效果在于：
19.本发明提供的一种wnt2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的新用途，是将体外受精胚胎在含wnt2的体外培养液中培养，增强体外胚胎的wnt信号通路活性，显著提高了体外胚胎的发育效率和质量。
20.本发明提供了一种wnt2的新应用，具体是用于在制备用于改善哺乳动物体外受精胚胎发育效率和质量的体外培养基中的应用。wnt2是一种由输卵管分泌的内源性蛋白因子，作用通路和靶点明确，可用于一种安全、高效、低成本的胚胎体外培养基添加成分。
附图说明
21.图1为胚胎与输卵管和子宫组织中wnt信号通路的热图结果。
22.图2为体内外早期胚胎中wnt信号通路的gsva分数比较结果。
23.图3为添加wnt2后对胚胎发育率的影响统计结果。
24.图4为添加wnt2后对囊胚细胞总数数、内细胞团细胞数和滋养层细胞数的影响统计结果。
具体实施方式
25.本发明基于早期胚胎和输卵管的转录组数据，通过早期胚胎与输卵管之间的受配体表达模式，发现了wnt2能够改善体外胚胎的发育效率和质量。
26.以下实施例用于进一步说明本发明，其描述较为具体和详细，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
27.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中培养液ksom+aa购自美国millipore公司，wnt2蛋白购自中国abnova公司，货号h00007472-p01，icr小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，m2培养基购自中科迈晨(北京)科技有限公司。
28.实施例1wnt2提高小鼠体外胚胎的发育效率和质量
29.1、小鼠早期胚胎、输卵管和子宫组织测序
30.按照trizol法分别提取小鼠早期胚胎、输卵管和子宫组织样本的rna，之后送至bgi(深圳)平台进行转录组测序。最终的表达值呈现为rpkm。
31.2、小鼠早期胚胎、输卵管和子宫中wnt信号通路基因表达分析
32.wnt配体通过激活其受体发挥作用，为了研究wnt信号通路在早期胚胎发育过程中的活性，基于小鼠早期胚胎以及与其发育时期对应的输卵管和子宫的转录组数据，使用r软件中的pheatmap包对wnt信号通路的受体及lrp6配体的表达水平进行聚类分析，具体结果参见图1。图中a为早期胚胎以及与其发育时期对应的输卵管和子宫中wnt信号通路受体mrna的表达水平；b为早期胚胎以及与其发育时期对应的输卵管和子宫中wnt信号通路lrp6配体mrna的表达水平。
33.以上结果表明，wnt信号受体基因fzd2，fzd9和lrp6在小鼠早期胚胎中存在表达，lrp6基因在各个时期均有表达且表达量较高，推测胚胎中wnt信号的激活可能主要有lrp6受体介导。此外，激活lrp6受体的wnt配体在输卵管和子宫中高表达。因此，输卵管和子宫可
能通过分泌wnt配体激活胚胎上的lrp6受体，激活wnt信号，促进早期正常发育。
34.3、体内外早期胚胎中wnt信号通路活性的比较
35.胚胎的体外培养环境是化学成分明确的培养液，与体内胚胎相比，体外胚胎缺少输卵管和子宫分泌的wnt信号通路配体。为进一步探究wnt信号通路在早期胚胎发育过程中的作用，我们首先从kegg整理小鼠的wnt信号通路，然后通过r软件中的gsva包分析比较了体内外胚胎wnt信号通路的活性，具体结果参见图2。从图中可见，体外发育胚胎的wnt信号通路活性明显低于体内发育胚胎，特别是桑椹胚时期到囊胚期。因此，提示体外发育胚胎中的wnt信号通路活性存在不足现象。表明lrp6和wnt2在胚胎发育过程中可能发挥重要作用。
36.4、wnt2提高小鼠体外胚胎的发育效率和质量
37.(1)小鼠体外受精胚胎的收集
38.以8周龄青年母鼠为实验材料，每只母鼠腹腔注射5iu孕马血清促性腺激素(pmsg)，48小时后每只母鼠腹腔注射5iu人绒毛膜促性腺激素(hcg)，12h后断颈处死母鼠，取出输卵管，置于预热的37℃m2中，用1ml注射器将输卵管壶腹部的cocs(卵丘-卵母细胞复合物)划入受精滴中，放入co2培养箱平衡30分钟，然后将8周龄的青年公鼠断颈处死，剪取附睾，用镊子将精子从附睾轻轻挤入获能滴中，放入co2培养箱获能1小时。精子获能后，用移液枪吸取适量的精液加入到含cocs的受精滴中，使精子与cocs孵育4小时，之后根据极体排出情况挑选受精卵用于步骤(2)。
39.(2)小鼠体外受精胚胎的培养
40.将步骤(1)受精后的受精卵在受精液中清洗3次，放入预先平衡好的小鼠胚胎体外培养液中，培养条件为37℃、5％ co2、100％湿度，培养时间为96h。在此期间记录2-cell、4-cell、8-cell、桑葚胚、囊胚的发育率。
41.小鼠胚胎体外培养液组分为2种：对照组小鼠胚胎体外培养液为ksom+aa；wnt2组小鼠胚胎体外培养液为ksom+aa添加50ng/ml wnt2。
42.(3)囊胚免疫荧光染色
43.将步骤(2)获得的囊胚，用0.1％pbs-pva清洗三次，用酸性tyrode溶液(t1788，德国sigma公司)去除透明带，然后将胚胎转移到4％多聚甲醛固定液中室温固定1小时，之后用含0.5％triton x-100的dpbs(杜尔贝科磷酸盐缓冲液)室温下通透1小时，之后用含1％bsa的dpbs室温封闭胚胎1小时，用一级抗体在4℃孵育过夜。第二天用含0.5％triton x-100的dpbs室温下清洗三次，之后用二级抗体室温孵育1小时。最后，用dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)孵育15分钟以浸染细胞核，在bx51显微镜下观察荧光信号、拍照，统计细胞数目。
44.其中，所用的一级抗体如下：nanog抗体(1：500稀释，ab80892，abcam，英国)，cdx2抗体(1：500稀释度，mu392a-uc，biogenex实验室，美国)，使用的二级抗体如下：alexa fluor 594羊抗兔抗体(1：1000稀释，美国invitrogen，a-11034)，alexa fluor 488羊抗鼠抗体(1：1000稀释，美国invitrogen，a-11030)。
45.(4)小鼠囊胚子宫移植
46.在体外受精的当天，选择自然发情的青年雌鼠与输精管切除的结扎青年雄交配。第二天早上，有阴道栓的雌鼠视为假孕受体，视为第0.5天。将步骤(2)获得的第4.5天囊胚进行胚胎移植，选取6个发育良好的囊胚移植到假孕受体的两侧子宫角位置。在胚胎第19.5
天(胚胎移植的14天)，获取胎儿以评估每个胚胎的发育能力，具体方法如下：断颈处死母鼠将子宫取出，统计附植位点数，之后将胎儿和胎盘分别取出，记录活胎儿数。
47.上述步骤(2、3、4)结果分别如图3、图4和表1所示，图中横坐标“对照组”表示使用ksom+aa培养体外胚胎，“对照组+50ng/ml wnt2”表示在ksom+aa基础上添加50ng/ml wnt2蛋白培养体外胚胎。
48.图3为添加wnt2后对胚胎发育率的影响统计结果：zygote(受精卵)、morula(桑椹胚)、blastoctst(胚泡)、fragemented(碎片化)，
49.从图中可见，受精96小时后，体外胚胎培养液中添加wnt2后囊胚率达到(65.56
±
1.57％)，显著高于未添加wnt2的对照组(40.93
±
2.58％)(p《0.05)。
50.图4为添加wnt2后对囊胚细胞总数数、内细胞团细胞数和滋养层细胞数的影响统计结果，从图中可见，体外胚胎培养液中添加wnt2后囊胚细胞总数(71.8
±
10.0)与对照组(71.8
±
12.1)没有显著差异(p＝0.997)，内细胞团细胞数(13.72
±
3.69)显著高于未添加wnt2的对照组(16.33
±
4.96)(p《0.05)，内细胞团细胞数与滋养层细胞数比例(31.50
±
13.39)显著高于未添加wnt2的对照组(24.44
±
7.79％)(p《0.05)。
51.表1为添加wnt2对胚胎移植后胚胎发育能力的影响统计结果
[0052][0053]
从表1中可见，体外胚胎培养液中添加wnt2后获得的囊胚，经胚胎移植后，附植率(82.87
±
15.33％)和活胎儿率(39.81
±
17.25％)显著高于未添加wnt2对照组的(66.13
±
23.37％)和(30.11
±
13.50％)(p《0.05)。
[0054]
综上所述，本发明通过在体外培养液中添加wnt2蛋白以激活wnt信号通路的方法有效提高体外受精胚胎囊胚率，改善体外受精胚胎发育潜能，提高体外受精胚胎的附植率和活胎儿率，有效提高了体外胚胎生产效率。

技术特征：
1.一种wnt2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的应用，其特征在于，其是通过增强体外受精胚胎中wnt信号通路活性来提高体外受精胚胎的发育效率和质量。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增强体外受精胚胎中wnt信号通路活性是通过在胚胎培养液中添加wnt2蛋白来实现。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，使用含有wnt2蛋白的体外培养液对体外受精后的胚胎进行培养。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述wnt2蛋白的作用浓度为10-100ng/ml。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，体外培养液为ksom+aa。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体外受精胚胎为哺乳动物体外受精胚胎。7.wnt2蛋白在改善哺乳动物体外受精胚胎发育效率和质量中的应用。8.wnt2蛋白在制备用于提高哺乳动物体外受精胚胎发育效率和质量的体外培养基中的应用。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述wnt2蛋白在体外培养基中的浓度为10-100ng/ml。

技术总结
本发明提供了一种WNT2用于提高体外受精胚胎发育效率和质量的新用途，其是通过增强体外受精胚胎中WNT信号通路活性来提高体外受精胚胎的发育效率和质量。具体是将获得的受精卵转移到添加合适浓度WNT2的培养液中进行体外培养，有效提高IVF囊胚率，改善发育潜能，提高胚胎移植后的附植率和出生率。体外胚胎生产效率低是制约家畜体外胚胎生产乃至人类辅助生殖技术发展的关键因素。本发明中使用的WNT2是一种由哺乳动物输卵管分泌的内源性的天然蛋白因子，作用通路和靶点明确，确保了其在IVF应用方面的安全性。因此本发明为改善家畜及人类体外胚胎生产效率和质量的提供了一个有效、安全、可行的策略。可行的策略。


技术研发人员：田见晖 初美强 姚富升 郝佳 安磊 席广银 张镜宇 刘娟 郭敏 李琴
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/21