一种高效阻断巨噬细胞焦亡的纳米中药及其在抗肺纤维化方面的应用

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及一种可高效阻断巨噬细胞焦亡的纳米中药的构建及其在抗肺纤维化方面的应用。
技术背景
2.肺纤维化(pf)是一种进行性的间质性肺病。患者的中位生存期为2～4年，被称为“类肿瘤疾病”。随着对新冠病毒的深入研究，数据表明多数重症患者会出现不同程度的肺纤维化。作为重要的后遗症之一，pf会严重影响肺功能，最终造成呼吸衰竭甚至死亡。尽管肺移植是唯一可以治愈肺纤维化的方法，但因其价格昂贵、存在免疫排斥及感染等风险，难以推广。大多数患者只能采用吡非尼酮(pfd)和尼达尼布两种fda批准的药物进行姑息治疗，收效甚微。因此有必要开发新的药物制品以改善pf患者的临床获益。
3.细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，可由炎症小体介导，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。越来越多的证据表明，巨噬细胞焦亡可以上调炎症反应水平，引发免疫反应失控，加快纤维化疾病的发展进程。研究表明，在pf患者的支气管肺泡灌洗液(balf)中，caspase-1和il-1β水平均显著升高。肺泡巨噬细胞在抵御微生物和空气中颗粒的过程中，启动了先天免疫反应和宿主防御机制。nlrp3炎症小体形成，激活caspase-1裂解穿孔蛋白gasdermin d(gsdmd)在质膜上形成大孔，从而促进肺泡巨噬细胞焦亡。相关炎症因子渗漏，使纤维生成应激信号持续存在。因此，抑制巨噬细胞焦亡及相关信号通路进而调控炎症微环境可能为pf提供一种新的免疫治疗策略。
4.芒柄花黄素(fmn)是富含于中药黄芪中的一类植物雌激素，具有抗炎、抗肿瘤、调节脂质代谢、等药理学作用。研究发现fmn可通过对ros-txnip-nlrp3通路的抑制改善大鼠心肌缺血/再灌注损伤，并且在结肠炎中应用可以显著降低巨噬细胞中nlrp3和il-1β的水平。因此fmn有望作为潜在的巨噬细胞焦亡抑制剂达到治疗肺纤维化的目的，是合理的药物选择。
5.然而fmn较强的疏水性和较差的口服生物利用度，导致药物在体内代谢快，稳定性差。这些缺点使fmn在pf中的治疗存在许多问题。因此需要借助合适的药物递送策略，准确高效地使药物在病灶部位发挥效果。
6.sparc蛋白(酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白)是调节细胞与其周围细胞外基质(ecm)相互作用的基质细胞分子，支配着细胞粘附、增殖与分化等基本功能。研究表明，sparc蛋白在动脉粥样硬化、纤维化病变和各种侵袭性癌症的微环境中过表达，在肺部疾病中sparc通过促进微血管重塑和ecm蛋白的过度沉积来驱动非小细胞肺癌和特发性肺纤维化的病理反应。这也使纳米药物在肺纤维化病灶部位的主动靶向策略成为可能。研究发现肿瘤微环境中高表达的sparc蛋白与bsa具有高度的天然亲和力，促使了白蛋白结合型紫杉醇作为市场上第一种基于纳米技术的抗肿瘤药物的诞生。但利用pf肺间质微环境中sparc
过表达来进行有效的抗pf治疗策略尚未见报道。
7.cn108853083a提供了芒柄花黄素在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。然而由于疏水性和机体代谢作用，口服芒柄花黄素在血液和组织中的浓度较低，疗效受限，为提高治疗效果需高浓度、频繁给药，而这通常会导致严重的不良反应。
8.基于以上分析，我们拟制备载有fmn的白蛋白纳米药物，并探索其作为抗肺纤维化治疗的药效和潜在机制。


技术实现要素：

9.本发明的目的是构建一种能够高效阻断巨噬细胞焦亡的纳米中药，根据天然产物fmn的理化性质，以bsa为载体，构建合理尺寸的承载fmn的纳米中药fmn@bsa nps，通过阻断巨噬细胞焦亡，达到靶向治疗肺纤维化的目的。
10.本发明采用反溶剂沉淀法诱导fmn与bsa通过分子间氢键和疏水作用力，自组装成为纳米粒，提升药物负载含量的同时，避免了小分子在体内的快速清除和全身副作用。
11.本发明探究肺纤维化病灶sparc蛋白高表达的病理微环境，并凭借sparc与bsa高亲和性原理，评估fmn@bsa nps通过尾静脉注射在体内的实现肺部靶向给药的可行性。
12.本发明所采用的细胞为小鼠大腿骨髓中提取并诱导分化的原代巨噬细胞bmdms。所选用的博来霉素(blm)诱导小鼠肺纤维化模型为经典造模方式。
13.本发明描述了纳米中药的制备方法，以及相关的制剂表征、体内靶向性评价及药效学评价。
14.本发明通过共聚焦显微镜、免疫蛋白印迹等实验证明构建的fmn@bsa nps作为潜在的焦亡抑制剂，通过干预caspase-1/gsdmd途径，阻断脂多糖(lps)和尼日利亚菌素(nigericin)引发的巨噬细胞焦亡。
15.本发明通过综合药效实验证明该纳米中药对肺纤维化模型小鼠具有显著抗炎抗纤维化效果，具有良好的体内用药安全性，显著延长动物的生存期。
16.具体而言，本发明提供如下技术方案：
17.一种高效阻断巨噬细胞焦亡的中药纳米粒在制备靶向治疗肺纤维化药物的应用，其将牛血清白蛋白(bsa)作为载体、承载天然产物芒柄花黄素(fmn)，形成fmn@bsa nps。
18.所述的中药纳米粒，fmn和bsa通过分子间氢键作用和疏水作用力自组装构成的纳米粒：
[0019][0020]
所述的中药纳米粒，通过静脉注射方式给药，bsa赋予纳米中药长循环的特性，具有良好的生物相容性。
[0021]
所述的中药纳米粒，基于肺纤维化病灶高表达sparc蛋白与bsa的高亲和性原理，实现药物的肺部靶向递送。
[0022]
所述的中药纳米粒，fmn@bsa nps作为焦亡抑制剂，阻断gsdmd介导的巨噬细胞焦亡，抑制相关炎症纤维化信号网络。
[0023]
所述的中药纳米粒，在肺纤维化动物模型中，纳米中药发挥优异的抗炎抗纤维化效果，显著延长动物生存期。
[0024]
所述的中药纳米粒，其中fmn和bsa的质量比为：1-20:10-60，优选质量比为1:20。
[0025]
所述的中药纳米粒，通过反溶剂沉淀法进行制备，避免了药物辅料对生物体的伤害，改善了fmn的疏水性。
[0026]
所述的中药纳米粒，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn和bsa分别溶解于合适溶剂；2)将fmn溶液逐滴滴加到bsa溶液中，搅拌；3)向混合液中滴入有机溶剂，搅拌；4)透析，冻干即得。
[0027]
所述的中药纳米粒，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn和bsa分别溶解于合适溶剂dmso和ddh2o；2)将fmn溶液逐滴滴加到bsa溶液中，搅拌；3)向混合液中滴入etoh，搅拌；4)透析，冻干即得。
[0028]
所述的中药纳米粒，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn、bsa分别溶解于dmso和ddh2o中涡旋振荡；2)在强烈搅拌下将含fmn的dmso溶液(5mg/ml)逐滴滴加到bsa水溶液(30mg/ml)中，避光室温搅拌3h；3)用自动注射泵以1ml/min的速度向混合液中滴入2ml etoh，搅拌3h；4)转移至20kda的透析袋中透析48h，去除游离的药物和有机溶剂，随后冻干秤重，用无菌pbs重新分散后至于4℃保存备用。
附图说明
[0029]
图1是fmn：bsa重量(w：w)的单因素筛选实验
[0030]
综合粒径、pdi和载药量，最终确定最佳投料比是fmn：bsa＝1:20(w:w)。
[0031]
图2是纳米中药的表征
[0032]
图a是fmn@bsa nps的粒径分布图和照片
[0033]
图b是fmn@bsa nps不同浓度的紫外吸收光谱图
[0034]
图c(
ⅰ
)是fmn@bsa nps的扫描电镜图
[0035]
(
ⅱ
)是fmn@bsa nps的透射电镜图
[0036]
注：比例尺：100nm。
[0037]
图3是纳米中药在体外抑制巨噬细胞发生焦亡的结果
[0038]
图a是control、lps、lps+nigericin、lps+nigericin+fmn@bsa、lps+nigericin+z-vad-fmk处理后pi标定的细胞内容物暴露情况，并于明场视野合并观察细胞焦亡气球样变的情况。
[0039]
图b是control、lps、lps+nigericin、lps+nigericin+fmn@bsa、lps+nigericin+z-vad-fmk处理后细胞焦亡相关蛋白gsdmd-n、cleaved-caspase-1的表达情况及定量分析。
[0040]
注：*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。比例尺：20μm。
[0041]
图4是纳米中药的体内靶向性结果
[0042]
图a是健康小鼠和pf小鼠肺组织中sparc蛋白的表达情况及定量分析结果。图b是did-fmn@bsa和did-fmn@bsa+block处理后pf小鼠活体主要器官did的荧光变化图像。
[0043]
图c是did-fmn@bsa和did-fmn@bsa+block处理后pf小鼠活体主要器官did的荧光
定量分析。
[0044]
注：*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
[0045]
图5是纳米中药的体内药效学评价
[0046]
图a是pbs、blm、blm-fmn@bsa和blm-pfd治疗后小鼠肺组织的苏木精-伊红(h&e)染色情况。
[0047]
图b是pbs、blm、blm-fmn@bsa和blm-pfd治疗期间小鼠的体重变化曲线。图c是pbs、blm、blm-fmn@bsa和blm-pfd治疗后小鼠肺组织的羟脯氨酸含量。图d是pbs、blm、blm-fmn@bsa和blm-pfd治疗后小鼠40天内的生存曲线分析。注：*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。比例尺：100μm。
具体实施方式
[0048]
实施例1：纳米中药的制备与表征
[0049]
通过反溶剂沉淀法诱导fmn与bsa自组装，制备纳米中药fmn@bsa nps。首先将fmn、bsa分别溶解于dmso和ddh2o中涡旋振荡，在强烈搅拌下将含fmn的dmso溶液(5mg/ml)逐滴滴加到bsa水溶液(30mg/ml)中，避光室温搅拌3h，随后用自动注射泵以1ml/min的速度向混合液中滴入2ml etoh，搅拌3h后转移至20kda的透析袋中透析48h，去除游离的药物和有机溶剂，随后冻干秤重，用无菌pbs重新分散后至于4℃保存备用。荧光染料did标记的fmn@bsa是通过上述类似的程序获得的，在fmn与bsa自组装的过程中加入了含did的乙醇溶液。随后通过透射电镜和扫描电镜分别对fmn@bsa nps的形态进行观测。用dls动态光散射检测仪(英国malvern公司)测量fmn@bsa nps的流体力学直径、pdi。通过紫外分光光度计(美国perkinelmer公司)在270、300-330nm处分别观测nps中的bsa和fmn的特征峰。为了量化装载fmn的能力，将fmn@bsa溶于2ml dmso/乙醇(9:1，v/v)的混合溶液中，并超声处理10分钟以完全提取fmn。通过高效液相色谱(美国aglient公司)检测fmn的浓度，并计算负载和封装效率。
[0050]
ee(％)＝(纳米粒中的药物含量)/(投入药物的总量)
×
100％。
[0051]
lc(％)＝(纳米粒中的药物含量)/(纳米粒总重量)
×
100％。
[0052]
结果显示：纳米中药fmn@bsa nps粒径均一，分布稳定，pdi为0.122，水合粒径尺寸为148.8nm。fmn@bsa nps的外观成白色乳液状，激光照射后有明显的丁达尔效应，符合纳米级颗粒特性(图2a)。紫外图谱分析显示(图2b)，fmn@bsa nps在270nm的紫外吸收峰与bsa相符，说明纳米粒具有白蛋白的结构特征，fmn@bsa在300-330nm附近可见fmn的紫外吸收带，提示白蛋白成功加载fmn。图2c显示fmn@bsa nps在扫描电镜和透射电镜的拍摄下均呈球形均匀分布，粒径尺寸在120-150nm之间。高效液相色谱法检测fmn的包封率和载药率分别为52.5％和4.75％。
[0053]
实施例2：纳米中药在体外抑制巨噬细胞发生焦亡
[0054]
我们采用lps+nigericin刺激bmdms的方式，构建巨噬细胞焦亡模型，并探究fmn@bsa nps抑制巨噬细胞焦亡的作用。bmdms被置于共聚焦皿中(5
×
105个细胞/皿)，并在完全培养基中37℃下培养过夜。首先用超纯lps(100ng/ml)刺激bmdms 3小时，并加入指定剂量的fmn@bsa(fmn 50μm)或阳性对照药z-vad-fmk预孵育1小时，最后用尼日利亚菌素(10μm)刺激2小时。随后在室温下用碘化丙碇pi和hoechst 33342染料分别标记焦亡细胞以及细胞
核。在共聚焦显微镜(德国leica公司)下观察荧光及明场图像并拍照。
[0055]
同时在体外实验中对bmdms的焦亡相关蛋白(gsdmd-n、cleaved-caspase-1)进行蛋白免疫印迹分析。收集如上述不同处理后的细胞，用裂解缓冲液进行总蛋白提取。将不同样品的等量蛋白质装入sds-聚丙烯酰胺凝胶以分离目标蛋白质。随后将蛋白转移到pvdf膜上，经过封闭后与一抗在4℃下孵育过夜，在二抗中室温下孵育2小时。最后，用ecl免疫印迹底物检测条带成像，并使用image j软件进行量化分析。
[0056]
结果显示：如图3a所示，我们用pi染色显示焦亡的细胞，并用共聚焦显微镜观测荧光和细胞明场下的形态。lps+nigericin导致的细胞膜完整性丧失使pi阳性细胞数量增多，同时出现细胞气球样变。而lps+nigericin+fmn@bsa组pi阳性细胞数量明显减少，且未出现细胞气球样改变。western blot结果如图3b所示，lps+nigericin处理后，gsdmd-n和cleaved-caspase-1的表达量显著升高，在fmn@bsa nps预孵育后表达量相应降低。以上结果表明，纳米中药fmn@bsa nps具有抑制巨噬细胞焦亡的能力，通过阻断caspase-1/gsdmd依赖的焦亡通路而对bmdms起到保护作用。
[0057]
实施例3：纳米中药的体内靶向性结果
[0058]
6至8周大的雄性c57小鼠被用来构建博莱霉素(blm)诱导的肺纤维化模型。简而言之，小鼠被麻醉后行气管切开术，利用微量液体雾化装置气管内滴灌50μl含blm的pbs溶液，单次剂量为2.5u/kg。健康对照组用同样方式给予50μl pbs溶液(n＝3)。小鼠肺组织样本于造模后第九天取出，进行匀浆提蛋白，检测sparc蛋白含量，采用前述western blot方法进行检测并进行定量分析。另取一批pf模型小鼠，于造模第九天尾静脉注射100μl荧光标记的did-fmn@bsa nps(did 1mg/ml)。同时设立sparc-block组作为对照，提前1h腹腔注射50μg/只anti-sparc抗体。分别于1、2、4、8、12、24小时使用ivis小动物活体成像系统(美国perkinelmer公司)无创地监测纳米粒在体内的生物分布行为。在注射24小时后分别取上述两组小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行体外拍摄各组织荧光分布情况，并通过living image软件半定量分析。
[0059]
结果显示：考虑到pf的病理生理特征，我们通过western blot检测健康小鼠和pf模型小鼠肺组织中sparc的表达情况。图4a显示，pf模型小鼠肺组织中sparc含量明显高于健康小鼠，通过image j软件定量分析后，表达水平约为健康小鼠的2倍。以上结果表明sparc在pf肺组织中过表达，这也使纳米药物在pf病灶部位的主动靶向策略成为可能。ivis小动物活体成像结果如图4b所示，注射did-fmn@bsa小鼠的肺部荧光信号随时间增长逐渐增大，且在8h荧光信号强度达到峰值，而sparc和bsa之间结合被阻断的did-fmn@bsa+block组小鼠肺内粒子的积累和保留明显受损。did-fmn@bsa在pf模型小鼠肺组织中持续地积累归因于sparc与bsa之间的高亲和力。值得注意的是，通过阻断sparc和bsa之间的相互作用，nps在pf肺中的积累并没有完全消除，它可能仍然受到炎症环境代谢上调导致白蛋白需求增加的影响。在24h后各组织荧光分布情况如图4c所示，did-fmn@bsa组小鼠的肺组织荧光强度最高，约是did-fmn@bsa+block组的2.2倍。
[0060]
实施例4：纳米中药的体内药效学评价
[0061]
为了评估纳米中药作为抗肺纤维化药物的有效性，我们对fmn@bsa nps在blm诱导的pf小鼠模型中的治疗效果进行了详细研究。小鼠被随机分为四组，pf模型小鼠造模方法如前，对照组用同样方式给予50μl pbs溶液。造模5天后，小鼠开始接受尾静脉注射fmn@bsa
(fmn 10mg/kg)和阳性对照药吡非尼酮(pfd 10mg/kg)的治疗，每2天一次(n＝13)。在第21天，每组5只小鼠被牺牲，并收集样本作进一步分析。剩余8只观察生存期至造模后40天结束。造模和治疗期间记录各组小鼠的体重变化，每三天称量一次。收集的小鼠肺组织用4％多聚甲醛固定48小时以上，石蜡包埋后切片，进行h&e染色，用倒置显微镜观察肺组织炎症和胶原沉积程度。肺内羟脯氨酸含量检测方法遵循hyp检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)的说明书。
[0062]
结果显示：通过对小鼠右肺中叶h&e染色切片的扫描拍摄(图5a)，我们发现blm刺激导致严重的肺泡出血、水肿、肺泡间隔增厚和炎症细胞浸润，而blm-fmn@bsa组小鼠这些改变显著减少。体重变化结果如图5b所示，与假手术组小鼠相比，blm组的平均体重21天后显著下降，由23.6g变为17.3g。经pfd治疗的模型小鼠平均体重由23.5g变为21.9g，虽轻微改善了blm引起的体重下降，但由于pfd固有的胃肠及肝肾毒性，小鼠全身状态仍较差。而经fmn@bsa nps处理的小鼠平均体重变化不明显且有上升趋势，与pfd组相比具有统计学差异，证明了fmn@bsa治疗的有效性及体内安全性。羟脯氨酸(hyp)在胶原蛋白中含量最高，通过对hyp的测定，可了解组织中胶原沉积情况。作为评判纤维化程度的重要指标，hyp含量结果如图5c所示，相较于pbs组，blm组小鼠肺组织中hyp含量增加了约2倍，达到0.72μg/mg。经fmn@bsa治疗后，hyp含量降低为0.48μg/mg。kaplan-meier生存曲线如图5d所示，未经治疗的blm组小鼠在32天内全部因肺纤维化导致了急性呼吸衰竭并死亡。而fmn@bsa和pfd治疗均可显著延长pf模型小鼠的生存时间，其中blm-fmn@bsa小鼠存活率达到50％，高于pfd的25％，我们猜测其原因是fmn@bsa具有更好的生物相容性。以上结果均表明fmn@bsa nps可以减少pf肺组织中的胶原沉积，有效延缓肺纤维化的进展，这些结果支持fmn@bsa nps作为一种潜在的新型抗肺纤维化药物的应用。

技术特征：
1.一种高效阻断巨噬细胞焦亡的中药纳米粒在制备靶向治疗肺纤维化药物的应用，其将牛血清白蛋白(bsa)作为载体、承载天然产物芒柄花黄素(fmn)，形成fmn@bsanps。2.权利要求1所述的应用，其中fmn和bsa通过分子间氢键作用和疏水作用力自组装。3.权利要求1所述的应用，其中所述药物通过静脉注射方式给药。4.权利要求1所述的应用，其中fmn和bsa的质量比为：1-20:10-60。5.权利要求1所述的应用，其中fmn@bsanps通过反溶剂沉淀法进行制备。6.权利要求1所述的应用，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn和bsa分别溶解于合适溶剂；2)将fmn溶液逐滴滴加到bsa溶液中，搅拌；3)向混合液中滴入有机溶剂，搅拌；4)透析，冻干即得。7.权利要求1所述的应用，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn和bsa分别溶解于合适溶剂dmso和ddh2o；2)将fmn溶液逐滴滴加到bsa溶液中，搅拌；3)向混合液中滴入etoh，搅拌；4)透析，冻干即得。8.一种中药纳米粒在制备高效阻断巨噬细胞焦亡的药物的应用，其将牛血清白蛋白(bsa)作为载体、承载天然产物芒柄花黄素(fmn)，形成fmn@bsanps。9.权利要求1-8任一项所述的fmn@bsanps的制备方法，其制备方法包括以下步骤：1)将fmn和bsa分别溶解于合适溶剂；2)将fmn溶液逐滴滴加到bsa溶液中，搅拌；3)向混合液中滴入有机溶剂，搅拌；4)透析，冻干即得。10.权利要求9所述的制备方法获得的中药纳米粒。

技术总结
本发明提供了一种可阻断巨噬细胞焦亡的纳米中药及其在抗肺纤维化方面的应用。载有芒柄花黄素的白蛋白纳米药物，基于白蛋白对肺纤维化微环境SPARC蛋白的亲和特性，靶向抵达病灶部位并被巨噬细胞捕获。天然产物芒柄花黄素通过抑制GSDMD介导的巨噬细胞焦亡，下调相关炎症纤维化网络，显著延长生存期，降低药物的毒副作用，为肺纤维化的治疗提供了有价值的机制和有前途的治疗策略。制和有前途的治疗策略。制和有前途的治疗策略。


技术研发人员：董竞成 欧阳博书 魏颖 王纳
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/21