具有高产γ-氨基丁酸功效的乳酸片球菌ZJUIDS17及其应用

具有高产
γ-氨基丁酸功效的乳酸片球菌zjuids17及其应用
技术领域
1.本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及具有高产γ-氨基丁酸功能的乳酸片球菌zjuids17及应用。


背景技术：

2.根据世界卫生组织统计，全球睡眠障碍率达27％。2022年世界睡眠日前夕，中国睡眠研究会等机构发布《2022中国国民健康睡眠白皮书》。调查显示，近3/4受访者曾有睡眠困扰，入睡困难成头号问题。19岁至35岁的青壮年，是睡眠问题高发年龄段。
3.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,gaba)也被称为氨络酸，是一种普遍存在于动植物和微生物中的天然氨基酸，它由谷氨酸通过谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,gad)催化转化而来，在人类哺乳动物中枢神经系统中，这种非蛋白构成的天然氨基酸是一种关键的抑制性神经递质。大量的研究表明，γ-氨基丁酸具有改善大脑细胞代谢、增强免疫力、减少焦虑、改善睡眠等生理功能。目前合成γ-氨基丁酸的方法主要有化学法和生物法两大类，生物法包括植物富集和微生物发酵两种方法，微生物由于生长周期短、繁殖速度快，近几年被广泛运用于生产γ-氨基丁酸。
4.乳杆菌与人类生活密切相关，是广泛应用于食品及饲料发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域的有益微生物之一。乳酸菌的生物学和医学功能决定了其在食品工业中的重要作用，因此今后在保健食品行业也有广阔的发展空间。
5.201710760851的发明《一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用》，提供副短乳杆菌hx12-19(lactobacillus parabrevis hx12-19)，保藏编号为cctccm2017307。副短乳杆菌hx12-19是从食品材料中分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物γ-氨基丁酸，显著提升生产效率，降低成本，发酵产率可达235g/l，具有生产竞争力；产品采用结晶法精制，纯度可达98％，副短乳杆菌hx12-19适合工业化生产。
6.201910169739的发明《一株产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株及其筛选方法和富含γ-氨基丁酸仙草酸奶的制备方法》提供了一种短乳杆菌pdd-2株，分类命名为lactobacillus brevis，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.15954。与单一的乳酸菌发酵或酶解相比，酸奶产品中γ-氨基丁酸含量达到530～850mg/l。


技术实现要素：

7.本发明要解决的问题是提供一株具有较高产γ-氨基丁酸能力的乳酸片球菌zjuids17((pediococcus acidilactici zjuids17)及其应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供一种乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17，其保藏号为cgmcc no.26163。
9.所述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17的16s rdna全序列如图
11所示。
10.本发明还同时提供了上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17的用途：制备具有高产γ-氨基丁酸功能的活菌制剂。
11.作为本发明的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17的用途的改进：制备具有改善睡眠障碍功能的产品(包括食品、药物、保健品及饲料)；包括制备具有改善睡眠障碍功能的发酵果蔬汁，制备具有改善睡眠功能的发酵酸奶和酸肉。
12.本发明的菌株zjuids17，保藏名称为乳酸片球菌pediococcus acidilactici，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.26163，保藏时间2022年11月21日。
13.本发明从母乳喂养婴儿粪便中筛选出一株乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)，通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合16s rdna测序等对该菌株进行了鉴定。
14.本发明所提供的乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)的菌落形态学特征为：在mrs琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.3-1.5mm。菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑。其菌体形态特性为：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，细胞圆球状。在mrs培养基上菌落小，呈白色。一般细胞成对生，不成链状排列。
15.本发明所提供的乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)具有较强的胆盐水解酶活力。
16.本发明所提供的乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)能耐受胃肠道环境、培养液有抗生素敏感性、抑制肠内有害的病原菌。
17.与现有的乳酸片球菌相比，本发明的乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)具有如下优势：首先本发明的菌株发酵液中γ-氨基丁酸含量高。本发明的菌株具有更好的抗菌(具有广谱抗菌能力)和抗生素敏感性，表明该菌株对抗生素敏感，对人体更安全。本发明的菌株还具有自凝集粘附等性能，更容易在肠道存活并粘附，且安全性更高。
18.需要说明的是：
19.lactobacillus parabrevis与pediococcus acidilactici的区别在于属于不同的乳酸菌属，前者属于乳杆菌属，细胞形态多样，长形、细长状、弯曲形及短杆状，耐氧或微好氧菌，单个存在或呈链状排列；后者属于片球菌属，球菌，成对或四联状排列，罕见单个细胞，不形成链状，不运动，不形成芽孢，兼性厌氧，同型发酵产生乳酸。
20.lactobacillus brevis与pediococcus acidilactici的区别在于属于不同的乳酸菌属，前者为乳杆菌属下的短乳杆菌，细胞形态多样，长形、细长状、弯曲形及短杆状，耐氧或微好氧菌，单个存在或呈链状排列；后者属于片球菌属。
21.本发明的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17产γ-氨基丁酸能力均高于上述背景技术所涉及菌株。
22.乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)目前主要的用途包括产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡等；在动物体内对病原微生物有拮抗作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。但是上述用途与本发明所述的产γ-氨基丁酸无关联
性。
23.本发明较其他常规乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)具有γ-氨基丁酸产量高的性能，具有开发改进睡眠功能产品的潜能。
24.综上所述，本发明的乳酸片球菌zjuids17是一种功能性乳酸菌，在体外有较高的产γ-氨基丁酸能力。同时，具有较强的胆盐水解酶活力。此外，本发明菌株具有较强的耐酸和胆盐性、表面疏水性、培养液无抗生素耐性、抑制肠内有害的病原菌，证明该菌株具有良好的益生特性。因而乳酸片球菌zjuids17具有开发改善睡眠功能益生产品的潜能。
附图说明
25.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
26.图1为乳酸片球菌zjuids17的菌落形态图。
27.图2为乳酸片球菌zjuids17革兰氏染色的菌体形态图。
28.图3为乳酸片球菌zjuids17的16s rdna的电泳鉴定图；
29.注：m从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。
30.图4为高效液相色谱法γ-氨基丁酸产量标准曲线；
31.图4中，ⅰ代表对照品中2,4-二硝基氟苯(fdnb)含量；ⅱ代表对照品中gaba衍生物含量。
32.图5为高效液相色谱法γ-氨基丁酸产量；
33.说明：最左为乳酸片球菌zjuids17；其他菌株均为实验室中保藏的菌株，从婴儿粪便或泡菜中提取。菌种包括发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌等八种乳酸菌。
34.图6为试剂盒法γ-氨基丁酸(gaba)含量标准曲线。
35.图7为试剂盒法γ-氨基丁酸(gaba)含量；
36.说明：最左为乳酸片球菌zjuids17；其他菌株均为实验室中保藏的菌株，从婴儿粪便或泡菜中提取。菌种包括发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌等八种乳酸菌。
37.图8为乳酸片球菌zjuids17上清液、菌体抗金黄色葡萄球菌效果图；
38.下左为上清液，下右为菌体。
39.图9为乳酸片球菌zjuids17上清液、菌体抗大肠杆菌效果图；
40.下左为上清液，下右为菌体。
41.图10为乳酸片球菌zjuids17对抗生素敏感性的平板示例；
42.上左为空白对照，顺时针依次为空白对照、青霉素、乳酸片球菌zjuids17上清液抗大肠杆菌、瑞士乳杆菌nm4302上清液抗大肠杆菌、空白。
43.图11为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17的16s rdna全序列。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
45.实施例1、乳酸片球菌zjuids17的筛选及鉴定：
46.1.乳酸片球菌zjuids17的筛选
47.1.1样品来源
48.本发明所使用的菌株分离自杭州地区母乳喂养婴儿的粪便，样品共采集20份。
49.1.2菌株的分离纯化
50.取大约5g新鲜样品用无菌管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1g样品放入9ml的mrs肉汤培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养(有氧培养)48h；然后在超净台中吸取富集液1ml，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-6
、10-7
、10-8
三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μl涂于mrs琼脂培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在mrs琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到mrs肉汤培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的mrs肉汤培养基中于-80℃冷冻保存。
51.选定发酵液中γ-氨基丁酸含量最高的乳酸片球菌zjuids17。
52.2.乳酸片球菌zjuids17的鉴定
53.2.1菌落特征
54.乳酸片球菌zjuids17在mrs琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.5mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑，见图1。
55.2.2显微镜下形态：
56.乳酸片球菌zjuids17菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，细胞圆球状，细胞成对生，不成链状排列，见图2。
57.2.3 16s rdna鉴定
58.用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取目标菌株基因组dna，将提取的乳酸菌基因组dna作为pcr扩增的模板，采用细菌通用引物27f和1492r进行16s rdna的pcr实验，pcr反应扩增结束后，取pcr产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kbp左右，见图3。将pcr产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，结果如图11所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，结果显示该序列与乳酸片球菌的16s rdna序列同源性超过99％。
59.将菌株zjuids17的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌zjuids17为乳酸片球菌zjuids17(pediococcus acidilactici zjuids17)。
60.本发明的菌株zjuids17，保藏名称为乳酸片球菌pediococcus acidilactici，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.26163，保藏时间2022年11月21日。
61.实施例2、乳酸片球菌zjuids17产γ-氨基丁酸能力的确认
62.1.菌株发酵液的制备
63.将于甘油管中保存的菌株
‑‑‑‑
乳酸片球菌zjuids17先在mrs琼脂平板上划线活化2-3次，然后挑取单菌落在15ml的mrs肉汤培养基中扩大培养18h(温度37℃)，在mrs液体培养基中活化两次。
64.震荡均匀后用移液枪吸取200μl，接种于含有质量浓度为1％ l-谷氨酸的mrs肉汤培养基(mrs液体培养基)15ml中，37℃恒温培养箱中培养48h。发酵液于4℃、12000r/min离心8min收集发酵上清液。用无菌注射器将上清液经过0.22μm滤膜过滤，分别用高效液相色谱法(hplc)和gaba含量试剂盒检测法检测γ-氨基丁酸含量。
65.所有菌种(如图5)做3个平行，每组实验重复3次，同时以不接菌的含有1％l-谷氨酸的mrs肉汤培养基作阴性对照。
66.2.菌株及发酵液产γ-氨基丁酸能力测定
67.2.1高效液相色谱法(hplc法)
68.γ-氨基丁酸可以与邻苯二甲醛进行定量反应，该反应会生成异吲哚衍生物，具有较强荧光可被紫外线吸收，因此可以通过具有紫外检测器的高效液相色谱仪对发酵上清液进行定量的检测。γ-氨基丁酸含量的测定方法按照张健等的方法稍作修改。
69.用超纯水与gaba对照品制成精确的1g/l的对照品溶液，于10ml棕色瓶中精密量取一定质量浓度的gaba标准溶液1ml，再依次加入1毫升0.5mol/l碳酸氢钠溶液(ph 9.0)、1％(质量％)的2，4-二硝基氟苯(fdnb)、0.2毫升乙腈，置于60℃水浴锅中避光加热30min，冷却后添加ph 6.8的磷酸盐缓冲液至溶液总体积为10ml，混匀，10 000r/min离心15min，经0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液。发酵液于4℃、12000r/min离心8min收集发酵上清液。用无菌注射器将上清液经过0.22μm滤膜过滤到液相色谱样品瓶(2ml)中。分别对γ-氨基丁酸标品和待测样品进行紫外检测。
70.取浓度为0.01、0.02、0.06、0.08、0.1g/l的gaba标准溶液，按照以上条件进行检测，以γ-氨基丁酸质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，根据样品峰面积得到发酵液中γ-氨基丁酸的含量。
71.图4为高效液相色谱法γ-氨基丁酸产量标准曲线；图5为高效液相色谱法γ-氨基丁酸产量。
72.根据图5，可获得以下总结性结论：乳酸片球菌zjuids17的发酵液中γ-氨基丁酸含量最高，为2.06mg/g，且显著高于试验中所涉及的其他乳酸菌。
73.2.2γ-氨基丁酸(gaba)含量试剂盒
74.γ-氨基丁酸在碱性溶液中与次氯酸盐和苯酚反应生成蓝绿色物质，通过检测该有色物质在645nm波长处的值即可得出样本中γ-氨基丁酸的含量。
75.标准曲线制作：标准品临用前加1ml蒸馏水溶解制标准品母液(2mg/ml)，把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2mg/ml，也可根据实际样本来调整标准品浓度。按照测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
76.图6为试剂盒法γ-氨基丁酸(gaba)含量标准曲线；图7为试剂盒法γ-氨基丁酸(gaba)含量。
77.γ-氨基丁酸(gaba)含量试剂盒中含有1瓶液体提取液60ml，1瓶液体试剂一(40ml)，1瓶液体试剂二(10ml)，1瓶液体试剂三(20ml)，1支粉体标准品，均需在4℃保存。
78.液体样本离心后取上层清液检测，可见分光光度计预热30min，调节波长至645nm，蒸馏水调零。在测定ep管中依次加入100μl样本、60μl试剂一、200μl试剂二、400μl试剂三，在对照ep管中依次加入100μl样本、660μl试剂一，混匀后，95-100℃沸水浴10min，冰浴至室温，呈现蓝绿色颜色。取全部液体转移至1ml玻璃比色皿中，于645nm处读取各管的a值，δa＝a测定-a对照(每个样本需做一个自身对照)。
79.gaba含量(μg/ml)＝[(δa+0.0033)
÷
0.0086]
÷
v1
×d[0080]
＝1162.8
×
(δa+0.0033)
[0081]
式中：v1——样本加入体积，0.1ml；
[0082]
d——稀释倍数。
[0083]
根据图7，可获得以下总结性结论：乳酸片球菌zjuids17的发酵液中γ-氨基丁酸含量最高，且远高于其他乳酸菌。
[0084]
实施例3、乳酸片球菌zjuids17的耐酸性及耐胆盐性的确认
[0085]
1.耐酸实验
[0086]
挑取乳酸片球菌zjuids17单菌落在mrs肉汤培养基15ml中于室温下扩大培养18h，将扩大培养后菌悬液以1％的量接种到mrs肉汤培养基，37℃培养18h后。将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(ph 6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于ph 3.0的mrs肉汤培养基中，将初始活菌数校正至大约1
×
108cfu/ml，37℃培养3h。采用倾注平板法对培养0h和培养3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
[0087][0088]
上式中，n0为测试菌株0h的活菌数(cfu/ml)；n
t
为测试菌株3h的活菌数(cfu/ml)。
[0089]
所得结果如下表1。
[0090]
2.耐胆盐实验
[0091]
将活化扩大后的乳酸片球菌zjuids17菌悬液以1％的量接种到mrs肉汤培养基中，于37℃培养18h后，将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(ph 6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于含胆盐0.3％的mrs肉汤培养基中，将初始活菌数校正至大约1
×
108cfu/ml，37℃培养3h。采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
[0092][0093]
上式中，n0为测试菌株0h的活菌数(cfu/ml)；n
t
为测试菌株3h的活菌数(cfu/ml)。
[0094]
所得结果如下表1。
[0095]
3.如表1所示，乳酸片球菌zjuids17在ph为3.0的mrs培养基中的存活率达139.65％。在含有0.3％的牛胆盐的环境中存活率达90.85％，具备较高的胃肠道生存能力。
[0096]
表1、菌株对酸和胆盐耐受结果
[0097][0098]
实施例4、乳酸片球菌zjuids17的病原菌抑制能力的确认
[0099]
采用国际通用琼脂扩散法测定乳酸菌抗菌活性。将10ml lb琼脂培养基倒入无菌培养皿中，冷却后做为下层培养基。将冻存的指示菌株(大肠杆菌和金黄葡萄球菌)在lb固体培养基上活化2～3次。分别挑取活化好的单菌落于lb培养基中，37℃培养18h。离心收集细菌细胞，重悬于生盐水中使浓度达到108cfu/ml。将指示菌菌悬液按1％(v/v)的量加入冷却至55℃左右的灭菌的lb固体培养基中，混合均匀后倒入培养皿中(15ml/皿)，冷凝后拔掉事先放置的无菌牛津杯。
[0100]
将活化后的乳酸片球菌zjuids17在mrs培养基中室温扩大培养18h后，离心(8000rpm，5min，4℃)后收集上清液，弃去菌体沉淀。将乳酸片球菌zjuids17的代谢上清加入杯孔中(200μl/孔)，并且以磷酸盐缓冲液(ph 6.8)作为空白对照，以0.1mg/ml的青霉素为阳性对照。在37℃下厌氧培养，24h后测量抑菌圈直径。挑选出小孔周围有明显抑菌圈的菌株，测量抑菌圈直径，每个重复三次。图8、图9为乳酸片球菌zjuids17对病原菌抑制能力的平板示例。
[0101]
如表2所示，乳酸片球菌zjuids17的代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定的抑制作用。
[0102]
表2、菌株对病原菌抑制能力的结果
[0103][0104]
经检测，乳酸片球菌zjuids17发酵上清液和菌体沉淀均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑制效果。
[0105]
实施例5、乳酸片球菌zjuids17的抗生素敏感性的确认
[0106]
将培养18h的浓度为108cfu/ml乳酸片球菌zjuids17菌悬液按2％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的mrs琼脂培养基中，充分混合，定量加入15ml/皿。待凝固后，用镊子取药敏纸片放于培养基上。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中培养24h。以无抗生素的纸片为空白对照。测量抑菌圈直径。每个重复三次。图10为乳酸片球菌zjuids17抗生素敏感性的平板示例。
[0107]
乳酸片球菌zjuids17对抗生素感受性抑菌圈直径如表3所示。参考clsi(2017)药敏试验标准可得，乳酸片球菌zjuids17对青霉素g呈现敏感。实验结果表明，乳酸片球菌zjuids17对常见的抗生素敏感。
[0108]
表3、菌株对抗生素敏感性结果
[0109][0110]
注意：药敏性判定标准依据抑菌圈直径(diameter of inhibition zone,diz)执行如下:"不敏感",diz＝0mm；"中敏感",0mm《diz≤16mm；"敏感",diz》16mm；s，敏感；i，中敏感；r，耐药。
[0111]
实施例6、乳酸片球菌zjuids17的抗氧化能力验证
[0112]
1.样品制备
[0113]
将于甘油管中保存的zjuids17菌株在mrs固体培养基上划线分离，37℃倒置培养48h。用接种环挑取单菌落接种于灭菌mrs液体培养基中，37℃静置培养18-24h，得到培养液。将培养液用蒸馏水调整至乳酸菌菌体浓度为10
10
cfu/ml，4℃、8000
×
g离心20min，收集上清液即为发酵上清液。用0.02m pbs缓冲液(ph＝7.4)将离心后的菌体沉淀重悬洗涤，4℃、8000
×
g离心20min，重复3次。将洗涤干净的菌体细胞重悬于pbs缓冲液中，并调整菌体浓度为10
10
cfu/ml，即得到菌体悬液。
[0114]
2.总抗氧化能力测定
[0115]
总抗氧化能力(frap法)需在酶标板中加入150μl tptz工作液(0.3m醋酸-醋酸钠缓冲液、20mm氯化铁溶液、10mm tptz缓冲液，以v:v:v＝10:1:1混合，现用现配)和20μl的样品，振荡混匀，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。将样品测得的吸光度代入硫酸亚铁标准曲线，样品抗氧化能力以硫酸亚铁当量表示(μmol feso4/ml样品)。每个样品做3个平行，计算平均值。
[0116]
硫酸亚铁标准曲线：配制不同质量浓度(0μm、50μm、100μm、200μm、400μm、600μm、800μm)的硫酸亚铁溶液，将不同摩尔浓度的硫酸亚铁溶液、10mm tptz缓冲液、0.3m醋酸盐缓冲液以v:v:v＝1:1:10混合，取170μl混合液加入酶标板，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。以硫酸亚铁质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0117]
3.还原能力测定
[0118]
取1ml样品于离心管中，加入0.2m，ph6.6的pbs溶液及1％(w/v)铁氰化钾溶液各1ml，混匀。50℃水浴20min，冰浴冷却。再加入10％(w/v)三氯乙酸1ml，6000
×
g离心5min，取上清液1ml，加入0.1％(w/v)三氯化铁1ml、蒸馏水1ml，充分混合均匀，静置待其反应10min，测定样品在700nm处的吸光度。用pbs缓冲液或mrs液体培养基代替样品为空白组。每个样品做3个平行，计算平均值。
[0119]
还原能力(％)＝[(a
s-ab)/ab]*100％
[0120]
式中：a
s-样品组吸光度；a
b-空白组吸光度
[0121]
4.dpph自由基清除能力测定
[0122]
配制不同浓度梯度的vc溶液(0-30μg/ml)。在酶标板中加入100μl待测样品(或vc标准溶液)和100μl 0.2mm dpph乙醇溶液(无水乙醇配制,4℃避光保存，现配现用)，摇匀后于室温下避光30min，测定溶液在517nm处的吸光度；用100μl无水乙醇代替100μl dpph乙醇溶液为空白组；用100μl pbs缓冲液(或mrs液体培养基)代替100μl待测样品为对照组，并以100μl pbs缓冲液(或mrs液体培养基)和无水乙醇混合液空白调零。每个样品重复做3个平行，计算平均值。
[0123]
dpph自由基清除能力(％)＝[1-(a
s-ab)/ac]*100％
[0124]
式中：a
s-样品组吸光度；a
b-空白组吸光度；a
c-对照组吸光度。
[0125]
表4、乳酸片球菌zjuids17体外抗氧化性
[0126][0127]
实施例7、利用乳酸片球菌zjuids13制备功能性发酵果蔬汁
[0128]
1.发酵果蔬汁的加工工艺流程：
[0129]
原料
→
清洗
→
闪蒸
→
打浆
→
调配
→
均质
→
灭菌
→
冷却
→
接种
→
密闭发酵
→
后熟
→
灌装
→
冷藏
[0130]
2.操作要点
[0131]
(1)清洗切块：先将南瓜和火龙果清洗、去皮、去切成小块。
[0132]
(2)闪蒸：采用闪蒸的方法灭酶，0.5-1min，121℃处理，迅速排气。
[0133]
(3)打浆：按照南瓜∶水(质量比)＝1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨，进行粗磨和细磨各一次。将火龙果用打浆机打浆至果肉均匀无块状。
[0134]
(4)调配、均质：按南瓜汁15％(v/v)，火龙果汁30％(v/v)，再用蔗糖调节可溶性固形物含量至10
°
brix，加入0.2％(w/v)的稳定剂cmc-na混合均匀，采用两段均质法，先低压(15mpa)，后高压(25mpa)，使瓜肉颗粒直径粒径为2-3um。
[0135]
(5)灭菌、冷却：调配好的复合果蔬汁在100℃下保温10min，冷却至40℃左右。
[0136]
(6)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的乳酸片球菌zjuids17，初始菌数控制在1
×
107cfu/ml。在37℃条件下恒温发酵24h。
[0137]
(7)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中3h。
[0138]
(8)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250ml的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
[0139]
实施例8、利用乳酸片球菌zjuids17制备菌粉
[0140]
1.乳酸片球菌zjuids17菌泥的制备
[0141]
挑取乳酸片球菌zjuids17单菌落接种于50ml含有质量浓度为1％l-谷氨酸的mrs肉汤培养基中，放置37℃厌氧培养箱中培养18h。再次按5％的接种量于250ml含有质量浓度为1％l-谷氨酸的mrs肉汤培养基中活化，放置37℃厌氧培养箱中培养24h。最后将活化好的乳酸片球菌zjuids17以5％接种量于含有质量浓度为1％l-谷氨酸的10l发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、控制ph 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(ph 7.0)漂洗菌体2次。即可得到乳酸片球菌zjuids17菌泥。
[0142]
2.保护剂的制备
[0143]
冻干保护剂含有15％的脱脂乳，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐；水作为溶剂。于110℃灭菌备用。％为质量％。
[0144]
3.乳酸片球菌zjuids17菌粉的制备
[0145]
将上述制备的乳酸片球菌zjuids17菌体沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18-20h后，即可得到乳酸片球菌zjuids17菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得乳酸片球菌zjuids17菌粉中活菌数为1.0
×
10
10-5
×
10
10
cfu/g。
[0146]
实施例9、利用一种具有助眠功效乳酸片球菌zjuids17制备益生菌固体饮料
[0147]
乳酸片球菌zjuids17制备益生菌固体饮料的步骤如下：
[0148]
1.益生菌菌粉的制备：参考实施例8制备乳酸片球菌zjuids17益生菌菌粉。
[0149]
2.固体饮料配方如下：食用玉米淀粉、白砂糖(10％)、低聚果糖(6％)、低聚异麦芽糖(9％)、柠檬酸、食用香精、益生菌菌粉(2-5％)。
[0150]
3.按照配方添加后混合均匀，保证乳酸片球菌zjuids17活菌数在109cfu/g以上。
[0151]
4.按照每小包10/20g进行包装，10-20小包包装成一大包。
[0152]
实施例10、宠物高活性益生菌片剂
[0153]
乳酸片球菌zjuids17制备宠物高活性益生菌片剂的步骤如下：
[0154]
1.活化保存的菌种摇瓶培养:乳酸片球菌zjuids17用灭菌的含有质量浓度为1％l-谷氨酸的鲜牛乳培养，30-37℃培养48-50小时，ph7.0～7.5，100-140℃高压灭活20-30分钟；
[0155]
2.乳酸片球菌zjuids17的一级液以每罐20l扩大培养：接种量均为10％-20％；
[0156]
3.乳酸片球菌zjuids17的二级液均以每罐200l扩大培养：接种量均为10％-20％；
[0157]
4.将上述培养液经离心收集获得菌体，加入0.1％-1％的海藻糖及0.01％-0.1％的vc钠盐，所述百分比为收集获得的湿菌体质量百分比，冻干成菌粉，在冻干的菌粉中加入1％-2％的益生元，所述百分比为冻干的菌粉质量百分比，混合均匀即得益生菌冻干粉剂成品。
[0158]
实施例11、利用乳酸片球菌zjuids17制备功能性酸奶
[0159]
1.酸奶的制备
[0160]
将脱脂奶粉复原乳(质量浓度12％)于115℃高压灭菌20min，作为灭菌脱脂乳；再将商用发酵剂、筛选出的γ-氨基丁酸产量较高的乳酸菌菌体细胞接种到含有质量浓度为1％l-谷氨酸的灭菌脱脂乳中，37℃下培养12-20h，传代2次，作为酸奶发酵剂。
[0161]
单发酵剂发酵酸奶：将制备好的商业酸奶发酵剂按3％的比例接种于灭菌脱脂乳中，置于恒温培养箱中42℃条件下发酵，待凝乳后取出，置于4℃冰箱冷藏18-24h。
[0162]
复合发酵剂发酵酸奶：向灭菌脱脂乳中接种1.5％的商用发酵剂和1.5％的本发明的菌株发酵剂，置于恒温培养箱中42℃条件下发酵，待凝乳后取出，置于4℃冰箱冷藏18-24h。
[0163]
本发明的菌株发酵剂的制备方法具体为：将乳酸片球菌zjuids17的原始菌种接种于11％的脱脂乳(115℃灭菌20min)中，37℃培养18-24h至凝乳，连续活化两代，作为母发酵剂。将母发酵剂按3％-5％接种量接种于11％的脱脂乳(115℃灭菌20min)中，37℃培养18-24h至凝乳，此时活菌数可达到10
9-10
10
cfu/ml，即得到乳酸片球菌zjuids17发酵剂。
[0164]
2.酸奶的γ-氨基丁酸产量的测量，参考实施例2中的高效液相色谱法，结果见下表5。
[0165]
表5、菌株发酵酸奶的产γ-氨基丁酸能力
[0166][0167]
表5的结果表明，乳酸片球菌zjuids17加入后酸奶的γ-氨基丁酸含量具有显著的提高。说明乳酸片球菌zjuids17可以显著提高酸奶制品的γ-氨基丁酸产量。
[0168]
按照常规的粘度计法、滴定法对发酵后酸奶的粘度、滴定酸度进行检测，所得结果如下：
[0169]
采用乳酸片球菌zjuids17复合发酵后酸奶的粘度达到了700mpa/s，显著高于对照的140mpa/s，滴定酸度112t
°
也高于对照的85t
°
，这表明采用乳酸片球菌zjuids17发酵后有助于提升酸奶的品质。
[0170]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17，其特征在于保藏号为cgmcc no.26163。2.如权利要求1所述的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)zjuids17的用途，其特征在于：高产γ-氨基丁酸。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：制备具有高产γ-氨基丁酸功能的活菌制剂。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：制备具有改善睡眠障碍功能的产品。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述产品包括食品、药物、保健品及宠物高活性益生菌片剂；所述食品包括发酵果蔬汁、发酵酸奶、益生菌固体饮料。

技术总结
本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及具有高产γ-氨基丁酸功能的乳酸片球菌ZJUIDS17及其应用。本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS17，其保藏号为CGMCC NO.26163。乳酸片球菌ZJUIDS17高产γ-氨基丁酸，能用于制备具有高产γ-氨基丁酸功能的活菌制剂、制备具有改善睡眠障碍功能的产品。的产品。的产品。


技术研发人员：任大喜 赵薇
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.02.19
技术公布日：2023/7/21