特异性靶向EGFR多肽放射性药物及其制备方法和应用

特异性靶向egfr多肽放射性药物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于制药领域，具体涉及一种靶向egfr多肽类放射性药物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是影响人类健康的主要疾病之一，具有发病率高、治疗难、死亡率高等特点。传统的癌症治疗方法如手术、化疗及放疗等对非实体瘤、全身广泛转移的癌症等不能进行有效治疗，同时化疗等副作用大、特异性差、疗效低，难以满足临床治疗的需求。随着对恶性肿瘤发病机理研究不断深入，针对特定致癌基因、蛋白或受体的分子靶向治疗及免疫治疗等新兴疗法取得明显效果，尤其是靶向治疗，因其特异性强、疗效显著、副作用小等优点目前已是临床肿瘤治疗的主要手段。
3.表皮生长因子受体(egfr)是原癌基因c-erbb1的表达产物，egfr的过度表达和突变普遍存在于大多数上皮性肿瘤中，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌和头颈癌等。野生型egfr是一种由1210个氨基酸组成的细胞跨膜蛋白，由胞外、跨膜和胞内结构组成。是表皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体，属于酪氨酸激酶受体家族。egfr结构域中的大量氨基酸序列缺失、突变和插入与肿瘤转移、侵袭和预后密切相关。egfr是最早开展肿瘤靶向治疗的靶点。目前已有多种相关靶向药物被批准用于临床。主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki,如吉非替尼、厄罗替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、阿美替尼、伏美替尼等)、单克隆抗体(如西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥株单抗等)，它们在临床中对非小细胞肺癌、结直肠癌等患者的治疗发挥了重要作用。但egfr-tki相关药物需要严格筛选特定突变基因型患者，同时大都伴有皮肤及消化道不良反应，并且多数患者出现获得性耐药；单克隆抗体价在人体中通常有良好的耐受性，但其中一些物质可能被识别为外来物，可引起免疫反应，2018年我国临床研究中抗egfr单抗的皮肤不良反应发生率高达81.4％。相较之下，小分子多肽由于具有分子量小、亲和力高、血液清除速度快、免疫原性低等特点，具有明显优势，基于多肽的靶向药物逐渐被开发并进入临床，靶向egfr的多肽类药物具有较大开发潜力。
4.近年来，利用特异性多肽及其类似物作为靶向肿瘤配体，载带放射性诊断/治疗核素的诊疗一体化放射性药物快速发展，为肿瘤的靶向治疗提供了一种新的治疗策略(n.jokar,i.velikyan,h.ahmadzadehfar,s.j.rekabpour,e.jafari,h.h.ting,h.j.biersack,m.assadi,theranostic approach in breast cancer atreasured tailor for future oncology,clinical nuclear medicine,46(2021)e410-e420.)。目前已有多种此类药物获批进入临床使用，如靶向生长抑素受体(sstr)的pet成像试剂
68
ga-dotatate[10]和神经内分泌瘤治疗药物lutathera(
177
lu-dotatate)[11]分别于2016年、2017年被fda批准(u.hennrich,k.kopka,lutathera(r):the first fda-and ema-approved radiopharmaceutical for peptide receptor radionuclide therapy,pharmaceuticals,12(2019).)；2022年3月诺华公司的pluvicto(
177
lu-psma-617)被fda批
准用于psma阳性前列腺癌治疗，同时获批的还有
68
ga-gozetotide作为pet成像诊断试剂(s.j.keam,lutetium lu 177vipivotide tetraxetan:first approval,molecular diagnosis&therapy,26(2022)467-475.)。患者使用此类诊疗一体化放射性药物可同时达到精准诊断及精准治疗双重目的，同时还可以利用显像监测治疗效果。因此开发新型的靶向egfr的多肽类放射性药物具有重要的基础研究意义及临床应用前景。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种新型的靶向egfr的多肽类放射性药物及其应用。
[0006]
本发明所采取的技术方案是：
[0007]
本发明的第一方面，提供一种多肽，所述多肽的序列为ivnqptygywhyk，所述多肽中的氨基酸为d型氨基酸。之前有文献报道的ge11多肽序列为l型氨基酸，申请人研究中发现其在体内不稳定，故为了提高其体内稳定性，申请人利用d型氨基酸取代l型氨基酸，并且改变原ge11多肽序列(yhwygytpqnvi)，以提高其稳定性，针对ge11的这种改性设计是首次的，并且效果与预期一致，在体内2h稳定存在，未见分解，通过实施例数据显示d型多肽稳定性更好，体内生物分布更优。
[0008]
本发明的第二方面，提供一种靶向egfr的配合物，所述靶向egfr的配合物包括本发明第一方面所述靶向egfr的多肽。
[0009]
优选地，所述配合物中还包括显像剂和/或治疗剂。
[0010]
优选地，所述显像剂包含fb基团、诊断用放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种。
[0011]
优选地，所述治疗剂包含治疗用放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子中的至少一种。
[0012]
优选地，所述诊断用放射性核素包括
18
f、
44
sc、
64
cu、
67
ga、
68
ga、
89
zr、
99
tc、
111
in、
177
lu和
188
re中的至少一种。
[0013]
优选地，所述治疗用放射性核素包括
51
cr、
90
y、
106
ru、
149
pm、
149
tb、
153
sm、
166
ho、
169
yb、
177
lu、
186
re、
188
re、
203
pb、
211
at、
212
bi、
212
pb、
213
bi、
223
ra、
225
ac、
226
th和
227
th中的至少一种。
[0014]
优选地，所述放射性核素通过螯合剂标记所述多肽。
[0015]
优选地，所述螯合剂包括hynic、dota、dotaga、nota、notaga、dtpa、noda、dtpa、teta、cb-te2a、cyclam、dfo、mag3、ec、edta、dadt、hynic、ns3、3,2-hopo、macropa及其衍生物中的至少一种。
[0016]
优选地，所述螯合剂选自如式(1)-式(9)所示的结构：
[0017][0018]
优选地，所述式(1)为1,4,7-三氮杂环九烷基-4,7-二乙酸基-1-乙酰基(-nota)。
[0019]
优选地，所述式(2)为1-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环九烷基-4,7-二乙酸(p-scn-bn-noda)。
[0020]
优选地，所述式(3)为2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环九烷-1,4,7-三乙酸(p-scn-bn-nota)。
[0021]
优选地，所述式(4)为1-(2-(2-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)乙氨基)酰乙基)-1,4,7-四氮杂环九烷-4,7-二乙酸(mai-noda)。
[0022]
优选地，所述式(5)为1-(2-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)酰乙基)-1,4,7-四氮杂环九烷-4,7-二乙酸。
[0023]
优选地，所述式(6)为2-((4,7-二羧甲基)-1,4,7三氮杂环九烷)基戊二酸。
[0024]
优选地，所述式(7)为1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-4,7,10-三乙酸基-1-乙酰基(-dota)。
[0025]
优选地，所述式(8)为1-(2-(2-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)乙氨基)酰乙基)-1,4,7,10-四氮杂环九烷-4,7,10-三乙酸(mai-noda)。
[0026]
优选地，所述式(9)为2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-scn-bn-dota)。
[0027]
优选地，所述配合物还包括修饰基团。
[0028]
优选地，所述修饰基团位于多肽的c端。修饰基团的加入，可以根据需要调节药物的生物半衰期、水溶性等性质，本发明中修饰基团的引入，主要是为了调节药物的生物半衰期，当其为oh时，体内代谢快，适用于做显像药物，当变化成其他结构时，其在体内半衰期延长，适合于做治疗用药物。
[0029]
所述修饰基团选自如式(10)-式(16)所示的结构：
[0030][0031]
优选地，所述式(10)为羟基。
[0032]
优选地，所述式(11)为2-氨基-6-对碘苯乙酰胺基己酸。
[0033]
优选地，所述式(12)为2-氨基-6-对碘苯丙酰胺基己酸。
[0034]
优选地，所述式(13)为2-氨基-6-四氢2萘丁酰胺基己酸(pib)。
[0035]
优选地，所述式(14)为2-氨基-6-对碘苯丙酰胺基己酸。
[0036]
优选地，所述式(15)为2-氨基-6-对溴苯丁酰胺基己酸。
[0037]
优选地，所述式(16)为4-氨基-6-((4
’‑
氨基-3,3’二甲基-[1,1’联苯]-4-基)二氮烯基)-5-羟基萘-1,3-二磺酸。
[0038]
优选地，所述配合物的结构式如式(i)或式(ⅱ)所示：
[0039][0040]
式(i)中，r1表示螯合剂，m表示放射性核素，n选自正整数；式(ⅱ)中，r3表示螯合剂，a表示放射性核素，b选自正整数；式(i)、(ⅱ)中r2表示修饰基团。
[0041]
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述配合物在制备疾病的靶向筛查、诊断、治疗或预后评估产品中的应用。
[0042]
优选地，所述疾病包括高表达egfr的疾病。
[0043]
优选地，所述疾病包括肿瘤。
[0044]
更优选地，所述疾病包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌。
[0045]
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的配合物。
[0046]
优选地，所述产品包括：药物、检测试剂盒。
[0047]
本发明的第五方面，提供一种制备本发明第二方面所述靶向egfr的配合物的制备方法，包括以下步骤：将靶向egfr的配合物前体与放射性金属核素混合反应。
[0048]
优选地，将靶向egfr的配合物前体与放射性金属核素在缓冲液中混合反应。
[0049]
优选地，所述缓冲溶液包括醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾、盐酸、醋酸中的至少一种。
[0050]
更优选地，所述缓冲溶液为醋酸钠。
[0051]
优选地，所述缓冲溶液的浓度为0.05mol/l-0.7mol/l。
[0052]
更优选地，所述缓冲溶液的浓度为0.1mol/l-0.6mol/l。
[0053]
优选地，所述反应的ph值为3.5-7.0。
[0054]
更优选地，所述反应的ph值为4.0-5.5。
[0055]
优选地，所述反应的温度为80℃-120℃。
[0056]
更优选地，所述反应的温度为90℃-110℃。
[0057]
优选地，所述反应的时间为8min-40min。
[0058]
更优选地，所述反应的时间为10min-30min。
[0059]
优选地，反应后可进一步纯化；所述纯化方法包括：反相高压液相色谱、离子交换层析、亲和层析、固相萃取。
[0060]
优选地，所述纯化包括使用sep-park plus c-18、sep-pak light c-18或hlb小柱进行纯化。
[0061]
优选地，所述靶向靶向egfr的配合物前体的制备方法包括：采用d型氨基酸为原料，合成靶向egfr的多肽，然后分别偶联螯合剂和/或修饰基团。
[0062]
优选地，通过在多肽c端修饰一个半胱氨酸，然后将半胱氨酸的巯基侧链与螯合剂和/或修饰基团偶联。
[0063]
本发明的有益效果是：
[0064]
本发明公开了一种靶向egfr多肽类放射性药物，该放射性药物是优良的药代动力学新型探针，其结构包括多肽、修饰基团、金属螯合基团及放射性金属核素，本发明首次利用d型氨基酸取代l型氨基酸制备靶向egfr的ge11变体多肽序列放射性药物，提高了药物的稳定性；其制备方法简便快捷，产率较高，该放射性药物稳定性好、水溶性强，体内血液清除快，主要经肾脏代谢，能特异性靶向egfr摄取于肿瘤部位，该放射性药物可广泛应用于肿瘤pet显像与肿瘤核素治疗。
附图说明
[0065]
图1为前体dge11-nota的hplc图谱。
[0066]
图2为前体dge11-nota的高分辨质谱图。
[0067]
图3为前体nota-pib-dge11的hplc图谱。
[0068]
图4为前体nota-pib-dge11的高分辨质谱图。
[0069]
图5为靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-dge11的放射性hplc图谱。
[0070]
图6为靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-pib-dge11的放射性hplc图谱。
[0071]
图7为[
18
f]alf-nota-dge11注射液在体外fbs 2h的放射性hplc图谱。
[0072]
图8为[
18
f]alf-nota-pib-dge11注射液在体fbs 2h的放射性hplc图谱。
[0073]
图9为[
18
f]alf-nota-dge11注射液在体内代谢2h的血浆放射性hplc图谱。
[0074]
图10为[
18
f]alf-nota-dge11在昆明鼠体内60分钟的生物分布图。
[0075]
图11为[
18
f]alf-nota-pib-dge11在昆明鼠体内12h的生物分布图。
[0076]
图12为[
18
f]alf-nota-dge11在hct116荷瘤鼠中120分钟内不同时间点mico-pet/ct显像图。
[0077]
图13为[
18
f]alf-nota-dge11在脏器不同时间点％id/g值随时间变化图。
[0078]
图14为[
18
f]alf-nota-dge11在u87、huh-7、hct116荷瘤鼠中60分钟mico-pet/ct显像图。
[0079]
图15为[
18
f]alf-nota-pib-dge11在hct116荷瘤鼠模型中6h、12hmico-pet/ct显像图。
具体实施方式
[0080]
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以
充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
[0081]
实施例1
[0082]
之前有文献报道的ge11多肽序列为l型氨基酸，并且申请人在研究中发现其在体内不稳定，故为了提高其体内稳定性，申请人利用d型氨基酸取代l型氨基酸，并进行序列倒置，以提高其稳定性，得到dge11多肽，氨基酸序列为ivnqptygywhyk。
[0083]
进一步以dge11多肽结构为药效基团，连接一金属离子螯合基团构建前体，利用放射性金属核素m
n+
标记构建如[m
n+
]dge11-nota或[m
n+
]dge11-dota的探针，结构如式(i)所示，以获得一类特异性靶向egfr多肽类放射性药物；
[0084][0085]
式(i)中，r1表示金属离子螯合基团，r2表示修饰基团，m表示放射性金属核素，n选自正整数。
[0086]
本技术实施例还可以在dge11多肽c端的赖氨酸(lys)支链修饰一个半胱氨酸(cys)后，将半胱氨酸的巯基侧链与金属离子螯合基团(如nota或dota类似物)反应构建前体，然后与放射性金属核素a
b+
在缓冲溶液中反应，得到[a
b+
]dge11-nota或[a
b+
]dge11-dota，如式(ⅱ)所示的靶向egfr多肽类放射性药物；
[0087][0088]
式(ⅱ)中，r3表示金属离子螯合基团，r2表示修饰基团，a
b+
表示放射性金属核素，b选自正整数。
[0089]
实施例2
[0090]
前体dge11-nota的制备步骤如下：
[0091]
采用d型氨基酸为原料，通过固相多肽合成法合成dge11(ivnqptygywhyk)多肽，金属离子螯合基团为1,4,7-三氮杂环九烷基-4,7-二乙酸基-1-乙酰基(-nota)，在c端的赖氨酸(lys)的侧链氨基与nota连接，在c端的羰基处连接修饰基团(r2为羟基)。利用制备型hplc分离纯化收集产品峰后冻干即得dge11-nota前体。
[0092]
图1为前体dge11-nota的hplc图谱；图2为前体dge11-nota的高分辨质谱图。hplc
图谱保留时间rt为11.575，质谱ms(m/z)分子量[m+2h]2h
+
为978.00，hplc测试纯度大于98％，dge11-nota前体结构经hplc和高分辨质谱测定。
[0093]
靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-dge11的制备步骤如下：
[0094]
由回旋加速器通过
18
o(p,n)
18
f核反应生产的
18
f-，在氦气载带下，富集在sep-pak qma阴离子柱中。用0.3ml～0.4ml生理盐水(质量分数为0.9％)将qma柱中
18
f-洗脱入小瓶备用。在装有制备的dge11-nota(2μg/μl，50μl)反应瓶中，依次加入2mmol/l alcl3溶液6μl、冰醋酸5μl和乙腈300μl混匀。取50μl上述
18
f-洗脱液加入反应瓶中搅拌混匀后，100℃加热反应15min。冷却，加注射用水6～8ml到反应瓶中混匀，转移至sep-pak c-18柱上。然后用10ml
×
3注射用水冲洗sep-pak plus c-18柱并吹干。最后，用1ml乙醇洗脱产品经无菌滤膜后收集在接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[
18
f]alf-nota-dge11注射液。未校正放射化学产率为20.5％-52.0％，总放射合成时间为30min。图5为靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-dge11的放射性hplc图谱，目标显像剂出峰时间为9.419min，产物放射化学纯度大于99％。
[0095]
实施例3
[0096]
靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-dge11的制备步骤如下：
[0097]
由回旋加速器通过
18
o(p,n)
18
f核反应生产的
18
f-(100mci)，在氦气载带下，富集在sep-pak qma阴离子柱中。用450μl 0.5m醋酸钠(用醋酸调节ph值为3.9)将qma柱中
18
f-洗脱入小瓶备用。在100μg dge11-nota前体中依次加入dmso 350μl、2mmol/l alcl3溶液30μl混匀。将上述前体混合溶液加入到
18
f-洗脱入小瓶密封105℃加热反应15min。反应结束后冷却并加入注射用水9ml混匀，转移至hlb plus柱。用20ml
×
2注射用水冲洗hlb柱并吹干。然后，用1ml(50％乙醇水溶液)洗脱产品并用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[
18
f]alf-nota-dge11注射液。未校正放射化学产率为75％～92％，总放射合成时间为30min。图7为[
18
f]alf-nota-dge11注射液在体外fbs 2h时的放射性hplc图谱。
[0098]
实施例4
[0099]
靶向egfr多肽类放射性药物[
68
ga]-dge11-dota的制备步骤如下：
[0100]
前体dge11-dota的制备步骤如下：
[0101]
采用d型氨基酸为原料，通过固相多肽合成法合成dge11(ivnqptygywhyk)多肽，金属离子螯合基团为1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-4,7,10-三乙酸基-1-乙酰基(-dota)，在c端的赖氨酸(lys)的侧链氨基与dota连接，在c端的羰基处连接修饰基团(r2为羟基)。利用制备型hplc分离纯化收集产品峰后冻干即得dge11-dota前体。
[0102]
在含50μl实施例2制备的前体dge11-dota(2μg/μl)的反应管中加入900μl浓度为0.25mol/l的乙酸钠溶液。从
68
ge/
68
ga发生器中用4ml浓度为0.05mol/l的盐酸洗脱
68
gacl3至上述反应管中，混匀，溶液ph为4.0左右，100℃加热反应15min左右。冷却并加入注射用水4ml混匀，转移至hlb柱。用10ml
×
2注射用水冲洗hlb plus柱并吹干。然后，用1ml乙醇洗脱产品并用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[
68
ga]dge11-dota注射液。[
68
ga]dge11-dota未校正放射化学产率为70％～95％，总放射合成时间为30min。
[0103]
实施例5
[0104]
前体nota-pib-dge11的制备步骤如下：
[0105]
采用d型氨基酸为原料，通过固相多肽合成法合成dge11多肽，金属离子螯合基团为1,4,7-三氮杂环九烷基-4,7-二乙酸基-1-乙酰基(-nota)，在c端的赖氨酸(lys)的侧链氨基与nota连接，在c端的羰基处连接修饰基团(r2为2-氨基-6-对碘苯丁酰胺基己酸(pib)，如结构式(13)所示)。利用制备型hplc分离纯化收集产品峰后冻干即得nota-pib-dge11前体。图3为前体dge11-nota的hplc图谱；图4为前体dge11-nota的高分辨质谱图。hplc图谱保留时间rt为9.853，质谱ms(m/z)分子量[m+2h]2h
+
为1178.3，hplc测试纯度大于95％。
[0106]
靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-dge11-pib-nota的制备步骤如下：
[0107]
由回旋加速器通过
18
o(p,n)
18
f核反应生产的
18
f-(100mci)，在氦气载带下，富集在sep-pak qma阴离子柱中。用450μl 0.5m醋酸钠(用醋酸调节ph值为3.9)将qma柱中
18
f-洗脱入小瓶备用。在100μg nota-pib-dge11前体中依次加入dmso 350μl、2mmol/l alcl3溶液30μl混匀。将上述前体混合溶液加入到
18
f-洗脱入小瓶密封105℃加热反应15min。反应结束后冷却并加入注射用水9ml混匀，转移至hlb plus柱。用20ml
×
2注射用水冲洗hlb柱并吹干。然后，用1ml(50％乙醇水溶液)洗脱产品并用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[
18
f]alf-nota-pib-dge11注射液。未校正放射化学产率为32.9％～46.1％，总放射合成时间为30min。图6为靶向egfr多肽类放射性药物[
18
f]alf-nota-pib-dge11的放射性hplc图谱，目标显像剂出峰时间为10.748min。图8为[
18
f]alf-nota-pib-dge11注射液在体外fbs 2h时的放射性hplc图谱。
[0108]
实施例6产品放化纯度和稳定性的测定
[0109]
用高效液相色谱(hplc)测定药物注射液的放射化学纯度及稳定性。hplc分析条件：分析柱为zorbax eclipse xdb-c18柱；流动相：a相为0.1％三氟乙酸(tfa)的水溶液，b相为0.1％ tfa的乙腈溶液。淋洗梯度为：0-2min，a相90％，b相10％，流速1ml/min；2-10min，a相降至20％，b相升至80％，流速1ml/min；10-14min，a相保持90％，b相保持10％，流速1ml/min。
[0110]
为了检测显像剂在体外的稳定性，分别考查了[
18
f]alf-nota-dge11、[
18
f]alf-nota-pib-dge11在胎牛血清(fbs)中的稳定性。取2ml fbs与200μci显像剂充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，取少量溶液，通过hplc检测显像剂稳定性，以上实验重复4次。其代表性hplc图如图7、图8。结果发现[
18
f]alf-nota-dge11、[
18
f]alf-nota-pib-dge11在fbs中均100％以原型稳定存在。
[0111]
为检测显像剂[
18
f]alf-nota-dge11在体内的稳定性，取[
18
f]alf-nota-dge11注射液200μci左右，经尾静脉注射进入昆明鼠体内，然后正常饲养2h，摘眼取血，10000转离心10分钟取上清液，再经超滤膜(12000转离心5分钟)，将离心液体进hplc分析，以上实验重复4次，其代表性体内血清稳定性hplc如图9。结果发现[
18
f]alf-nota-dge11在体内2h未内分解，100％以原型稳定存在。
[0112]
实施例7酯水分配系数测定实验
[0113]
分别取10μl配制好的[
18
f]alf-nota-dge11、[
18
f]alf-nota-pib-dge11注射液于装有1ml正辛醇与990μl水的2.5ml离心管中，密闭置于干式恒温器中常温震荡10min，静置10min使两相分层，用移液器从两相中分别各取500μl置于γ计数管中，用γ计数器测定计
数。平行进行两批次实验，每批重复三次。据以下公式计算得到log p值。
[0114][0115]
通过放射性技术方法测定[
18
f]alf-nota-dge11与[
18
f]alf-nota-pib-dge11的脂水分配系数log p分别为-1.690
±
0.010，说明显像剂为水溶性物质，具有较好的亲水特性，预测体内摄取与显像中主要经肾脏代谢，其他软组织摄取可能较低，显像背景摄取比较低。
[0116]
实施例8[
18
f]alf-nota-dge11体内生物分布实验
[0117]
如实施例2制备得到靶向egfr的多肽类pet显像剂[
18
f]alf-nota-dge11后，在4只正常昆明鼠中分别经尾静脉注射30μci显像剂后，正常饲养摄取1h后，处死小鼠，取血及脑、心、肺、肝脏、肾脏等主要脏器与组织称重并进行γ计数，研究显像剂在小鼠体内的生物分布情况。[
18
f]alf-dge11-not在昆明鼠体内生物分布如图10，结果显示药物主要经肾脏代谢，血液清除速度快，骨中放射性不高，药物在体内不脱氟。
[0118]
如实施例5制备得到靶向egfr的多肽类pet显像剂[
18
f]alf-nota-pib-dge11后，在4只正常昆明鼠中分别经尾静脉注射30μci显像剂后，正常饲养摄取12h后，处死小鼠，取血及脑、心、肺、肝脏、肾脏等主要脏器与组织称重并进行γ计数，研究显像剂在小鼠体内的生物分布情况。[
18
f]alf-dge11-not在昆明鼠体内生物分布如图11，结果显示探针在血液循环系统滞留时间延长，血液、肺的放射性计数明显增高，探针依旧主要经肾脏代谢，骨中放射性不高，药物在体内不脱氟，nota-pib-dge11有作为治疗性放射性药物前体的潜力。
[0119]
实施例9micro pet/ct显像实验
[0120]
micro-pet/ct显像研究利用siemens inveon micro-pet/ct，采集工作站为inveon acquirision workplace(iaw)2.2，数据分析工作站为inveon research workplace(irw)。取egfr阳性表达脑胶质瘤细胞u87、人肝癌细胞huh7、人结肠癌细胞hct116以5
×
106/只的密度进行裸鼠皮下接种，待肿瘤直径生长至8-10mm时，进行显像剂研究。
[0121]
动态显像：取hct116荷瘤鼠经10％戊巴比妥麻醉后固定于扫描床上，并建立好方法让床位位于pet视野，取[
18
f]alf-nota-dge11注射液200μci左右，经尾静脉注射，注射的同时开始扫描，持续扫描120分钟。pet动态图及其主要脏器时间-活度曲线如图12、图13所示。
[0122]
静态显像：取[
18
f]alf-nota-dge11注射液200μci左右，经尾静脉注射入u87、huh7、hct116荷瘤鼠体内，常规摄取40分钟后注射0.1ml 10％戊巴比妥，之后行常规pet/ct显像(pet采集10min)，pet/ct显像结果如图14。取[
18
f]alf-nota-pib-dge11射液200μci左右，经尾静脉注射入hct116荷瘤鼠模型，常规摄取6h、12h后进进行pet/ct扫描(pet采集30min),pet/ct显像结果如图15。
[0123]
抑制显像：其他操作同“动态显像”“静态显像”，在注射药物中加入300μg dge11多肽。
[0124]
pet显像结果表明：探针[
18
f]alf-nota-dge11在u87、huh7、hct116荷瘤鼠肿瘤中具有较高摄取，同时肿瘤部位摄取量明显高于肌肉、肺、肝、肠等脏器或组织。动态显像中各脏器的时间动态图发现肿瘤/肌肉比值在60分钟时较高，故最佳显像时间选择60分钟，抑制显像结果发现，抑制显像肿瘤/肌肉比明显下降，为特异性摄取。显像结果相较文献报道[
18
f]
fp-lys-ge11(xueli li,kongzhen hu,et al.synthesis and evaluation of[18f]fp-lys-ge11 as a new radiolabeled peptide probe for epidermal growth factor receptor(egfr)imaging.nuclear medicine and biology,2020,90-91:84-92.)具有更好的肿瘤显像效果，更高的肿瘤/肌肉比([
18
f]alf-nota-dge11探针1h hct116肿瘤/肌肉比值8.75
±
0.13，[
18
f]fp-lys-ge11探针2h u87肿瘤/肌肉3.45
±
0.43)，同时腹腔本地低(肝脏摄取明显降低)。显像结果表明显像剂靶向特异性摄取于肿瘤部位，具有较好的应用前景。[
18
f]alf-nota-pib-dge11在cht116荷瘤鼠模型中肿瘤部位均有明显浓聚(图15)，同时血液、肺部放射性浓聚明显高于[
18
f]alf-nota-dge11，这是因为r2出用对碘苯丁酸类似取代羟基，导致探针生物半衰期延长所致，表明nota-pib-dge11前体及其类似物有用于核素治疗用配体的潜力。
[0125]
综上，本实施例得到的放射性药物具备成为诊断恶性肿瘤的有用工具的条件，为治疗方案的确定及疗效监测提供有力影像学佐证；同时如果使用治疗性核素具备成为治疗恶性肿瘤的治疗药物，可靶向治疗恶性肿瘤。
[0126]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种多肽，所述多肽的序列为ivnqptygywhyk，所述多肽中的氨基酸为d型氨基酸。2.一种靶向egfr的配合物，其特征在于，所述靶向egfr的配合物包括权利要求1所述的多肽。3.根据权利要求2所述的配合物，其特征在于，所述配合物中还包括显像剂和/或治疗剂；优选地，所述显像剂包含fb基团、诊断用放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种；优选地，所述治疗剂包含治疗用放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子中的至少一种；所述诊断用放射性核素包括
18
f、
44
sc、
64
cu、
67
ga、
68
ga、
89
zr、
99
tc、
111
in、
177
lu和
188
re中的至少一种；优选地，所述治疗用放射性核素包含
51
cr、
90
y、
106
ru、
149
pm、
149
tb、
153
sm、
166
ho、
169
yb、
177
lu、
186
re、
188
re、
203
pb、
211
at、
212
bi、
212
pb、
213
bi、
223
ra、
225
ac、
226
th和
227
th中的至少一种。4.根据权利要求3所述的配合物，其特征在于，所述放射性核素通过螯合剂标记所述多肽；优选地，所述螯合剂包括hynic、dota、dotaga、nota、notaga、dtpa、noda、dtpa、teta、cb-te2a、cyclam、dfo、mag3、ec、edta、dadt、hynic、ns3、3,2-hopo、macropa及其衍生物中的至少一种；优选地，所述螯合剂选自如式(1)-式(9)所示的结构：5.根据权利要求2所述的配合物，其特征在于，所述配合物还包括修饰基团，优选地，所述修饰基团选自如式(10)-式(16)所示的结构：
6.根据权利要求2～5任一项所述的配合物，其特征在于，所述配合物的结构式如式(i)或式(ⅱ)所示：式(i)中，r1表示螯合剂，m表示放射性核素，n选自正整数；式(ⅱ)中，r3表示螯合剂，a表示放射性核素，b选自正整数；式(i)、(ⅱ)中r2表示修饰基团。7.一种制备权利要求2～6任一项所述靶向egfr的配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将靶向egfr的配合物前体与放射性金属核素混合反应。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述靶向靶向egfr的配合物前体的制备方法包括：采用d型氨基酸为原料，合成靶向egfr的多肽，然后分别偶联螯合剂和/或修饰基团。9.权利要求1所述的多肽或权利要求2～6任一项所述的靶向egfr的配合物在制备疾病
的靶向筛查、诊断、治疗或预后评估产品中的应用，优选地，所述疾病包括egfr高表达的疾病；优选地，所述疾病包括肿瘤；优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌。10.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的多肽或权利要求2～6任一项所述的靶向egfr的配合物。

技术总结
本发明公开了一种特异性靶向EGFR多肽放射性药物及其制备方法和应用；该放射性药物是优良的药代动力学新型探针，其结构包括多肽、修饰基团、金属螯合基团及放射性金属核素，本发明首次利用D型氨基酸取代L型氨基酸制备靶向EGFR蛋白的GE11变体多肽序列放射性药物，提高了药物的稳定性；其制备方法简便快捷，产率较高，该放射性药物稳定性好、水溶性强，体内血液清除快，主要经肾脏代谢，能特异性靶向EGFR，摄取于肿瘤部位，该放射性药物可广泛应用于肿瘤PET显像与肿瘤核素治疗。瘤PET显像与肿瘤核素治疗。


技术研发人员：黄顺 吴湖炳 白鹭 石大志
受保护的技术使用者：南方医科大学南方医院
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/7/21