WTAP的抑制剂在制备治疗特应性皮炎药物中的应用

wtap的抑制剂在制备治疗特应性皮炎药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及wtap的抑制剂在制备治疗ad药物中的应用。


背景技术：

2.特应性皮炎(atopic dermatitis,ad)是一种慢性复发性炎症性皮肤病，其临床特征包括皮肤屏障受损、强化瘙痒和慢性皮肤炎症，严重影响全球约15％-20％的儿童和1％-3％的成人的生活质量。ad的发病机制涉及屏障功能障碍、免疫细胞异常激活、ige介导的超敏反应和环境因素等等。最近的研究证实了表观遗传变化在ad发展中的关键作用，包括基因组dna修饰和microrna转录后调控。
3.n6-甲基腺嘌呤(m6a)是真核细胞中最丰富的rna动态可逆内部化学修饰，在多种生物功能中起着至关重要的作用。m6a修饰由“writers”、“erasers”和“readers”蛋白共同调控，从而影响rna的转录、加工、翻译和代谢。研究表明，m6a修饰与炎症、癌症、代谢、神经和免疫系统疾病密切相关。
4.研究一种治疗ad的新药物或者新方法具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种可以用于制备治疗ad药物的新靶点。在本研究中，我们研究了m6a修饰在ad发生发展中的潜在作用。我们发现肾母细胞瘤1相关蛋白(wtap)可以通过介导m6a水平增加15-花生四烯酸脂氧合酶(alox15)、钙卫蛋白(s100a9)和丝氨酸蛋白酶抑制剂b3(serpinb3)的表达水平，参与ad的病理生理发展。
6.本发明的技术方案是：
7.wtap的抑制剂在制备治疗特应性皮炎药物中的应用。
8.优选的，所述wtap的抑制剂为sirna。进一步优先的，所述wtap的抑制剂如seq id no.17所示。
9.本发明还提供了wtap作为分子标志物在制备诊断特应性皮炎检测试剂盒中的应用。
10.本发明研究表明，在本研究中通过对m6a转录组芯片数据的分析，我们发现了ad中差异m6a甲基化的基因以及mrna水平差异化表达基因(degs)。我们发现所有筛选的degs和大部分通路同时出现“hypo-down”或“hyper-up”富集，提示m6a修饰与ad中mrna的表达呈正相关。根据富集分数和fisher p value的排序，我们确定了16个感兴趣的差异化通路，包括10个上调通路和6个下调通路，我们分析出了参与这些感兴趣通路的degs的m6a水平和mrna水平的排序。此外，通过测序结果我们发现“writer”wtap的mrna表达差异在正常对照和ad中最为明显。
11.接下来，我们通过临床样本验证证实了与正常皮肤相比，ad病变中wtap的mrna和蛋白水平显著上调。wtap在ad皮损的表皮角质形成细胞中高表达，而在正常皮肤中低表达。
我们还证实了，与正常皮肤相比，测序结果中上调最明显的前三个de(alox15、s100a9和serpinb3)在ad病变中s100a9和serpinb3的mrna和蛋白水平显著上调，而alox15只有蛋白水平在ad中显著上调，mrna水平与正常皮肤相比无显著差异。通过免疫荧光检测发现wtap、s100a9和serpinb3在ad患者表皮病变中的荧光强度明显高于正常对照组，而alox15在ad真皮病变中显著升高。
12.根据gse193309数据集结果的相关性分析显示，wtap的表达水平与s100a9和serpinb3呈正相关，而与alox15无显著相关。ad患者皮损比正常对照有更高的总m6a甲基化水平。此外，ad组s100a9和serpinb3 mrna的m6a水平较正常对照组显著升高。然而，我们没有得到alox15在正常对照或ad组中的mrna的m6a水平。这些数据表明，alox15、s100a9和serpinb3是m6a rna甲基化的下游靶点，可能通过wtap进行调控。本发明还在细胞水平上验证了wtap调控alox15、s100a9和serpinb3的表达。
13.总之，本发明描述了m6a修饰在ad的病理发展中起的潜在作用，并证明了wtap通过m6a修饰上调alox15、s100a9和serpinb3的表达，从而在参与ad的病理发展。我们的研究结果支持这样的概念：wtap在皮损中高表达促进特应性皮炎皮损形成，靶向wtap分子可为制备治疗特应性皮炎药物提供新的思路。
附图说明
14.图1是ad皮损和健康对照皮肤arraystar表观转录组测序分析图，其中图1(a)采用主成分分析(pca)对ad和正常对照之间的差异进行分类图；图1(b)火山图显示正常对照和ad之间m6a甲基化的差异基因图；图1(c)火山图显示正常对照和ad之间的degs；图1(d)维恩图显示了ad中差异m6a修饰基因、通路的重叠；图1(e)ad中mrna水平和m6a水平改变的16条通路；图1(f)热图显示了16条通路中所涉及的degs的m6a水平和mrna水平的排序；图1(g)热图显示两组间m6a修饰相关酶的表达差异。
15.图2是wtap促进m6a的修饰从而导致ad病变中alox15、s100a9和serpinb3的上调图，其中图2(a-d)是qrt-pcr检测正常对照(n=16)和ad(n=16)中wtap、alox15、s100a9和serpinb3的mrna表达。图2 (e)正常对照(n=4)和ad(n=4)中wtap、alox15、s100a9和serpinb3蛋白印迹和定量的代表图像。图2 (f-i) 正常对照(n=3)和ad(n=3)中wtap、alox15、s100a9和serpinb3的代表免疫荧光染色(放大倍数，x200)； 图2（j）是正常人和ad病人皮损中免疫荧光的图片，cd11c是标记dc细胞的，alox15是标记靶基因，merge是共表达。
16.图3是对wtap及其潜在靶点(alox15、s100a9和serpinb3)的相关性分析的图，其中图3(a)是ad患者wtap与s100a9、serpinb3和alox15的相关性分析；图3(b)ad损伤皮肤(n＝9)和正常皮肤(n＝9)中m6a总水平；图3(c-d)merip-qpcr分析显示正常对照(n＝5)和ad(n＝5)中s100a9和serpinb3 mrna的m6a水平。
17.图4是细胞实验验证敲低和过表达wtap后kcs和dcs中alox15、s100a9和serpinb3的表达变化情况；图4(a和b)是特定sirna敲低wtap后kcs和dcs中s100a9和serpinb3、alox15的m6a水平发生显著改变的图；图4(c)是特定sirna敲低wtap后kcs中s100a9和serpinb3的mrna水平显著下调的图；图4(d)是腺病毒过表达wtap后kcs中s100a9和serpinb3的mrna水平显著上调的图；图4(e)是特定sirna敲低wtap后kcs中s100a9和
serpinb3的蛋白水平显著下调的图；图4(f)是腺病毒过表达wtap后kcs中s100a9和serpinb3的蛋白水平显著上调的图；图4(g)特定sirna敲低wtap后dcs中alox15的mrna水平显著下调的图；图4(h)是腺病毒过表达wtap后dcs中alxo15的mrna水平显著上调的图；图4(i)特定sirna敲低wtap后dcs中alox15的蛋白水平显著下调的图；图4(j)是腺病毒过表达wtap后dcs中alxo15的蛋白水平显著上调的图。
具体实施方式
18.下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
19.表1：rt-qpcr引物序列以及说明书中的其它序列。
[0020][0021][0022]
1、材料及方法
[0023]
qrt-pcr分析，蛋白质印迹(wb)分析，免疫荧光(if)测定,以上方法均是现有方法，在此不再累述。
[0024]
2、患者组织标本
[0025]
本研究采用来自中南大学湘雅三医院病理组织学诊断为ad患者和正常对照患者。将16个an皮损组织标本和相应的正常对照皮肤组织标本立即储存在-80℃，并用于qrt-pcr和/蛋白质印迹等。
[0026]
3、m6a mrna转录组芯片
[0027]
转录组芯片(arraystar)用于rna样本的制备和微阵列杂交。从ad组(n＝3)或对照组(n＝3)的皮肤组织中提取总rna。阈值设定为大于1.5倍变化和具有统计学意义(p《0.05)来比较ad组和正常组之间的rna甲基化差异。利用m6a mrna转录组微阵列数据库，kegg和go富集分析使用r包聚类分析进行。
[0028]
4、m6a定量和merip-qpcr
[0029]
使用比色法m6a rna甲基化定量试剂盒(epigentek)与抗体结合后，在450nm的波长下测量rna甲基化。对于merip-qpcr，总rna(10～20μg)被随机片段成100个核苷酸(nt)大
小。通过免疫共沉淀分析，将经过m6a修饰的rna片段汇集下来并富集，然后使用merip m6a试剂盒(epigentek)通过rt-pcr进行定量。
[0030]
5、人kcs和小鼠dcs的培养
[0031]
从手术切除的包皮标本中分离出分离培养kcs，并将小鼠骨髓细胞通过gm-csf诱导成为dcs。
[0032]
为了进行rna干扰实验，选择si-wtap(5'-ctaagagagtctgaagaaa-3')进行干预效果验证，确认干预效果后进行正式敲低以及功能表型验证：细胞被铺在6孔板中。将sirna用lipo3000(invitrogen)转染kcs和dcs。对于过表达实验，采用腺病毒干预：将cmv-mcs-sv40-egfp腺病毒载体插入wtap(genbank：nm_019852，靶序列：5'-gaggatccccgggtaccggcgccaccatgaccaacgaagaacctcttc-3'，seq idno.16)基因编码序列中。对于病毒感染，细胞在含有10％胎牛血清的dmem中培养过夜,将腺病毒以最佳的感染多样性(moi)加入到孔板中。在感染8-16小时后，用完全的培养基替换该培养基。在感染72h后检测蛋白和mrna的表达水平。敲低或过表达干预后靶基因的表达采用rt-qpcr和wb检测。
[0033]
6、结果
[0034]
6.1在ad皮损中差异表达的m6a rna甲基化调控分子和潜在靶点
[0035]
正常对照(n＝3)和ad皮损(n＝3)活检后进行m6a测序分析，通过主成分分析(pca)可以完全区分ad和正常对照(图1a)。通过m6a转录组芯片数据的分析，我们发现了ad中1057个高m6a甲基化基因和235个低m6a甲基化基因(fold changes≥2,p《0.05；图1b)，我们通过mrna-seq鉴定了598个上调基因和432个下调基因(fold change≥2and p《0.05；图1c)。我们发现181个差异甲基化基因(degs)同时发生hypo-m6a和down-mrna(hypo-down)，532个degs同时发生hyper-m6a和up-mrna(hyper-up)。同时，54个biological process(bp)通路发生了“hypo-down”，522个bp通路发生了“hyper-up”，此外2条hsa通路发生“hypo-down”，27条hsa通路发生“hyper-up”(图1d)。基于以上结果，我们发现所有筛选的degs和大部分通路同时出现“hypo-down”或“hyper-up”富集，提示m6a修饰与ad中mrna的表达呈正相关。根据富集分数和fisher p value的排序，我们确定了16个感兴趣的差异化通路，包括10个上调通路和6个下调通路(图1e)，上调的通路主要包括病毒过程、参与炎症反应的白细胞迁移过程、长链脂肪酸代谢过程和磷脂酰乙醇胺代谢过程。而下调的通路主要包括上皮细胞顶端/基底极性的建立、嘧啶核苷三磷酸代谢过程等。热图显示了参与这些感兴趣通路的degs的m6a水平和mrna水平的序列(图1f)。此外，通过测序结果我们发现“writer”wtap的mrna表达差异在正常对照和ad中最为明显(图1g)。
[0036]
接下来，我们证实了与正常皮肤相比，ad病变中wtap的mrna和蛋白水平显著上调(图2a、e)。我们还证实，与正常皮肤相比，测序结果中上调最明显的前三个de(alox15)在ad病变中s100a9和serpinb3的mrna和蛋白水平显著上调(图2b、c、e)，而alox15只有蛋白水平在ad中显著上调(图2e)，mrna水平与正常皮肤相比无显著差异(图2d)。通过免疫荧光检测发现wtap、s100a9和serpinb3在ad患者表皮病变中的荧光强度明显高于正常对照(图2f-h)，而alox15在ad真皮病变中显著升高(图2i)。
[0037]
根据gse193309数据集结果的相关性分析显示，wtap的表达水平与s100a9和serpinb3呈正相关(r＝0.28，p《0.05)，而与alox15无显著相关(图3a)ad患者(n＝9)的皮损比正常对照(n＝9)有更高的总m6a甲基化水平(图3b)。此外，ad组s100a9和serpinb3mrna的
m6a水平较正常对照组显著升高(n＝5)(图3c和d)。然而，我们没有得到alox15在正常对照或ad组中的mrna的m6a水平。这些数据表明，alox15、s100a9和serpinb3是m6a rna甲基化的下游靶点，可能通过wtap进行调控。
[0038]
6.2wtap调控alox15、s100a9和serpinb3的表达
[0039]
为了验证wtap在alox15、s100a9和serpinb3表达中的潜在调控作用，我们验证并确定了kcs和dcs中wtap表达的sirna序列，此条sirna序列对wtap有明显作用，随即进一步的后续实验。wtap的敲低导致kcs中s100a9和serpinb3的m6a水平降低(图4a)同时两者的mrna和蛋白水平也显著降低(图4c、e)。此外，wtap的敲低导致dcs中alox15的m6a、mrna和蛋白水平显著降低(图4a、g、i)
[0040]
随后我们通过在kcs和dcs中腺病毒过表达wtap，结果显示过表达wtap导致kcs中s100a9和serpinb3的m6a、mrna水平和蛋白质水平增加(图4b、d、f),同样也导致dcs中alox15的m6a、mrna水平和蛋白水平显著增加(图4b、h、j)。基于这些数据，我们提出了一个ad疾病发展的机制假说。wtap通过mrna的m6a甲基化促进alox15、s100a9和serpinb3的表达，从而增强ad的发生发展。
[0041]
总之，本发明研究表明，特应性皮炎(atopic dermatitis，ad)皮损中15-花生四烯酸脂氧合酶(alox15)、钙卫蛋白(s100a9)和丝氨酸蛋白酶抑制剂b3(serpinb3)表达水平显著升高，且其表达受到肾母细胞瘤1相关蛋白(wtap)的调控。这些数据表明wtap介导的m6a修饰上调了alox15、s100a9和serpinb3的表达，促进了ad的发生发展。因此，wtap具备作为靶位点在制备治疗ad药物中的应用潜质，进一步也可作为诊断ad的分子标志物应用于临床检测试剂盒。

技术特征：
1.wtap的抑制剂在制备治疗特应性皮炎药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，所述wtap的抑制剂为sirna。3.根据权利要求1所述应用，所述wtap的抑制剂如seq id no.15所示。4.wtap作为分子标志物在制备诊断特应性皮炎检测试剂盒中的应用。

技术总结
本发明公开了WTAP的抑制剂在制备治疗特应性皮炎药物中的应用，所述抑制剂为siRNA。本发明还公开了WTAP作为分子标志物在制备特应性皮炎检测试剂盒中的应用。我们的研究结果支持：WTAP在皮损中高表达促进特应性皮炎皮损形成，靶向抑制WTAP分子可为制备治疗特应性皮炎药物提供新的思路。药物提供新的思路。


技术研发人员：曾金荣 鲁建云 谭丽娜 陈雪 周璐 童晓亮 闫思聿
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/7/21