一种猪细小病毒单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪细小病毒单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.猪细小病毒病(ppi)又称猪繁殖障碍病。是由猪细小病毒(ppv)引起的一种猪的繁殖障碍病。怀孕母猪发生流产、死产、木乃伊为特征。不同年龄、性别的猪均易感染。发病无明显的季节性。传染源主要来自感染细胞病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒可通过胎盘垂直传播，而带毒猪所产的活仔可带毒排毒很长时间甚至终生。
3.目前，针对ppv的防控，主要是全病毒灭活疫苗。正如cn 105349562 b专利指出的，全病毒灭活疫苗存在较大的弊端。随着生物技术的发展，研究人员已经发现ppv起主要免疫原性的是vp2蛋白，已经有较多科研单位或公司对vp2蛋白进行了系统研究，并开发了疫苗，该亚单位疫苗具有良好的免疫效果。但是，针对vp2蛋白的定量主要还是采用bca方法结合sds-page来定量；该定量方法检测的是总vp2蛋白，不能区分有良好免疫原性的vp2蛋白。因此，为了更好的定量vp2蛋白，需要良好的针对vp2蛋白的单克隆抗体。


技术实现要素：

4.为了弥补现有技术的不足，本发明的目在于提供一种特异性结合猪细小病毒vp2蛋白的单克隆抗体及其应用。
5.本发明一方面公开了一种猪细小病毒单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合猪细小病毒vp2蛋白，所述的单克隆抗体的的重链可变区序列如seq id no.1所示，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如seq id no.2所示。
6.优选地，本发明所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述的重链可变区的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的序列分别为：
7.cdr-h1：tnyliee；
8.cdr-h2：ytcnpgslrtkynefkc；
9.cdr-h3：dgpwsdad。
10.优选地，本发明所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，所述的轻链可变区的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的序列分别为：
11.cdr-l1：kssqsslnsfnqkkylas；
12.cdr-l2：gastrqs；
13.cdr-l3：qnlhsypft。
14.优选地，本发明所述的单克隆抗体的重链可变区序列还包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，所述的重链可变区的fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4的序列分别为：
15.fr-h1：qvqlqqsgqeevrpgqtsgkvscaasgyfaf；
16.fr-h2：wvkqpgqgliwig；
17.fr-h3：kawltadmcsgnsymqhsslksddadyfcar；
18.fr-h4：wgqgtlvtvsa。
19.优选地，本发明所述的单克隆抗体的轻链可变区序列还包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，所述的轻链可变区的fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4的序列分别为：
20.fr-l1：diwmtqsvsslrvsagekvtmad；
21.fr-l2：fyqqkpgqppqlliy；
22.fr-l3：gvperfeggsgegtdstltyssveaedlayvyc；
23.fr-l4：fhsgtkleik。
24.再一方面，本发明还公开了一种所述的单克隆抗体在检测猪细小病毒vp2蛋白中的应用。
25.本发明制备的抗猪细小病毒vp2蛋白的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的细小病毒vp2蛋白的诊断试剂，如werstern blot、elisa等检测试剂盒。
26.虽然本发明没有建立猪细小病毒vp2蛋白的检测试剂盒，但本领域的技术人员在本发明的单克隆抗体的基础上，使用常规的技术手段就能实现。如，使用猪细小病毒vp2蛋白制备兔多抗，使用制备的兔多抗作为包被抗体、本发明的单克隆抗体作为检测抗体、结合猪细小病毒vp2蛋白就能建立针对猪细小病毒vp2蛋白的定量或定性检测试剂盒，该试剂盒可以为elisa检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
附图说明
27.图1单克隆抗体特异性检验结果(werstern blot)，其中ppv-vp2为猪细小病毒vp2蛋白(浓度为1mg/ml)，pedv、pcv2、prv为全病毒提取总蛋白作为样品。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
29.本发明中，“抗体”(antibody)是指一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，h)，而分子量较小的两条链称为轻链(light chain，l)。同一抗体分子中的两条h链和两条l链的氨基酸组成完全相同。通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，v)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近c端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，c)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。重链和轻链的v区分别称为vh和vl。vh和vl中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为互补决定区(complementarity determining region，cdr)，包括cdrl、cdr2和cdr3，其中，cdr3变化程度更高。vh的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而vl的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。vh和vl的3个cdr共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在v区中，cdr之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，fr)。vh或vl各有四个骨架区，分别用fr1、fr2、
fr3和fr4表示。重链和轻链的c区分别称为ch和cl。不同型(κ或λ)抗体的cl长度基本一致，但是不同类抗体的ch长度不同，例如igg、iga和igd包括ch1、ch2和ch3，而igm和ige则包括chl、ch2、ch3和ch4。
30.实施例1：猪细小病毒vp2蛋白的制备
31.本发明使用的猪细小病毒vp2蛋白由浙江海隆生物科技有限公司惠赠，其具体制备方法可参见中国发明专利cn 105349562 b的实施例。
32.实施例2：抗猪细小病毒vp2蛋白单克隆抗体的制备
33.使用常规的杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，简述如下：将实施例1制备的猪细小病毒vp2蛋白作为抗原，对6～8周龄balb/c雌性小鼠进行3次免疫，三免后3天后取脾细胞与骨髓瘤sp2/0进行细胞融合。用间接elisa方法对培养上清进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法细胞克隆，获得1株较好的杂交瘤细胞，命名为6b2。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于小鼠腹水制备，并冻存，于液氮中长期保存。
34.取6～8周龄balb/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.5ml/只，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞1
×
106个。注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，4℃8000rpm离心3min，收集上清液，即为单抗腹水。取1倍体积腹水，加入2倍体积醋酸盐缓冲液(0.06mol/l，ph值4.8)，混合均匀后在室温下边搅拌边加入辛酸(30μl/ml腹水)，4℃澄清2h小时，以4℃12000rpm离心20min，收集上清。再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃静置2小时，4℃3000rpm离心30min，收集沉淀。用2倍体积pbs溶解沉淀后用pbs透析过夜，即获得纯化的腹水抗体，置于-70℃保存备用。使用bca试剂盒对单克隆抗体进行浓度检测，单克隆抗体的检测结果为2.25mg/ml，将抗体分别分装成0.5ml/管，70℃以下保存备用。
35.实施例3：单克隆抗体的性能测定
36.抗体特异性检测：分别取单克隆抗体对不同病毒提取的总蛋白进行werstern blot检测，以判断其特异性，结果显示(图1)，单克隆抗体对其他猪病均为阴性，检测猪细小病毒vp2蛋白为阳性，说明单克隆抗体的特异性良好。
37.类及亚类测定：用elisa试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，鉴定结果显示，单克隆抗体重链恒定区为lgg1型，轻链恒定区为kappa型。
38.hrp标记性能测定：使用经典的高碘酸钠法或者市购的hrp标记试剂盒对单克隆抗体进行hrp标记，并使用直接elisa方法(包被猪细小病毒vp2蛋白，包被量为1μg/ml)测定标记效价(od值≥1.0时判阳性)，结果为1:20000。说明hrp标记成功，标记效率较高，符合试剂盒开发需要。
39.单克隆抗体可变区序列的测定：参见中国发明专利(cn 111393525 b)实施例5的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定，重链可变区和轻链可变区的序列如表1所示。
40.表1单克隆抗体氨基酸序列信息
[0041][0042]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种猪细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能特异性结合猪细小病毒vp2蛋白，所述的单克隆抗体的的重链可变区序列如seq idno.1所示，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述的重链可变区的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的序列分别为：cdr-h1：tnyliee；cdr-h2：ytcnpgslrtkynefkc；cdr-h3：dgpwsdad。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，所述的轻链可变区的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的序列分别为：cdr-l1：kssqsslnsfnqkkylas；cdr-l2：gastrqs；cdr-l3：qnlhsypft。4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区序列还包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，所述的重链可变区的fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4的序列分别为：fr-h1：qvqlqqsgqeevrpgqtsgkvscaasgyfaf；fr-h2：wvkqpgqgliwig；fr-h3：kawltadmcsgnsymqhsslksddadyfcar；fr-h4：wgqgtlvtvsa。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列还包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，所述的轻链可变区的fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4的序列分别为：fr-l1：diwmtqsvsslrvsagekvtmad；fr-l2：fyqqkpgqppqlliy；fr-l3：gvperfeggsgegtdstltyssveaedlayvyc；fr-l4：fhsgtkleik。6.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在检测猪细小病毒vp2蛋白中的应用。

技术总结
本发明公开了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合猪细小病毒VP2蛋白，所述的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开的单克隆抗体具有特异性好、亲和力好的优点，可以用于猪细小病毒VP2蛋白的检测以及相关检测产品的开发。病毒VP2蛋白的检测以及相关检测产品的开发。


技术研发人员：查银河 张稳涛 余晓玉 王芳 盖其静
受保护的技术使用者：浙江洪晟生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/7/21