新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及应用与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及应用。


背景技术：

2.单宁又称单宁酸或原花青素，广泛存在于植物界中，如葡萄、桃子和李子等水果中以及高粱、龙爪稷、和大麦等作物籽粒中，而在三大粮食作物水稻、小麦和玉米籽粒中并不含有单宁。单宁具有多种生物学功能，如肠道收敛、抗炎、抗菌、抗寄生虫、抗过敏、抗氧化、紫外线保护以及免受昆虫、鸟类对谷物籽粒的啄食。
3.高粱是是世界第五大粮食作物，在食品、饲料、纤维、酿造和生物能源原料等方面具有广泛的应用。高粱籽粒中单宁含量的高低影响高粱籽粒的用途。由于高粱中的单宁不仅能抑制杂菌的生长，而且在酿造过程中还会产生丁香酸和丁香醛，使白酒具有独特的风味，因此酿酒高粱要求单宁含量较高(＞1％)。而单宁会导致高粱籽粒具有苦涩感，适口性较差，所以食用和饲用籽粒高粱通常单宁含量较低(＜0.5％)。
4.高粱籽粒的单宁合成由一对基因控制(tan1和tan2)，任一基因的功能缺失都会导致高粱籽粒无单宁或者低单宁，其中tan2基因，是一个含有bhlh结构域的转录因子。根据前人研究报道，到目前为止已经发现了三个功能缺失的复等位基因，分别为tan2-a、tan2-b和tan2-c。
5.目前，针对禾谷类作物单宁形成、调控等分子基础的研究还处于初始阶段，除tan2-a、tan2-b和tan2-c三种基因外，其他与单宁有关的基因还没有鉴定，更缺乏用于单宁育种的功能分子标记。因此，亟需设计一种新的复等位基因的分子标记鉴别方法及应用，以填补现有技术的空白。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：世界上五大主要粮食作物中，只有高粱籽粒中具得有单宁。由于我国高粱的主要用途是酿造蒸馏白酒，而高粱中单宁含量对白酒风味物质的形成具有重要作用，所以选育单宁高粱品种对我国白酒工业意义重大。但是在我国北方地区，长期把高粱作为粮食的传统，由于单宁对粮食口感产生不好影响，所以当地农民更倾向于选育无单宁的高粱品种。目前，在控制高粱单宁合成的两基因中，tan2基因在中国高粱群体中具有较为丰富的等位变异，但是除tan2-a、tan2-b和tan2-c三个隐形等位基因外，还没有鉴定其他隐形等位变异基因，并且缺乏用于不同单宁含量品种育种选育的功能分子标记，影响了我国酒用和食用高粱新品种的分子标记辅助育种的实施。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及应用，尤其涉及一种鉴别调控高粱籽粒单宁合成基因tan2新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及其应用。
8.本发明是这样实现的，一种新复等位基因tan2-d，所述新复等位基因tan2-d的核
苷酸序列为seq id no：1。
9.本发明的另一目的在于提供一种所述的新复等位基因tan2-d在功能分子标记开发中的应用，所述tan2-d基因的功能分子标记开发方法包括：
10.(1)根据tan2基因第八个外显子378bp的snp变异开发基于pcr技术鉴定tan2-d的功能分子标记m1；
11.(2)由引物对tan2d-f和tan2d-r从高粱基因组dna中扩增核苷酸序列，bfal酶切后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，区分高粱tan2和tan2-d基因。
12.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的新复等位基因tan2-d的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，所述新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法包括：
13.通过全基因组关联分析扫描多年多点高粱籽粒单宁含量性状，对高单宁与低单宁高粱品系的tan2基因测序并比对，发现新的tan2等位变异位点tan2-d。
14.以引物tan2d-f和tan2d-r扩增高粱显性基因tan2和隐性基因tan2的基因部分开放阅读框，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，完成tan2和tan2-a的鉴定。
15.进一步，所述引物tan2d-f的核苷酸序列为seq id no：2，所述引物tan2d-r的核苷酸序列为seq id no：3。
16.进一步，所述tan2-a基因的pcr片段经bfal酶切后产生127bp和104bp两条带；tan2基因的pcr片段无法被酶切，条带大小为231bp。
17.进一步，所述tan2基因的全基因组关联分析包括：
18.利用不同来源的高粱品种资源开展籽粒单宁含量的调查，并对性状进行全基因组关联分析，在第2染色体38.40kb的位置检测到控制单宁含量的基因tan2，所述基因tan2为bhlh家族转录因子；
19.通过设计跨叠引物，在高单宁品种和低单宁品种中进行pcr扩增、测序和序列拼接，获得基因的全长基因组序列，并将高单宁品种和低单宁品种的序列与高粱参考基因组btx623序列进行比对。
20.进一步，所述新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法包括以下步骤：
21.步骤一，利用tan2-d的功能标记m1对待鉴别材料进行pcr扩增，模板为所述待鉴别材料的基因组dna，得到pcr扩增产物；
22.步骤二，进行bfal酶切反应，并将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据检测结果进行基因tan2和tan2-d的鉴定。
23.进一步，所述步骤一中的pcr扩增反应体系如下：
24.高粱基因组dna 1μl，正反向引物各1μl，takara ex taq 0.2μl，10
×
ex buffer 2μl，2mm的dntp 2μl，dd h2o 12.8μl，总体积20μl；反应在bio-rad t100tm thermal cyclerpcr仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性2min；98℃10s、60℃30s、68℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
25.进一步，所述步骤二中的bfal酶切反应体系如下：
26.pcr产物10μl，dd h2o 18μl，10x buffer tango 2μl，fspbi 1μl，总体积31μl：反应在37℃金属浴中孵育16h，4℃保存。
27.进一步，所述步骤二中的酶切产物的电泳检测包括：
28.酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若产物仅含有231bp片段，则待测高
粱的单宁基因为tan2；若产物包含有127bp和104bp两种片段，则待测高粱的单宁2基因为tan2-d。
29.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
30.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
31.tannin2(tan2)基因是调控高粱单宁合成的关键基因，目前存在3种隐性复等位基因(tan2-a、tan-b和tan2-c)，本发明公开了一种鉴别tan2新复等位基因tan2-d的方法，以tan2d-f(gcagtcacccgagttacaaa)和tan2d-r(attctgattcgcaccgtacc)扩增高粱显性基因tan2和隐性基因tan2基因部分开放阅读框，tan2-d和tan2相比，第八个外显子上低378位碱基发生c突变为t的snp变异，由于碱基变异产生bfal新的酶切位点，tan2-d基因的pcr片段经bfal酶切后产生127bp和104bp两条带，而tan2基因的pcr片段无法被酶切，其条带大小为231bp，根据上述结果完成tan2和tan2-d的鉴定。本发明开发了功能标记，可以准确检测复等位基因tan2-d在高粱品种中的分布情况，筛选含有或不含有等位变异的高粱种质资源，同时还可以在育种群体中进行标记辅助选择，选育含有及不含单宁的高粱新品种，用于酿酒、食品及饲料等不同用途。
32.本发明提供的一个新的tan2等位变异，命名为tan2-d，含有此等位变异的高粱材料籽粒均不含有单宁。与tan2相比，tan1-d是由于第八个外显子上631位碱基发生c突变为t的snp变异，产生了tag的终止密码子，导致基因提前终止而丧失功能。本发明开发能够快速、有效鉴定tan2-d等位变异的分子标记，可以标记辅助育种技术，提高高粱单宁新品种的育种效率。
33.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
34.本发明具体涉及一种控制高粱籽粒单宁合成基因tannin2的新复等位基因tan2-d和其功能标记的开发及相应引物，为培育低单宁含量高粱种质资源提供更加完善、准确的检测手段。
35.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
36.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
37.利用本发明设计的功能标记，开展不同单宁含量高粱品种的分子标记辅助育种，可有效提高酒用高粱和食用新品种的选育效率。
38.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
39.高粱单宁合成基因tan2在中国高粱群体中具有较为丰富的等位变异，但是国外研究团队鉴定出来它的三个隐形等位变异(tan2-a、tan2-b和tan2-c)。而由本发明获得的第四个隐形等位变异(tan2-d)填补了我国研究高粱单宁合成的技术空白。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于
本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
41.图1是本发明实施例提供的新复等位基因tan2-d分子标记鉴别方法流程图；
42.图2是本发明实施例提供的全基因组关联分析结果示意图；
43.图3是本发明实施例提供的基因tan2为bhlh家族转录因子的示意图；
44.图4是本发明实施例提供的序列比对结果示意图；
45.图5是本发明实施例提供的酶切产物的电泳检测结果示意图；
46.图6是本发明实施例提供的新复等位基因tan2-d分子标记鉴别方法原理图。
具体实施方式
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
48.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
49.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
50.本发明实施例提供了一种定位和克隆控制高粱单宁含量的新复等位基因tan2-d。通过全基因组关联分析(genome-wide association study，gwas)扫描多年多点高粱籽粒单宁含量的性状，在第2染色体38.40kb检测到显著关联的位点，与控制单宁含量的基因tan2(sobic.002g076600)位置一致，该基因为bhlh家族转录因子。对高单宁与低单宁高粱品系的tan2基因测序并比对序列，发现了一个新的tan2等位变异位点，命名为tan2-d。
51.与tan2基因相比，tan2-d基因是由于第八个外显子第631位碱基发生c突变为t的snp变异，产生了tag的终止密码子，导致基因提前终止而丧失功能。含有此等位变异位点的高粱资源籽粒单宁含量均低于0.05％。在此基础上，以引物：tan2d-f(gcagtcacccgagttacaaa)和tan2d-r(attctgattcgcaccgtacc)扩增高粱tan2和tan2-d基因部分开放阅读框，由于碱基变异产生了bfal的酶切位点，tan2-a基因的pcr片段经bfal酶切后产生127bp和104bp两条带，而tan2基因的pcr片段无法被酶切，其条带大小为231bp，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可以完成tan2和tan2-a的鉴定。
52.如图1所示，本发明实施例提供的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法包括以下步骤：
53.s101，利用tan2-d的功能标记m1对待鉴别材料进行pcr扩增，模板为所述待鉴别材料的基因组dna，得到pcr扩增产物；
54.s102，进行bfal酶切反应，并将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据检测结果进行基因tan2和tan2-d的鉴定。
55.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
56.实施例1：分离和克隆tan2基因
57.(1)tan2基因的全基因组关联分析
58.利用248份来自中国不同省份的高粱品种资源，在贵州、杭州、陵水和乐东四地开
展了籽粒单宁含量的调查，并对该性状进行了全基因组关联分析(见图2)，在第2染色体38.40kb的位置检测到控制单宁含量的基因tan2(sobic.002g076600)，该基因为bhlh家族转录因子(见图3)。
59.(2)tan2基因的分离
60.通过设计跨叠引物，在5个高单宁品种和5个低单宁品种中进行pcr扩增、测序和序列拼接，获得该基因的全长基因组序列。
61.(3)序列比对
62.将5个高单宁品种和5个低单宁品种的序列，与高粱参考基因组btx623序列进行比对，结果表明当籽粒有单宁时，tan2基因与参考基因组的序列完全相同，为正常序列，而当籽粒低单宁时，该基因在第八个外显子第378位碱基发生c突变为t的snp变异，产生了tag的终止密码子，导致基因提前终止而丧失功能，最终影响高粱单宁的含量(见图4)。
63.(4)tan2-d基因的功能分子标记开发
64.根据tan2基因第八个外显子378bp的snp变异(c/t)开发了基于pcr技术的鉴定tan2-d的功能分子标记m1，由引物对tan2d-f和tan2d-r从高粱基因组dna中扩增的核苷酸序列，bfal酶切后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可以区分高粱tan2和tan2-d基因(见图5)。
65.所述引物对的核苷酸序列如下所示：
66.正向引物为(m3-f)seq id no：1：gcagtcacccgagttacaaa
67.反向引物为(m3-r)seq id no：2：attctgattcgcaccgtacc
68.实施例2：tan2-d基因功能分子标记对高粱品种的检测
69.本发明实施例利用20份已知单宁含量的不同来源高粱品种资源(见表1)，对分子标记m1的适用性进行验证。
70.表1不同来源的高粱品种资源
[0071][0072]
本发明实施例提供的鉴定方法，包含以下步骤：
[0073]
(1)利用tan2-d的功能标记m1对表1所示的供试材料进行pcr扩增，模板为上述供试材料的基因组dna，得到pcr扩增产物。
[0074]
pcr扩增反应体系如下：
[0075]
高粱基因组dna 1μl，正反向引物各1μl，takara ex taq 0.2μl，10
×
ex buffer 2μl，dntp(2mm)2μl，dd h2o 12.8μl，总体积20μl；反应在bio-rad t100tm thermal cycler pcr仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性2分钟；98℃10秒、60℃30秒、68℃30秒，35个循环；72℃5分种；4℃保存。
[0076]
(2)bfal酶切反应体系如下：
[0077]
pcr产物10μl，dd h2o 18μl，10x buffer tango 2μl，fspbi 1μl，总体积31μl：反应在37℃金属浴中孵育16h，4℃保存。
[0078]
(3)酶切产物的电泳检测
[0079]
酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若产物仅含有231bp片段，则待测高
粱的单宁基因为tan2；若产物包含有127bp和104bp两种片段，则待测高粱的单宁2基因为tan2-d。
[0080]
结果如图5～6所示，20份不同来源的高粱品种资源；功能分子标记m1在鉴定20高粱品种的粒形性状中，特异性条带统计结果与单宁含量完全一致，正确率为100％，显示该分子标记适用性较强，在育种实践中可以用于对tan2-d基因进行快速鉴定筛选。
[0081]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0082]
利用tan-d设计的功能标记，可以在高粱苗期直接进行标记筛选。通过提取苗期叶片dna，利用pcr技术扩增目标片段。如果扩增出现两个目标片段的长度为104bp和127bp，说明这个株系将收获高粱籽粒不含单宁，可用于加工高粱米，做成食物直接食用。而如果扩增目标片段长度为231bp，说明这个株系收获的高粱种子含有单宁，可用于酿造白酒。这有效地加快了高粱不同的育种目标的实现。
[0083]
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
[0084]
传统高粱品种选育，需要通过5-8年的时间才能获得新品种，而利用功能分子标记辅助育种技术，可以有效减少假阳性，能够将育种时间缩短一半，大大提高了新品种选育速度。
[0085]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种新复等位基因tan2-d，其特征在于，所述新复等位基因tan2-d的核苷酸序列为seq id no：1。2.一种如权利要求1所述的新复等位基因tan2-d在功能分子标记开发中的应用，其特征在于，所述tan2-d基因的功能分子标记开发方法包括：(1)根据tan2基因第八个外显子378bp的snp变异开发基于pcr技术鉴定tan2-d的功能分子标记m1；(2)由引物对tan2d-f和tan2d-r从高粱基因组dna中扩增核苷酸序列，bfal酶切后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，区分高粱tan2和tan2-d基因。3.一种应用如权利要求1所述的新复等位基因tan2-d的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法包括：通过全基因组关联分析扫描多年多点高粱籽粒单宁含量性状，对高单宁与低单宁高粱品系的tan2基因测序并比对，发现新的tan2等位变异位点tan2-d；以引物tan2d-f和tan2d-r扩增高粱显性基因tan2和隐性基因tan2的基因部分开放阅读框，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，完成tan2和tan2-a的鉴定。4.如权利要求3所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述引物tan2d-f的核苷酸序列为seq id no：2，所述引物tan2d-r的核苷酸序列为seq id no：3。5.如权利要求3所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述tan2-a基因的pcr片段经bfal酶切后产生127bp和104bp两条带；tan2基因的pcr片段无法被酶切，条带大小为231bp。6.如权利要求3所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述tan2基因的全基因组关联分析包括：利用不同来源的高粱品种资源开展籽粒单宁含量的调查，并对性状进行全基因组关联分析，在第2染色体38.40kb的位置检测到控制单宁含量的基因tan2，所述基因tan2为bhlh家族转录因子；通过设计跨叠引物，在高单宁品种和低单宁品种中进行pcr扩增、测序和序列拼接，获得基因的全长基因组序列，并将高单宁品种和低单宁品种的序列与高粱参考基因组btx623序列进行比对。7.如权利要求3所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法包括以下步骤：步骤一，利用tan2-d的功能标记m1对待鉴别材料进行pcr扩增，模板为所述待鉴别材料的基因组dna，得到pcr扩增产物；步骤二，进行bfal酶切反应，并将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据检测结果进行基因tan2和tan2-d的鉴定。8.如权利要求7所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中的pcr扩增反应体系如下：高粱基因组dna1μl，正反向引物各1μl，takaraextaq0.2μl，10
×
ex buffer2μl，2mm的dntp2μl，ddh2o12.8μl，总体积20μl；反应在bio-rad t100tmthermalcyclerpcr仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性2min；98℃10s、60℃30s、68℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
9.如权利要求7所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述步骤二中的bfal酶切反应体系如下：pcr产物10μl，ddh2o18μl，10xbuffertango2μl，fspbi1μl，总体积31μl：反应在37℃金属浴中孵育16h，4℃保存。10.如权利要求7所述的新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法，其特征在于，所述步骤二中的酶切产物的电泳检测包括：酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若产物仅含有231bp片段，则待测高粱的单宁基因为tan2；若产物包含有127bp和104bp两种片段，则待测高粱的单宁2基因为tan2-d。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种新复等位基因tan2-d的分子标记鉴别方法及应用，通过全基因组关联分析扫描多年多点高粱籽粒单宁含量性状，对高单宁与低单宁高粱品系的Tan2基因测序并比对，发现新的Tan2等位变异位点tan2-d；以引物tan2d-F和tan2d-R扩增高粱显性基因Tan2和隐性基因tan2的基因部分开放阅读框，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，完成Tan2和tan2-a的鉴定。本发明可以准确检测复等位基因tan2-d在高粱品种中的分布情况，筛选含有或不含有等位变异的高粱种质资源，并可以在育种群体中进行标记辅助选择，选育含有及不含单宁的高粱新品种，用于酿酒、食品及饲料等不同用途。食品及饲料等不同用途。食品及饲料等不同用途。


技术研发人员：张立异 丁延庆 徐建霞 程斌 曹宁 高旭 冯周
受保护的技术使用者：贵州省旱粮研究所（贵州省高粱研究所）（贵州省玉米工程技术研究中心）
技术研发日：2022.07.28
技术公布日：2023/7/21