一种高效降解粗纤维的复合酶

1.本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及由两种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因及其编码的酶构建的一种高活性纤维素复合酶。
2.大额牛主要生长在云南省怒江州的部分地区，以竹子为食，是我国特殊的珍稀牛种。大额牛外型与印度野牛最为相似，染色体数相同(2n＝58)，而普通牛和瘤牛染色体数目为(2n＝60)。大额牛生存条件极其恶劣，主食富含粗纤维的当地竹子，但仍能保持较好的生长速度，很明显，大额牛瘤胃内分解粗纤维的微生物的数量和活性优于其他牛种。研究发现大额牛瘤胃内总活细菌和纤维降解菌及对竹子、稻草和苜蓿等木质纤维饲料的干物质体外消化率显著高于同一生境的黄牛，这一现象提示大额牛瘤胃具有高效降解粗纤维的微生物以及纤维素酶或基因。因此，大额牛无疑是发掘高效粗纤维降解酶的珍贵种质资源。
3.以往的众多研究多集中在单一纤维素酶基因在大肠杆菌中的表达来获得纤维素酶，而纤维素复合酶多基因的共表达研究较少；如果想获得大额牛瘤胃更高效的粗纤维降解复合酶，有必要利用人工设计的纤维素复合酶在大肠杆菌中的协同共表达来完成。因此，挖掘大额牛瘤胃高效降解粗纤维的纤维素复合酶，可以极大地提升大额牛种用价值，也可为纤维素酶复合酶的开发应用打下基础。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种来源于大额牛瘤胃的高效降解粗纤维的复合酶的构建及表达方法，这对开发成新型的纤维素复合酶资源等提供坚实的理论基础。
5.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
6.所述的高效降解粗纤维的复合酶umcel-1_umcel-2，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.所述的高效降解粗纤维的复合酶umcel-1_umcel-2在降解粗纤维中的应用，其酶最适温度范围在35℃～50℃，酶最适ph范围在5.5～7.0。
8.所述的高效降解粗纤维的复合酶基因，编码上述复合酶umcel-1_umcel-2。
9.所述的高效降解粗纤维的复合酶基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.包含上述复合酶基因的重组表达载体。
11.包含上述复合酶基因的重组表达载体umcel-1_umcel-2/pet30a(+)。
12.包含上述复合酶基因的重组表达菌株。
13.本发明的有益效果：
14.本发明由从大额牛瘤胃细菌fosmid文库中筛选得到的umcel-1基因和umcel-2基因构建出纤维素酶共表达基因umcel-1_umcel-2。
15.umcel-1_umcel-2/pet30a(+)重组蛋白在e.coli bl
21
中能表达出纤维素酶活性，且能对竹粉、稻草及苜蓿都有降解作用，umcel-1_umcel-2酶反应的最适温度是40℃，最适ph为6.5；温度在20℃～40℃，ph在5～7时酶活较稳定。由从大额牛瘤胃中获得的umcel-1基因和umcel-2基因构建的umcel-1_umcel-2基因能表达出纤维素酶活性，其纤维素酶活性比
umcel-1基因和umcel-2基因单独表达的活性都高，且对竹粉、稻草及苜蓿的降解作用高于umcel-1基因和umcel-2基因表达的酶。这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因编码的酶高效降解竹子等粗纤维饲料以及为后续运用分子改造等手段将高效纤维素酶基因开发成新型的酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。
附图说明
16.图1是umcel-1/pet30a(+)、umcel-2/pet30a(+)、umcel-1_umcel-2/pet30a(+)的cmc底物平板纤维素酶活性检测。
17.图2是umcel-1、umcel-2和umcel-1_umcel-2酶对竹粉降解的平板纤维素酶活性检测。
18.图3是umcel-1、umcel-2和umcel-1_umcel-2酶对稻草降解的平板纤维素酶活性检测。
19.图4是umcel-1、umcel-2和umcel-1_umcel-2酶对苜蓿降解的平板纤维素酶活性检测。
20.图5是umcel-1_umcel-2基因酶切电泳图；其中，m：1kb ladder dnamarker；umcel-1_umcel-2：umcel-1_umcel-2酶切产物。
21.图6是umcel-1_umcel-2纯化蛋白在37℃、15℃、0.2mm iptg、1.0mm iptg不同条件下的sds-page电泳图；其中：
[0022][0023]
图7是umcel-1_umcel-2纯化蛋白sds-page电泳图；其中，m：蛋白maker；umcel-1_umcel-2：umcel-1_umcel-2。
[0024]
图8是umcel-1_umcel-2纯化蛋白wb电泳图。
[0025]
图9是蛋白质浓度标准曲线。
[0026]
图10是葡萄糖浓度标准曲线。
[0027]
图11是umcel-1_umcel-2酶反应最适底物浓度。
[0028]
图12是umcel-1_umcel-2酶反应最适温度。
[0029]
图13是umcel-1_umcel-2酶反应最适ph。
[0030]
图14是umcel-1_umcel-2酶反应的温度稳定性。
[0031]
图15是umcel-1_umcel-2酶反应的ph稳定性。
[0032]
图16是umcel-1_umcel-2酶与umcel-1酶及umcel-2酶在不同底物浓度下的酶活性差异比较。
[0033]
图17是umcel-1_umcel-2酶与umcel-1酶及umcel-2酶在不同温度下的酶活性差异比较。
[0034]
图18是umcel-1_umcel-2酶与umcel-1酶及umcel-2酶在不同ph下的酶活性差异比较。
具体实施方式
[0035]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0036]
【实施例1】纤维素酶共表达基因的构建方案
[0037]
1.fosmid文库中纤维素酶编码基因筛选
[0038]
从前期已构建的大额牛瘤胃fosmid文库中挑选纤维降解酶基因：对序列reads组装，得到contigs序列，根据contig实际的拼接结果，进行基因预测，对基因预测结果与公共数据库的cazy等数据库进行blastx比对，对分类同时属于gh5和gh9的基因进行生物信息学分析，从中挑选出纤维素酶基因umcel-1和umcel-2。
[0039]
2.序列分析
[0040]
基因umcel-1全长为999bp的，编码332个氨基酸；预测umcel-1编码的蛋白质等电点(pi)为5.01，理论分子量(mw)为82751.80da，umcel-1蛋白无信号肽，无跨膜区，疏水性正常。umcel-1蛋白组件结构。其编码的氨基酸序列显示第109～303个氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域。umcel-1的蛋白分子量为36.8kda。
[0041]
umcel-1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0042]
基因umcel-2全长为1287bp，编码425个氨基酸；预测umcel-2编码的蛋白质等电点(pi)为4.13，理论分子量(mw)为46783.30da，umcel-2蛋白无信号肽，存在跨膜区，跨膜区位于蛋白序列第23个氨基酸处。umcel-2蛋白组件结构，其中紫色部分表示低复杂性结构域。umcel-2编码的氨基酸序列显示第33～334个氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域。umcel-2的蛋白分子量为46.8kda。
[0043]
umcel-2蛋白的核苷酸序列如seq id no.5所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0044]
3.umcel-1_umcel-2双启动子构建方案：
[0045]
基因共表达载体为pet30a(+)，共表达载体酶切位点为xbai(tctaga)和hind iii(aagctt)。xbai(tctaga)置于his标签的5’端，hind iii(aagctt)置于基因umcel-2碱基序列的3’端。基因共表达产生的蛋白都使用his标签(mhhhhhhssg)纯化。
[0046]
质粒umcel-1_umcel-2基因共表达模式：双启动子系统，使用共表达载体pet30a(+)，连接结构为：t7启动子+乳糖操纵子+xbai+rbs+his-umcel-2+hindiii+t7终止子+t7启动子+乳糖操纵子+rbs+his-umcel-1+xhoi+t7终止子。
[0047]
单基因质粒合成后，钓取基因umcel-1和umcel-2并亚克隆至共表达载体pet30a(+)上，根据基因共表达模式通过融合基因方法构建基因共表达质粒umcel-1_umcel-2。
[0048]
【实施例2】纤维素酶umcel-1_umcel-2基因原核表达
[0049]
一、方法
[0050]
1.刚果红染色法验证酶活
[0051]
将菌液接种到含2％cmc-na底物的lb固体培养基平板上(含0.1％vkana(卡那霉素)，竹粉、稻草和苜蓿均粉碎至250目)，37℃过夜培养16小时，次日用刚果红染色法确定是否有纤维素酶活性，并用0.5％竹粉、稻草和苜蓿作为底物，检验共表达的复合酶能否降解竹粉、稻草和苜蓿。2.酶切验证umcel-1_umcel-2基因
[0052]
对pet30a(+)—umcel-1_umcel-2进行ndei-saci酶切。使用限制性内切酶ndei和saci对pet30a(+)—umcel-1_umcel-2进行pcr反应，然后进行电泳实验。
[0053]
3.umcel-1/pet30a(+)重组蛋白的表达纯化检测
[0054]
转化：将重组质粒转入bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，42℃热激后涂布在含有30μg/ml卡那霉素的平板上，37℃培养；
[0055]
活化：挑取单克隆菌落到含有30μg/ml卡那霉素的液体培养基中37℃培养；
[0056]
诱导：当od值达到0.6时，添加诱导剂iptg，继续培养，分别于15℃条件下培养过夜，37℃条件下培养4h，未添加诱导剂的为阴性对照；
[0057]
收集菌体：4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
[0058]
表达检测：在收集到的菌体中加入缓冲液a悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶解。离心收集上清和沉淀，沉淀使用缓冲液b进行溶解，分别对上清和沉淀蛋白进行制样，准备上胶检测。再表达：在lb液体培养基中(含0.1％v kana)，当od值达到0.6时，添加1.0mmol诱导剂iptg在37℃培养一夜后大量表达，离心收集细胞体。
[0059]
再表达：在含30μg/ml卡那霉素的培养基中培养菌液，当od值达到0.6时，添加1.0mm诱导剂iptg，37℃条件下培养过夜进行大量表达，离心收集细胞菌体。
[0060]
收集粗蛋白：细胞菌体用缓冲液c溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；
[0061]
平衡：取5ml ni-nta，用5倍柱床体积的binding buffer清洗平衡柱子；
[0062]
上柱：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h，收集流出；
[0063]
平衡：用binding buffer清洗平衡柱子；
[0064]
洗杂：用washingbuffer洗柱子，并收集流出；
[0065]
洗脱：用elutionbuffer洗脱，收集流出；
[0066]
纯化检测：对粗蛋白、流出组分分别处理，制样，准备sds-page检测。
[0067]
收集处理：将纯化后的组分5透析到蛋白保存缓冲液pbs,300mm nacl,10％glycerol,ph 7.4中，透析结束后用peg20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1ml/tube，-80℃保存。
[0068]
sds-page检测:蛋白质样品制备，采用12％分离凝胶和5％浓缩凝胶，电泳实验，分子量检测。
[0069]
western-blot验证：处理并制备蛋白质样品。使用5％浓缩胶和12％分离胶。第一种抗体标记为鼠抗his标签，第二种标记为羊抗鼠。
[0070]
表2主要缓冲液
[0071][0072]
二、结果与分析
[0073]
1.刚果红染色法验证酶活
[0074]
通过刚果红平板染色可见基因umcel-1_umcel-2能成功的表达出纤维素酶活性(见图1)，且能降解竹粉、稻草和苜蓿，竹粉、稻草和苜蓿被分解后，周围出现的水解区域，颜色变浅(见图2、图3和图4)。
[0075]
2.umcel-1_umcel-2/pet30a(+)pcr酶切结果
[0076]
两条酶切条带清晰可见，两个酶切位点分别位于约2400bp处和5500bp处，分别是基因umcel-1_umcel-2和载体pet30a(+)(见图5)。说明基因umcel-1_umcel-2表达成功。
[0077]
3.umcel-1_umcel-2/pet30a(+)重组蛋白的表达纯化检测
[0078]
在不同温度和诱导剂浓度水平下，1-13各有两条深蓝色电泳条带，两条深蓝色电泳条带分别在两条水平线上(图6)，pet30a(+)—umcel-1_umcel-2重组质粒蛋白sds-page(见图7)和wb(见图8)分析结果发现分别有两条蛋白电泳条带，分别是基因umcel-1和基因umcel-2。估计umcel-1融合蛋白表达量约为36.8kda，估计umcel-2融合蛋白表达量约51.87kda，估计umcel-1_umcel-2融合蛋白表达量约为88.67kda。
[0079]
【实施例3】酶学特性研究
[0080]
1.umcel-1_umcel-2表达蛋白浓度的测定
[0081]
采用bradford法测蛋白浓度，purifiedbsa(10mg/ml)为标准蛋白母液。以标准蛋白浓度(ug/ml)为横坐标和对应的光吸收值od
595
为纵坐标绘制标准蛋白曲线(图9)。相关系数为0.9987。
[0082]
取纯化的umcel-1_umcel-2酶液，稀释50倍，采用标准蛋白测定方法，测定稀释50倍的纯化的umcel-1_umcel-2酶液，在酶标仪上测定od
595
吸光值，浓度(蛋白含量)。计算结果为纯化的umcel-1_umcel-2酶液浓度为1.25mg/ml。
[0083]
进行酶学表达实验时，将纯化的umcel-1_umcel-2酶液稀释3倍。
[0084]
2.葡萄糖浓度标准曲线的绘制
[0085]
以葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标和对应的光吸收值od
540
为纵坐标绘制葡萄糖浓度标准曲线(图10)。相关系数为0.9936。
[0086]
3.umcel-1_umcel-2酶反应最适底物浓度
[0087]
如图在cmc-na浓度(0.5％-4.5％)测定umcel-1_umcel-2酶酶活，浓度为2.5％时的相对酶活值最大，假定为100％，通过计算不同cmc-na浓度下的相对酶活做曲线结果如图11。从图中可知，cmc-na浓度在1.5％～4.5％之间时umcel-1_umcel-2酶的相对酶活在70％以上，0.5％时相对酶活最低，但仍还有相对最高酶活的43％。
[0088]
4.umcel-1_umcel-2酶反应的最适温度
[0089]
如图10，测定温度在25℃～65℃条件时umcel-1_umcel-2表达蛋白的酶活，结果与最适温度测定的umcel-1_umcel-2酶活比较(假定最适温度条件下的酶活性为100％)，计算以上不同温度条件下的相对酶活性。结果表明umcel-1_umcel-2酶活在40℃时最大，反应温度在35℃～50℃之间时umcel-1_umcel-2酶的相对酶活在70％以上，温度在65℃时酶活性较低，但仍还有相对最高酶活的26％。
[0090]
5.umcel-1_umcel-2酶反应的最适ph
[0091]
在40℃的水浴条件下分别测定umcel-1_umcel-2蛋白在ph＝3.0～9.0时的酶活，假定最适ph条件下的酶活性为100％，分析不同ph条件下的相对酶活，结果如图13。由图可
知，umcel-1_umcel-2在ph6.5时酶活性最强，ph在5.5～7.0时的相对酶活高于70％，ph在4.5以下和8.0以上时的相对酶活在50％以下，当ph＝3.0时酶活性较低，但仍还有相对最高酶活的20％。因此umcel-1_umcel-2酶反应适宜的ph范围在5.5～7.0之间。
[0092]
6.umcel-1_umcel-2酶的温度稳定性
[0093]
以事先置于4℃保存的umcel-1_umcel-2酶液为最大酶活100％，分别计算各温度下的相对酶活。如图14，纯化酶在20℃～40℃条件下1h，umcel-1_umcel-2保持70％以上的酶活；说明umcel-1_umcel-2酶在小于40℃的温度范围内较稳定；但当温度达到50℃时，酶十分不稳定，酶活下降至35％；而置于60℃条件下的酶，酶活下降96％；温度下降至70℃时酶失活。此结果说明umcel-1_umcel-2酶在小于40℃的范围内还比较稳定。当高于40℃，酶就变得不稳定。
[0094]
7.umcel-1_umcel-2酶的酸碱稳定性
[0095]
以事先置于4℃保存的umcel-1_umcel-2酶液的活力为最大酶活100％，分别计算各ph值下的相对酶活。由图15可知，umcel-1_umcel-2酶在ph＝6.0时残留活力在70％以上，在ph＝5.0～7.0时残留活力在50％以上，ph＝3.0时仅剩5％的相对酶活。因此说明，纤维素酶umcel-1_umcel-2酶在ph＝6.0时较稳定。
[0096]
8.复合酶umcel-1_umcel-2与单一酶umcel-1及umcel-2的酶活比较
[0097]
分别比较复合酶umcel-1_umcel-2与单一酶umcel-1及umcel-2在不同底物浓度(图16)、不同温度(图17)、不同ph(图18)条件下的酶活性大小。
[0098]
由图16可知，在不同底物浓度条件下，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活均远大于单一酶umcel-1及umcel-2的酶活大小。在底物浓度是2.5％时，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活达到最大值，约200u/ml，是单一酶umcel-1及umcel-2最大值的2.3倍左右。
[0099]
由图17可知，在不同温度条件下，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活均远大于单一酶umcel-1及umcel-2的酶活大小。在温度达到40℃时，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活达到最大值，约270u/ml，是单一酶umcel-1及umcel-2最大值的2.5倍左右。
[0100]
由图18可知，在不同ph值条件下，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活均远大于单一酶umcel-1及umcel-2的酶活大小。在ph＝6.5时，复合酶umcel-1_umcel-2的酶活达到最大值，约279u/ml，是单一酶umcel-1及umcel-2最大值的2.4倍左右。
[0101]
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
[0102]
序列表
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]

技术特征：
1.一种高效降解粗纤维的复合酶umcel-1_umcel-2，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的一种高效降解粗纤维的复合酶umcel-1_umcel-2在降解粗纤维中的应用，其特征在于：其酶最适温度范围在35℃～50℃，酶最适ph范围在5.5～7.0。3.一种高效降解粗纤维的复合酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的复合酶umcel-1_umcel-2。4.如权利要求3所述的一种高效降解粗纤维的复合酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.2所示。5.包含权利要求3或4所述复合酶基因的重组表达载体。6.包含权利要求3或4所述复合酶基因的重组表达载体umcel-1_umcel-2/ pet30a(+)。7.包含权利要求3或4所述复合酶基因的重组表达菌株。

技术总结
本发明涉及一种高活性纤维素复合酶，属于基因工程领域，该高活性纤维素复合酶Umcel-1_Umcel-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该高活性纤维复合素酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从大额牛瘤胃中获得的基因Umcel-1和基因Umcel-2构建的Umcel-1_Umcel-2基因，能表达出纤维素酶活性，且酶活表现是Umcel-1或Umcel-2的两倍多，同时该复合酶能降解竹粉、稻草及苜蓿，这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因高效降解竹子等粗纤维饲料以及为后续运用分子改造等手段将高效纤维素酶基因开发成新型的复合酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。一定的理论基础和现实意义。


技术研发人员：杨舒黎 朱雅新 周子健 张光荣 苟潇 郑洁仪
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：2022.07.12
技术公布日：2023/7/21