川木通标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法与流程

1.本发明涉及药物分析及药物质量控制技术领域，特别是涉及一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法。


背景技术：

2.中药川木通为毛茛科植物小木通clematis armandii franch.或绣球藤clematis montana buch.-ham.的干燥藤茎，具有利尿通淋、清心除烦与通经下乳的功效。川木通主产于四川、贵州、云南和西藏等地区，野生资源丰富，是较为常用的中药。
3.川木通具有很高的药用价值和开发价值且毒性小，但药材市场上由于长期用药习惯及药材资源等多种原因引起实际生产及临床用药中区分不清，混用现象严重。目前关于川木通的化学成分研究报道较少，多集中在三萜皂苷、黄酮和甾醇类，而实际上木脂素类成分也是川木通的主要药效物质基础之一，尚未见到有关川木通木脂素类化学成分的分离、结构鉴定以及药理活性的研究报道。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供了一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，成功从川木通标准汤剂中分离纯化出5个化合物，化合物含量较高，均为从川木通中首次分离得到。
5.本发明通过如下技术方案实现。
6.一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：
7.获取川木通标准汤剂的提取物；
8.将所述提取物进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；其中，第一次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；
9.将fr.1进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；其中，第二次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；
10.将fr.4进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；其中，第三次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至100％；
11.将fr.1a进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；
12.将fr.1b进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2；
13.将fr.1c进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物3；
14.将fr.4d进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5。
15.在其中一个实施例中，所述川木通标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
16.将所述川木通标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩。
17.在其中一个实施例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(6～10):(90～94)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
18.在其中一个实施例中，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(13～17):(83～87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
19.在其中一个实施例中，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(18～22):(78～82)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
20.在其中一个实施例中，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(28～32):(68～72)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
21.在其中一个实施例中，第一次分段收集流分后还包括如下步骤：
22.采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；
23.其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
24.在其中一个实施例中，第二次分段收集流分后还包括如下步骤：
25.采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；
26.其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
27.在其中一个实施例中，第三次分段收集流分后还包括如下步骤：
28.采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；
29.其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
30.本发明还提供一种川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，包括如下步骤：
31.获取如上所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；
所述化学成分包括所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4与化合物5中的一种或多种；
32.将所述化学成分进行高效液相色谱与质谱联用测定；
33.其中，所述高效液相色谱的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～0.5min，流动相a的体积百分数为3％；0.5min～3min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；3min～5min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；5min～12min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.3ml/min～0.5ml/min；在200nm～400nm范围内进行全波扫描。
34.在其中一个实施例中，所述质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kv～0.9kv；锥孔电压为12v～18v；脱溶剂气温为420℃～480℃；离子源温度为120℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为8hz～12hz。
35.在其中一个实施例中，所述化合物1为腺苷；
36.所述化合物2为落叶松树脂醇-4,4
′‑
二-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；
37.所述化合物3为落叶松树脂醇-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；
38.所述化合物4为开环异落叶松树脂酚；
39.所述化合物5为落叶松树脂醇。
40.与现有技术相比较，本发明所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法具有如下有益效果：
41.本发明反复运用反相层析和半制备高效液相色谱分离技术，并限定每次反相层析的洗脱条件，成功从川木通标准汤剂中分离纯化出5个水溶性较大的化合物，生物活性基本明确，含量较高，且均为从川木通中首次分离得到，为川木通标准汤剂化学成分的深入研究提供依据，进一步地，为川木通药材、饮片及其制剂质量标准的提高提供有益参考。
附图说明
42.图1为本发明提供的化合物1的esi-ms图谱；
43.图2为本发明提供的化合物1在dmso-d6(400mhz)条件下的1h nmr图谱；
44.图3为本发明提供的化合物1在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr图谱；
45.图4为本发明提供的化合物1在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr与dept-135图谱；
46.图5为本发明提供的化合物2的esi-ms图谱；
47.图6为本发明提供的化合物2在dmso-d6(400mhz)条件下的1h nmr图谱；
48.图7为本发明提供的化合物2在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr图谱；
49.图8为本发明提供的化合物2在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr与dept-135图谱；
50.图9为本发明提供的化合物3的esi-ms图谱；
51.图10为本发明提供的化合物3在dmso-d6(400mhz)条件下的1h nmr图谱；
52.图11为本发明提供的化合物3在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr图谱；
53.图12为本发明提供的化合物3在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr与dept-135图谱；
54.图13为本发明提供的化合物4的esi-ms图谱；
55.图14为本发明提供的化合物4在dmso-d6(400mhz)条件下的1h nmr图谱；
56.图15为本发明提供的化合物4在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr图谱；
57.图16为本发明提供的化合物4在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr与dept-135图谱；
58.图17为本发明提供的化合物5的esi-ms图谱；
59.图18为本发明提供的化合物5在dmso-d6(400mhz)条件下的1h nmr图谱；
60.图19为本发明提供的化合物5在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr图谱；
61.图20为本发明提供的化合物5在dmso-d6(100mhz)条件下的
13
c nmr与dept-135图谱。
具体实施方式
62.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
63.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
64.本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
65.当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
66.除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。
67.除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。
68.本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
69.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
70.本发明提供了一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：
71.获取川木通标准汤剂的提取物；
72.将提取物进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；其中，第一次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；
73.将fr.1进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；其中，第二次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；
74.将fr.4进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；其中，第三次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至100％；
75.将fr.1a进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；
76.将fr.1b进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2；
77.将fr.1c进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物3；
78.将fr.4d进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5。
79.在一个具体的示例中，川木通标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
80.将川木通标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩。
81.更具体地，川木通标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
82.将川木通标准汤剂的冻干粉，与质量分数为70％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，减压浓缩。
83.更为具体地，川木通标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
84.取川木通标准汤剂冻干粉10g，用1000ml 70％甲醇超声溶解，滤过，取续滤液，减压浓缩，得70％提取物部位(cm部位)。
85.在一个具体的示例中，川木通饮片标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：
86.取川木通饮片200g，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮30分钟，趁热过滤，滤液迅速冷却。第二次加8倍量水，煎煮25分钟，趁热过滤，滤液迅速冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥。
87.在一个具体的示例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(6～10):(90～94)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
88.更具体地，第一次半制备高效液相色谱分离采用的洗脱剂为体积分数为8:92的乙腈与水的混合物。
89.更具体地，第一次半制备高效液相色谱分离采用的色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)。
90.在一个具体的示例中，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体
积分数为(13～17):(83～87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
91.更具体地，第二次半制备高效液相色谱分离采用的洗脱剂为体积分数为15:85的乙腈与水的混合物。
92.更具体地，第二次半制备高效液相色谱分离采用的色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)。
93.在一个具体的示例中，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(18～22):(78～82)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
94.更具体地，第三次半制备高效液相色谱分离采用的洗脱剂为体积分数为20:80的乙腈与水的混合物。
95.更具体地，第三次半制备高效液相色谱分离采用的色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)。
96.在一个具体的示例中，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(28～32):(68～72)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
97.更具体地，第四次半制备高效液相色谱分离采用的洗脱剂为体积分数为30:70的乙腈与水的混合物。
98.更具体地，第四次半制备高效液相色谱分离采用的色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)。
99.在一个具体的示例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
100.第二次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
101.第三次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
102.第四次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min。
103.在一个具体的示例中，第一次分段收集流分后还包括如下步骤：
104.采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；
105.其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
106.更具体地，第一次高效液相色谱分析的条件包括：柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为205nm；进样体积为10μl。
107.在一个具体的示例中，第二次分段收集流分后还包括如下步骤：
108.采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；
109.其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键
合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
110.更具体地，第二次高效液相色谱分析的条件包括：柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为205nm；进样体积为10μl。
111.在一个具体的示例中，第三次分段收集流分后还包括如下步骤：
112.采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；
113.其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。
114.更具体地，第三次高效液相色谱分析的条件包括：柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为205nm；进样体积为10μl。
115.本发明还提供一种川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，包括如下步骤：
116.获取上述川木通标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；化学成分包括化合物1、化合物2、化合物3、化合物4与化合物5中的一种或多种；
117.将化学成分进行高效液相色谱与质谱联用测定；
118.其中，高效液相色谱的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～0.5min，流动相a的体积百分数为3％；0.5min～3min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；3min～5min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；5min～12min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.3ml/min～0.5ml/min；在200nm～400nm范围内进行全波扫描。
119.更具体地，高效液相色谱的条件包括：柱温为30℃；流速为0.4ml/min；进样量为2μl。
120.更具体地，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(2.1mm
×
100mm,2.5μm)。
121.在一个具体的示例中，质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kv～0.9kv；锥孔电压为12v～18v；脱溶剂气温为420℃～480℃；离子源温度为120℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为8hz～12hz。
122.更具体地，质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.8kv；锥孔电压为15v；脱溶剂气温为450℃；离子源温度为150℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为10hz。
123.在一个具体的示例中，化合物1为腺苷；
124.化合物2为落叶松树脂醇-4,4
′‑
二-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；
125.化合物3为落叶松树脂醇-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；
126.化合物4为开环异落叶松树脂酚；
127.化合物5为落叶松树脂醇。
128.川木通具有利尿作用，研究显示，川木通的利尿作用与含有的甾醇、三萜皂苷和木脂素苷类成分有关。2020年中国药典在功能与主治上规定，川木通具有利尿通淋，清心除烦，通经下乳的功效，说明川木通的主要药效除了利尿之外，还应有抗菌、消炎、抗病毒，抗
肿瘤等功效。腺苷能够通过抑制中性粒细胞趋化、粘附、呼吸爆发及吞噬功能，抑制心肌缺血再灌注时中性粒细胞聚集及其损伤发挥抗炎作用，川木通所含的落叶松脂醇和开环异落叶松树脂酚具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗肿瘤、抗抑郁等作用。而落叶松树脂醇-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷和落叶松树脂醇-4,4
′‑
二-o-β-d-吡喃葡萄糖苷显示出对hsv病毒具有一定的抑制作用，可见腺苷、木脂素类成分均是川木通的重要活性成分。从川木通中分离得到的5种化合物生物活性基本明确，且含量较高，具有一定的专属性，能够为川木通药材、饮片及其制剂质量标准的提高提供有益参考。
129.以下结合具体实施例对本发明的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
130.实施例1
131.本实施例提供一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，具体如下：
132.一、仪器与试药
133.仪器：waters arc uhplc-dad-qda联用仪(美国waters公司)；岛津lc-20ar制备液相(日本岛津公司)；bruker avanceⅲ400mhz核磁共振波谱仪(德国bruker公司)；超纯水系统milli-q direct(德国默克公司)；万分之一天平me204e(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器kq-500de(中国昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：waters xselect hss t3 c18(250mmx4.6mm,5μm)柱子；试剂：甲醇(色谱纯，德国默克公司)、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。试药：川木通饮片。
134.二、实验过程
135.1、川木通标准汤剂冻干粉的制备
136.取川木通饮片200g，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮30分钟，趁热过滤，滤液迅速冷却。第二次加8倍量水，煎煮25分钟，趁热过滤，滤液迅速冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得到川木通饮片标准汤剂冻干粉。
137.2、川木通标准汤剂化学成分的提取与分离
138.取川木通标准汤剂冻干粉10g，用1000ml 70％甲醇超声溶解，滤过，取续滤液，减压浓缩，得70％提取物部位(cm部位)。cm部位进行ods柱层析，采用甲醇-水(10：90
→
100：0，v/v)梯度洗脱，并分段收集流分，采用高效液相色谱法对分段流分进样分析，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，以乙腈为流动相a，以水为流动相b，梯度洗脱(0～5min,3％a；5～20min,3％～18％a；20～30min,18％～22％a；30～60min,22％～35％a)；检测波长为205nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl。合并相同流分，得到四个流分(fr.1～fr.4)。
139.fr.1经ods柱分离，采用甲醇-水(10：90
→
100：0，v/v)梯度洗脱，并分段收集流分，采用高效液相色谱法对分段流分进样分析，色谱仪为waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，以乙腈为流动相a，水为流动相b，梯度洗脱(0～5min,3％a；5～20min,3％～18％a；20～30min,18％～22％a；30～60min,22％～35％a)；检测波长为205nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl。合并相同流分，得到6个子流分(fr.1a～fr.1f)。
140.fr.1a经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津lc-20ar制备液相，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为8：92，等度
洗脱，流速为2ml/min，得到化合物1(≤10.0mg)；
141.fr.1b经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津lc-20ar制备液相，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为15：85，等度洗脱，流速为2ml/min，分离得到化合物2(≤5.0mg)；
142.fr.1c经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津lc-20ar制备液相，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为20：80，等度洗脱，流速为2ml/min，得到化合物3(≤5.0mg)；
143.fr.4经ods柱层析，乙腈-水(3：97-100：0，v/v)梯度洗脱，分段收集流分，采用高效液相色谱法对分段流分进样分析，色谱仪为waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，以乙腈为流动相a，水为流动相b，梯度洗脱(0～5min,3％a；5～20min,3％～18％a；20～30min,18％～22％a；30～60min,22％～35％a)；检测波长为205nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl。合并相同流分，得到六个子流分(fr.4a～fr.4f)；
144.fr.4d经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津lc-20ar制备液相，色谱柱为waters xselect hss t3 c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为30：70，等度洗脱，流速为2ml/min，得到化合物4(≤6.0mg)和化合物5(≤5.0mg)。
145.实施例2
146.本实施例提供一种川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，具体如下：
147.一、实验过程
148.采用400mhz核磁共振波谱仪采集样品氢谱和碳谱，样品溶剂为dmso-d6；采用waters arc uhplc-dad-qda液相色谱质谱联用仪采集样品色谱图和质谱图。色谱柱为waters xselect hss t3 c18(2.1mm
×
100mm,2.5μm)，以乙腈为流动相a，水为流动相b，梯度洗脱(0～0.5min,3％a；0.5～3min,3％～18％a；3～5min,18％～22％a；5～12min,22％～35％a)；在200nm～400nm范围内进行全波扫描，柱温为30℃；流速为0.4ml/min，进样量为2μl；质谱离子源：电喷雾离子源(esi)；负离子模式扫描；毛细管电压为0.8kv，锥孔电压为15v，脱溶剂气温为450℃，离子源温度为150℃，扫描范围为m/z100
–
m/z1250，采样频率为10hz，对化合物1～5进行结构鉴定。
149.化合物1～5的结构鉴定谱图如图1～图20所示。
150.二、结构鉴定结果
151.1、化合物1
152.153.淡黄色粉末(甲醇-水)；esi-ms m/z:302[m+cl]-。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.35(1h,s,h-8),8.14(1h,s,h-2),7.37(2h,s,6-nh2),5.87(1h,d,j＝6.2hz,h-1
′
),5.47(2h,m,2
′
,5
′‑
oh),5.23(1h,s,3
′‑
oh),4.61(1h,m,h-2
′
),4.14(1h,s,h-3
′
),3.96(1h,q,j＝3.4hz,h-4
′
),3.68(1h,dt,j＝12.1,3.9hz,h-5
′
a),3.56(1h,m,h-5
′
b)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:156.2(c-6),152.4(c-2),149.1(c-4),139.9(c-8),119.4(c-5),87.9(c-1
′
),85.9(c-4
′
),73.4(c-2
′
),70.7(c-3
′
),61.7(c-5
′
)。鉴定化合物1为腺苷(adenosine)。
[0154]
2、化合物2
[0155][0156]
淡黄色油状物(甲醇)；esi-ms m/z:719[m+cl]-。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.02(1h,d,j＝8.4hz,h-5),6.98(1h,d,j＝8.4hz,h-5
′
),6.88(1h,d,j＝2.0hz,h-2),6.82(1h,d,j＝2.0hz,h-2
′
),6.78(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-6),6.68(1h,dd,j＝8.3,2.0hz,h-6
′
),4.87(1h,d,j＝7.0hz,h-1
″′
),4.85(1h,d,j＝7.2hz,h-1
″
),4.72(1h,d,j＝6.0hz,h-7),3.90(1h,m,h-9
′
b),3.74(6h,s,ome-3,3
′
),3.58(1h,m h-9
′
a),2.85(1h,dd,j＝13.4,4.7hz,h-7
′
b),2.62(1h,m,h-8
′
),2.46(1h,overlapped,h-7
′
a),2.20(1h,m,h-8)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:148.8(c-3),148.7(c-3
′
),145.5(c-4),144.8(c-4
′
),137.6(c-1),134.6(c-1
′
),120.3(c-6
′
),117.8(c-6),115.2(c-5
′
),115.0(c-5),113.0(c-2
′
),110.1(c-2),100.2(c-1
″
),100.1(c-1
″′
),81.6(c-7),77.0(c-5
″
,5
″′
),76.9(c-3
″
,3
″′
),73.2(c-2
″
,2
″′
),71.9(c-9
′
),69.7(c-4
″
,4
″′
),60.7(c-6
″
,6
″′
),58.6(c-9),55.6(-och3),55.6(-och3),52.5(c-8),41.8(c-8
′
),32.2(c-7
′
)。鉴定化合物2为落叶松树脂醇-4,4
′‑
二-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(lariciresinol-4,4
′‑
bis-o-β-d-glucopyranoside)。
[0157]
3、化合物3
[0158][0159]
淡黄色油状物(甲醇)；esi-ms m/z:557[m+cl]-,521[m-h]-。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.02(1h,d,j＝8.4hz,h-5),6.88(1h,j＝2.1,h-2),6.78(1h,dd,j＝8.4,2.1hz,h-6),6.74(1h,d,j＝2.0hz,h-2
′
),6.67(1h,d,j＝8.0hz,h-6
′
),6.57(1h,dd,j＝8.0,2.0hz,h-5
′
),4.87(1h,d,j＝7.0hz,glc-h-1),4.71(1h,d,j＝6.0hz,h-7),3.89(1h,m,h-9
′
a),3.75(3h,s,3-och3),3.74(3h,s,3
′‑
och3),3.66(1h,m,h-9a),3.57(1h,m,h-9
′
b),3.51(1h,overlapped,h-9b),2.80(1h,dd,j＝13.5,4.8hz,h-7
′
a),2.57(1h,m,h-8
′
),2.42(1h,m,h-7
′
b),2.19(1h,m,h-8)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:148.7(c-3),147.4(c-3
′
),145.5(c-4),144.6(c-4
′
),137.7(c-1),131.7(c-1
′
),120.6(c-6
′
),117.7(c-6),115.4(c-5
′
),115.0(c-5),112.7(c-2
′
),110.1(c-2),100.1(c-1
″
),81.6(c-7),77.0(c-5
″
),76.9(c-3
″
),73.2(c-2
″
),71.9(c-9
′
),69.7(c-4
″
),60.7(c-6
″
),58.6(c-9),55.6(-och3),55.5(-och3),52.5(c-8),41.9(c-8
′
),32.1(c-7
′
)。鉴定化合物3为落叶松树脂醇-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(lariciresinol-4-o-β-d-glucopyranoside)。
[0160]
4、化合物4
[0161][0162]
淡黄色油状物(甲醇)；esi-ms m/z:361[m-h]-。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.65(2h,s,4,4
′‑
oh),6.62(2h,overlapped,h-5,5
′
),6.62(2h,overlapped,h-2,2
′
),6.49(2h,dd,j＝8.0,2.0hz,h-6,6
′
),4.54(2h,brs,9,9
′‑
oh),3.67(6h,s,3,3
′‑
och3),3.37(4h,
overlapped,h-9,9
′
),2.52(4h,overlapped,h-7,7
′
),1.82(2h,m,h-8,8
′
)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:147.2(c-3,3
′
),144.3(c-4,4
′
),132.2(c-1,1
′
),121.1(c-6,6
′
),115.0(c-5,5
′
),112.9(c-2,2
′
),60.2(c-9,9
′
),55.4(3,3
′‑
och3),42.4(c-8,8
′
),33.9(c-7,7
′
)。鉴定化合物4为开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol)。
[0163]
5、化合物5
[0164][0165]
淡黄色油状物(甲醇)；esi-ms m/z:359[m-h]-。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.82(2h,overlapped,4,4
′‑
oh),6.82(1h,d,j＝1.8hz,h-2
′
),6.74(1h,d,j＝1.9hz,h-2),6.71(1h,br d,j＝8.0hz,h-6
′
),6.67(2h,d,j＝8.0hz,h-5,5
′
),6.57(1h,dd,j＝7.9,2.0hz,h-6),4.71(1h,br s,9
′‑
oh),4.64(1h,d,j＝6.3hz,h-7
′
),3.87(1h,dd,j＝8.2,6.5hz,h-9a),3.74(3h,s,3-och3),3.74(3h,s,3
′‑
och3),3.64(1h,d,j＝8.2hz,h-9
′
a),3.55(1h,dd,j＝8.2,6.5hz,h-9b),3.46(1h,overlapped,h-9
′
b),2.82(1h,dd,j＝13.4,4.7hz,h-7a),2.58(1h,m,h-8),2.41(1h,dd,j＝13.4,10.9hz,h-7b),2.18(1h,m,h-8
′
)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:147.4(c-3
′
),147.4(c-3),145.5(c-4
′
),144.6(c-4),134.7(c-1
′
),131.7(c-1),120.6(c-6),118.2(c-6
′
),115.4(c-5
′
),115.0(c-5),112.7(c-2),109.9(c-2
′
),81.8(c-7
′
),71.8(c-9),58.6(c-9
′
),55.6(3-och3),55.5(3
′‑
och3),52.4(c-8
′
),42.0(c-8),32.2(c-7)。鉴定化合物5为落叶松树脂醇(lariciresinol)。
[0166]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0167]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：获取川木通标准汤剂的提取物；将所述提取物进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；其中，第一次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；将fr.1进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；其中，第二次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从10％变化至100％；将fr.4进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；其中，第三次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至100％；将fr.1a进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；将fr.1b进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2；将fr.1c进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物3；将fr.4d进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5。2.根据权利要求1所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，所述川木通标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：将所述川木通标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩。3.根据权利要求1所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(6～10):(90～94)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。4.根据权利要求1所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(13～17):(83～87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。5.根据权利要求1所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(18～22):(78～82)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。6.根据权利要求1所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(28～32):(68～72)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。7.根据权利要求1～6任一项所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第一次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一流分fr.1、第二流分fr.2、第三流分fr.3与第四流分fr.4；其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流
动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。8.根据权利要求1～6任一项所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第二次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第一子流分fr.1a、第二子流分fr.1b、第三子流分fr.1c、第四子流分fr.1d、第五子流分fr.1e与第六子流分fr.1f；其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。9.根据权利要求1～6任一项所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第三次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备第七子流分fr.4a、第八子流分fr.4b、第九子流分fr.4c、第十子流分fr.4d、第十一子流分fr.4e与第十二子流分fr.4f；其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～5min，流动相a的体积百分数为3％；5min～20min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；20min～30min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；30min～60min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；检测波长为200nm～210nm。10.一种川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：获取如权利要求1～9任一项所述的川木通标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；所述化学成分包括所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4与化合物5中的一种或多种；将所述化学成分进行高效液相色谱与质谱联用测定；其中，所述高效液相色谱的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为水；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～0.5min，流动相a的体积百分数为3％；0.5min～3min，流动相a的体积百分数由3％变化至18％；3min～5min，流动相a的体积百分数由18％变化至22％；5min～12min，流动相a的体积百分数由22％变化至35％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.3ml/min～0.5ml/min；在200nm～400nm范围内进行全波扫描。11.根据权利要求10所述的川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，所述质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kv～0.9kv；锥孔电压为12v～18v；脱溶剂气温为420℃～480℃；离子源温度为120℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为8hz～12hz。12.根据权利要求10～11任一项所述的川木通标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，所述化合物1为腺苷；所述化合物2为落叶松树脂醇-4,4
′‑
二-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；
所述化合物3为落叶松树脂醇-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；所述化合物4为开环异落叶松树脂酚；所述化合物5为落叶松树脂醇。

技术总结
本发明提供了一种川木通标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：获取川木通标准汤剂的提取物；将提取物减压浓缩，然后进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备Fr.1～Fr.4；将Fr.1进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备Fr.1a～Fr.1f；将Fr.4进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备Fr.4a～Fr.4f；将Fr.1a进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；将Fr.1b进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2；将Fr.1c进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物3；将Fr.4d进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5。制备化合物4与化合物5。制备化合物4与化合物5。


技术研发人员：李振雨 陈向东 何民友 邓淙友 孙冬梅 吕渭升 段志文
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2023/7/21